Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Живая гриппозная вакцина (ЖГВ) 17
1.1. Основные этапы разработки живой аттенуированной вакцины против гриппа 18
1.2. Реассортантные ЖГВ и доноры аттенуации для их подготовки 20
1.3. Изучение молекулярных основ аттенуации вирусов гриппа 24
1.4. Вакцинопрофилактика гриппа с помощью реассортантной ЖГВ на основе холодоадаптированных донорских штаммов 32
ГЛАВА 2. Характеристика предпандемической ситуации 36
2.1. Кандидаты в пандемические штаммы 36
2.2. Особенности клинической картины при заражении людей высокопатогенными вирусами гриппа 41
2.3. Антигенная изменчивость вирусов A(H5N1) и способность к трансмиссии от человека к человеку 43
2.4. Роль отдельных генов в проявлении патогенности и расширении круга чувствительных хозяев вирусов гриппа А 45
2.5. Маркеры высокой патогенности вирусов птичьего гриппа на различных животных моделях 55
2.6. Оценка развития современной предпандемической ситуации и возможные меры и средства профилактики 61
ГЛАВА 3. Разработка вакциіі против пандемически опасных вирусов гриппа 68
3.1. Разработка инактивированных вакцин против вирусов гриппа, обладающих пандемическим потенциалом 68
3.2. Разработка ЖГВ при подготовке к пандемии 80
3.3. Основные требования, предъявляемые к гриппозным вакцинам при подготовке к пандемии и пути усовершенствования вакцинных препаратов 83
Заключение 99
Собственные исследования
Глава 4. Материалы и методы 102
4.1. Вирусологические методы 102
4.2. Методы работы с хорьками 106
4.3. Методы работы с мышами 107
4.4. Клиническое изучение безвредности и эффективности ЖГВ, содержащей реассортантные вакцинные штаммы на основе холодоадаптированных доноров аттенуации 110
4.5. Статистическая обработка данных 113
ГЛАВА 5. Изучение молекулярных основ аттенуации холодоадаптированных штаммов вирусов гриппа А И В 114
5.1. Изучение биологических свойств штамма подтипа A(H2N2) -
А/Москва/21/17/65 114
5.2. Молекулярно-генетический анализ холодоадаптированного штамма A/MocKBa/21/17/65(H2N2) 122
5.3. Сравнительный анализ различных холодоадаптированных вирусов подтипа A(H2N2) 130
5.4. Изучение свойств полигенных реассортантов на основе штамма A/MocKBa/21/17/65(H2N2) 133
5.5. Характеристика донора аттенуации для компонента В тривалентной живой гриппозной вакцины - В/СССР/60/69 137
5.5.1. Молекулярно-генетический анализ и рестриктазное картирование
донора аттенуации В/СССР/60/69 137
5.5.2. Изучение свойств холодоадаптации и аттенуации для
хорьков 146
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 149
ГЛАВА 6. Подготовка реассортантов птичьих вирусов на основе донора аттенуации а/ленинград/134/17/57(Н2Ы2) 151
6.1. Характеристика вирусов птичьего гриппа, использованных в качестве источника поверхностных антигенов 151
6.2. Реассортация и определение состава генома реассортантов 152
6.3. Ростовые характеристики реассортантов птичьих вирусов на основе штамма А/Ленинград/134/17/57(Н2К2) при различных температурах инкубации в куриных эмбрионах 154
6.4. Оценка безвредности холодоадаптированных реассортантов, содержащих гены вирусов гриппа птиц, при введении курам 156
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 159
ГЛАВА 7. Результаты доклинического изучения кандидата в вакцинные штаммы ЖГВ А17/УТКА/ПОТСДАМ/86/92(Н5Ш) 160
7.1. Молекулярно-генетический анализ гемагглютинина и антигенные свойства реассортантного штамма А17/Утка/Потсдам/86/92(Н5№) 160
7.2. Изучение генетической стабильности реассортантного штамма A(H5N2) после пассажей в носовых ходах хорька 166
7.3. Безвредность кандидата в вакцинные штаммы подтипа A(H5N2) при интраназальном введении мышам 167
7.4. Сравнительное изучение иммуногенности при введении ЖГВ и ИГВ подтипа A(H5N2) белым мышам 169
7.5. Эффективность ЖГВ и ИГВ подтипа A(H5N2) против инфекции вирусами A(H5N1), выделенными в 1997 и 2003 гг. в Гонконге 174
7.6. Оценка эффективности реассортанта А17/Утка/Потсдам/86/92
(H5N2) против реинфекции вирусом A(H5N1), выделенным в 2004 году о время вспышки во Вьетнаме 176
7.7. Защита против реинфекции антигенным вариантом вируса A(H5N1), выделенным в 2005 году на территории Российской Федерации 180
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 188
ГЛАВА 8. Результаты доклинического изучения кандидата в вакцинные штаммы ЖГВ A(H7N3) 189
8.1. Молекулярно-генетический анализ гемагглютинина 189
8.2. Антигенная специфичность 193
8.3. Показатели репродукции в РКЭ 193
8.4. Взучение прививочныех свойств кандидата в вакцинные штаммы A(H7N3) на модели белых мышей BALB/c 197
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 200
ГЛАВА 9. Клиническое изучение безвредности и иммуногенности живой гриппозной вакцины A(H5N2) -Штамм А/17/Утка/Потсдам/86/92(Н5Ы2) 201
9.1. Организация исследования 201
9.2. Результаты 206
9.2.1. Безвредность и реактогенность 206
9.2.2. Выделение и анализ реизолятов вакцинного штамма от привитых 210
9.2.3. Иммуногенность 212
Заключение 223
Глава 10. Стратегия и тактика вакцинопрофилактики с использованием жгв в интерпандемический период и при подготовке к пандемии 224
10.1. Вакцинопрофилактика с использованием ЖГВ среди лиц высокого риска 224
10.2. Вакцинация детей дошкольного возраста ЖГВ для взрослых в качестве единого препарата для взрослых и детей 239
10.3. Экспериментальное изучение прививочных свойств реассортантного штамма А/17/Утка/Потсдам/86/92(Н5Ы2) в составе поливалентной вакцины, включающей реассортантные штаммы современных эпидемических вирусов A(H1N1), A(H3N2) и В 256
10.4. Изучение на на экспериментальной модели прививочных свойств ЖГВ подтипа A(H5N2) при сочетанной вакцинации с ИГВ 263
Заключение 268
Глава 11. Обсуждение полученных результатов 270
Выводы 293
Список литературы
- Реассортантные ЖГВ и доноры аттенуации для их подготовки
- Антигенная изменчивость вирусов A(H5N1) и способность к трансмиссии от человека к человеку
- Основные требования, предъявляемые к гриппозным вакцинам при подготовке к пандемии и пути усовершенствования вакцинных препаратов
- Клиническое изучение безвредности и эффективности ЖГВ, содержащей реассортантные вакцинные штаммы на основе холодоадаптированных доноров аттенуации
Введение к работе
Актуальность проблемы. Грипп является глобальной инфекцией, которая в период сезонных эпидемий поражает от 10 до 20% населения планеты, а также единственной, способной вызвать в современном мире пандемии. До настоящего времени было известно 3 подтипа вируса гриппа, вызвавшие пандемии: А(НШ1) - в 1918 г., A(H2N2) - в 1957 г., A(H3N2) - в 1968 г. Начиная с 1997 г. высокопатогенные (ВП) вирусы гриппа подтипа A(H5N1), циркулирующие среди дикой и домашней птицы в Юго-восточной Азии и других регионах мира, вызвали заболевание более 380 человек с более, чем 60% смертностью. Анализ вирусов гриппа A(H5N1), выделенных как от людей, так и от птиц показал, что за последние 7-8 лет вирусы данного подтипа разделились на несколько линий, существенно отличающихся между собой как антигенно, так и генетически [140, 208, 209, 459]. Клиническая картина при инфекции людей вирусами A(H5N1) характеризуется тяжестью клинических симптомов, связанных с проявлениями острой дыхательной и сердечнососудистой недостаточности, признаками гепатита и тяжелой лимфопении [449]. Дикие перелетные, особенно водоплавающие птицы являются одновременно природным резервуаром и переносчиком инфекции из стран Юго-восточной Азии в другие регионы [303, 458]. Начиная с 2006 г., помимо Азии возбудитель распространился на территорию Европы, Северной и Центральной частей Африки. Не осталась незатронутой и территория России [13, 53, 54, 64]. Несмотря на то, что до сих пор не было получено убедительных данных об устойчивой передаче вируса A(H5N1) от человека к человеку [130, 247, 448], что ознаменовало бы начало новой пандемии, продолжающееся заражение людей создает угрозу возникновения пандемической ситуации [209, 459, 468]. В настоящее время ситуация по гриппу в мире оценивается Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) как «Период угрозы пандемии, фаза 3» [468], для которого характерно выявление случаев заражения людей новыми подтипами вируса, но при этом отсутствует устойчивая трансмиссия вируса от человека к человеку.
В качестве потенциального источника нового пандемического штамма рассматриваются также вирусы птичьего гриппа других подтипов, способные передаваться людям: A(H9N2), A(H7N7). Опыт появления пандемий не исключает также возврата в циркуляцию вирусов человека A(H2N2), который вызвал пандемию в 1957 году. В практике уже имеется пример возвращения ранее циркулирующих штаммов, как это было в 1977 г. с вирусом гриппа A(H1N1) [277]. Значительная часть населения нашей страны не встречалась с вирусом A(H2N2) и не имеет иммунитета к нему, однако вирусы этого подтипа продолжают циркулировать в популяциях животных (птиц, свиней), что увеличивает риск заболевания людей. В США в 2006 году от свиней с бронхопневмонией были выделены вирусы A(H2N3) [296]. Молекулярный анализ гемагглютинина и нейраминидазы вирусов A(H2N3) показал, что они имеют птичье происхождение, но оба вируса уже приобрели признаки, характерные для вирусов млекопитающих.
В настоящий момент неизвестно, какой подтип вируса гриппа может вызвать следующую пандемию, но необходимость срочной разработки эффективных мер и средств защиты человека от пандемии признается специалистами всего мира. Активная иммунизация общепризнанно считается наиболее эффективным медицинским средством профилактики вирусных инфекций. Опыт ликвидации наиболее опасных вирусных инфекций позволяет заключить, что только использование живых вакцин обеспечивает необходимую эпидемическую эффективность и результативность противоэпидемических мероприятий. На заседаниях ВОЗ 04.11.05 и 2.05-5.05.2006, посвященных разработке плана активных действий на пандемический период, живая гриппозная вакцина включена в план предпандемической подготовки наряду с инактивированными вакцинами как средство профилактики пандемического гриппа [471].
Современные живые гриппозные вакцины (ЖГВ) включают аттенуированные реассортантные штаммы вирусов гриппа, имеющие смешанный геном: гены, кодирующие гемагглютинин (НА) и нейраминидазу
(NA), наследуются от антигенно актуального штамма, а шесть генов, кодирующих негликозилированные белки - от холодоадаптированного (ХА) «донора аттенуации». В России в течение многих лет вакцинные штаммы вируса гриппа А, включаемые в состав ЖГВ для взрослых, подготавливают на основе ХА донорского штамма подтипа H2N2 - А/Ленинград/134/17/57 [2, 4], полученного путем последовательных пассажей в куриных эмбрионах при пониженной до 25-26С температуре. Для создания рекомбинантных штаммов ЖГВ для детей 3-14 лет был подготовлен дополнительно аттенуированный 30-кратным пассированием при низкой температуре донор аттенуации А/Ленинград/134/47/57(Н2Ы2) [22, 29]. Изучение полной последовательности нуклеотидов, кодирующих негликозилированные белки доноров аттенуации А/Ленинград/134/17/57 и А/Ленинград/134/47/57, выявило ряд мутаций, ответственных за проявление ими признаков температурочувствительности, холодовой адаптации и аттенуации [271, 272]. В отличие от ЖГВ для взрослых, вводимой однократно, детский вариант ЖГВ применялся при двукратном введении с интервалом в 4 недели. Для подготовки реассортантных вакцинных штаммов вирусов гриппа В, включаемых в состав тривакцины, используется донор аттенуации В/СССР/60/69 [1, 100].
Многолетнее изучение реассортантной ЖГВ подтвердили ее безвредность и эффективность [3, 8-11, 36, 76, 102, 103, 262, 382, 383]. В ряде клинических испытаний, проведенных как в России, так и за рубежом, было показано, что применение ЖГВ вызывает выраженную стимуляцию всех систем иммунного ответа (гуморального, локального, клеточного), включая сывороточные антитела, секреторные IgA, цитотоксические CD8+ Т-лимфоциты [30-32, 60-63, 154, 225, 244, 380], обеспечивая формирование широкого спектра иммунитета против дрейфовых вариантов вирусов гриппа. Стимуляция неспецифических факторов иммунитета (интерферон, NK-клетки) обусловливает эффективность ЖГВ с первых дней применения [28]. Создаваемый при применении ЖГВ уровень коллективного иммунитета, как показали исследования среди детей школьного возраста, играет значительную роль в ограничении распространения
инфекции в обществе [258, 318, 383]. Результаты целого ряда исследований свидетельствуют о генетической стабильности применяемых в настоящее время ХА донорских штаммов и реассортантов на их основе [25, 45, 57, 138, 273, 274].
Существенным практическим преимуществом использования ЖГВ является интраназальный (физиологический) путь введения в виде назального спрея. При этом стоимость живой вакцины, обусловленная особенностями технологического процесса, не требующего концентрации вирусного материала, в несколько раз меньше инактивированной. В случае возникновения пандемической ситуации повышение потребности в количестве доз инактивированной вакцины с учетом необходимости двукратной иммунизации, обусловленной отсутствием у людей предшествующего иммунитета к новому вирусу, может привести к недостатку производственных мощностей предприятий, производящих вакцину. В этом случае применение ЖГВ может значительно увеличить охват прививками.
К настоящему времени в России накоплен значительный опыт применения ХА реассортантной ЖГВ в практике здравоохранения, тем не менее, ряд теоретических и практических вопросов все еще оставался нерешенным.
Несмотря на то, что доноры аттенуации, применяемые для подготовки реассортантов вирусов гриппа А, входящих в состав поливалентной ЖГВ -А/Ленинград/134/47/57(Н2К2) (Россия) и А/Энн Арбор/6/60(США) - подробно охарактеризованы (определены основные мутации в их геноме, изучена роль отдельных генов, ответственных за проявление свойств аттенуации) [153, 272], не были определены мутации, ответственные за холодовую адаптацию вирусов гриппа, полученных в процессе пассирования при пониженной температуре. Не были проведены полное секвенирование и молекулярно-генетический анализ донора аттенуации вирусов гриппа В В/СССР/60/69. Анализ реассортантов на основе В/СССР/60/69 проводился методами, требовавшими использования больших количеств концентрированного вирусного материала, что затрудняло проведение множественных исследований.
Не была разработана методика получения и оценки кандидатов в вакцинные штаммы ЖГВ для применения в случае пандемии, вызванной вирусом нового, не циркулирующего в настоящий момент подтипа.
До начала выполнения данной работы ЖГВ применялась для вакцинации лиц не старше 65 лет, а специфическая профилактика гриппа среди лиц пожилого возраста в России не проводилась вообще.
До проведения настоящих исследований в России применялись два варианта ЖГВ - детский и взрослый, при этом использование для детского варианта ЖГВ специального донора аттенуации приводило к удорожанию производства вакцины. Необходимость двукратного введения детского варианта вакцины при вакцинации детей от 3-х лет затрудняло проведение вакцинопрофилактики в предэпидемический период, а также усложняло выполнение календаря плановых прививок против других инфекций.
Целью настоящей работы являлась разработка теоретических и научно-практических основ для создания, оценки и применения живой гриппозной вакцины против пандемически опасных вирусов гриппа.
Задачи исследования:
Молекулярно-генетический анализ и сравнительная оценка на чувствительных системах и моделях гриппозной инфекции (куриные эмбрионы, культура клеток MDCK, мыши, хорьки) безвредных для человека ХА штаммов вирусов гриппа А и В, полученных последовательным пассированием при пониженной температуре.
Характеристика фенотипических и генотипических свойств ХА штамма А/Москва/21/17/65(Н2Ы2) для применения в качестве нового донора аттенуации или вакцинного штамма в случае возвращения в циркуляцию вирусов этого подтипа.
Секвенирование донора аттенуации В/СССР/60/69 и модификация метода рестрикционного анализа применительно к реассортантам на его основе для производства поливалентной ЖГВ.
Подготовка, характеристика и доклиническое исследование высокопродуктивных реассортантных штаммов на основе ХА донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2Н2) с потенциально пандемическими вирусами гриппа различных подтипов вирусов гриппа: Н5, Н7, Н9.
Оценка в ограниченных клинических испытаниях безвредности, генетической стабильности и иммуногешюсти ЖГВ, разработанной с использованием модельного апатогенного птичьего вируса подтипа A(H5N2).
Разработка оптимальной стратегии и тактики вакцинации с использованием ЖГВ в интерпандемический период и при подготовке к пандемии.
Научная новизна. Автором впервые применен реассортантный метод к созданию вакцинных штаммов «шифтовых» вариантов вирусов гриппа на основе отечественного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2) с использованием апатогенных вирусов гриппа птиц, что отражено в заявке на изобретение 118284 Al (WO, 2007). Впервые определены условия и закономерности получения и апробации холодоадаптированных штаммов вирусов гриппа потенциально пандемических подтипов - Н5, Н7 и Н9.
Автором впервые разработана экспериментальная модель для
доклинического изучения прививочных свойств холодоадаптированных
реассортантных штаммов потенциально пандемических подтипов. В
доклиническом и клиническом изучении впервые исследована роль различных
серологических тестов (РТГА, реакция микронейтрализации,
иммуноферментный анализ) в оценке иммунологической эффективности ЖГВ подтипа Н5. На экспериментальной модели впервые теоретически обоснованы схемы иммунизации живой гриппозной вакциной из реассортантного штамма A(H5N2).
Впервые проведенное определение нуклеотидной последовательности и молекулярно-генетический анализ штаммов A/MocKBa/21/17/65(H2N2) и В/СССР/60/69 и позволили обосновать их применение в качестве доноров аттенуации для получения реассортантных вакцинных штаммов. Результаты секвенирования и рестриктазного картирования, выявившие целый ряд
уникальных нуклеотидных замен в генах негликозилированных белков донора аттенуации В/СССР/60/69, указывают на единый генетический характер обеспечения холодовой адаптации вирусов гриппа А и В.
Теоретическая значимость проведенных исследований. Впервые разработана концепция создания реассортантной ЖГВ против вирусов гриппа, обладающих пандемическим потенциалом. Эта концепция основана на экспериментальных доказательствах безвредности, иммуногенности и протективной эффективности холодоадаптированных реассортантных штаммов, содержащих поверхностные антигены апатогенных птичьих вирусов, а также подтверждена данными о репродукции реассортантного штамма A(H5N2) в носоглотке человека с формированием гуморальных и секреторных антител не только к вакцинному штамму, но и к высокопатогенным вирусам птичьего гриппа A(H5N1).
Получены новые фундаментальные данные о механизмах холодовой адаптации вирусов гриппа. Установлена связь изменений полимеразной субъединицы РВ2 с реализацией функции холодовой адаптации штамма А/Москва/21/17/65(H2N2).
Практическая значимость. Работа имеет большое народнохозяйственное значение. В результате ее выполнения автором создана уникальная коллекция холодоадаптированных реассортантов потенциально пандемических подтипов вирусов гриппа A(H5N2), A(H7N3) и A(H9N2), которые депонированы в Государственной коллекции вирусов института вирусологии имени Д.И. Ивановского. Эти штаммы могут быть использованы для быстрой наработки вирусного материала при производстве пандемической ЖГВ, что является одним из направлений международной стратегии подготовки к пандемии.
Данные доклинических испытаний реассортантного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Ы2) позволили разработать и утвердить программы 1 и 2 фазы клинических испытаний экспериментальной серии ЖГВ подтипа A(H5N2) «Орвакс», производства ФГУП НПО «Микроген» с целью создания
модели для клинического изучения ЖГВ подтипа Н5. Суммарные данные доклинического и клинического изучения безвредности, иммуногенности и эффективности реассортантного штамма на основе апатогенного птичьего вируса гриппа A(H5N2) позволили разработать основы для апробации ЖГВ потенциально пандемического подтипа Н5.
На основании результатов клинических испытаний тривалентная ЖГВ, включающая реассортантные штаммы на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2), рекомендована для профилактики гриппа среди детей с трех лет и пожилых людей, страдающих хроническими заболеваниями. Таким образом, были расширены контингенты для применения ЖГВ как единого препарата с включением наиболее уязвимых групп (детей дошкольного возраста и пожилых, хронически больных людей) что в случае пандемии позволяет обеспечить наибольший охват прививками всех групп и категорий населения.
Разработанные автором реассортантные вакцинные штаммы современных эпидемических вирусов В/60/Йоханнесбург/99/50, А/17Жалифорния/04/71 (H3N2), А/17/Висконсин/05/84(НЗЫ2) использовались для производства ЖГВ, на их основе подготовлено 5 млн. доз вакцины.
Анализ нуклеотидной последовательности донора аттенуации
В/СССР/60/69 и модификация ОТ-ПЦР рестрикционного анализа впервые
позволили выполнять этим методом идентификацию внутренних и
неструктурных белков реассортантных вакцинных штаммов вирусов гриппа В.
Положения, выносимые на защиту.
1. Холодовая адаптация штамма A/MocKBa/21/17/65(H2N2) связана с
появлением в процессе пассирования при пониженной температуре
множественных нуклеотидных замен в гене РВ2, приводящих к изменениям в
структуре соответствующей полимеразной субъединицы. Свойства холодовой
адаптации, аттенуации и генетической стабильности, присущие штамму
A/MocKBa/21/17/65(H2N2), позволяют использовать его не только в качестве
самостоятельного вакцинного штамма для иммунизации населения в случае
возвращения в циркуляцию вируса гриппа A(H2N2), но и как потенциально новый донор аттенуации.
Методы классической генетической реассортации в куриных эмбрионах позволяют регулярно получать высокоурожайные реассортантные штаммы на основе ХА донора аттенуации А/ Ленинград/134/17/57(H2N2) с использованием в качестве источника поверхностных антигенов апатогенных вирусов гриппа птиц потенциально пандемических подтипов.
Реассортантные штаммы апатогенных птичьих вирусов на основе донора А/Ленинград/134/17/57(Н2Н2) проявляют свойства температурочувствительности, холодовой адаптации и аттенуации в различных чувствительных моделях. Высокая степень аттенуации ХА реассортантов птичьих вирусов для кур, вплоть до полной неспособности к репродукции, свидетельствует о безопасности для птичьих хозяйств производства и использования подобных штаммов.
Использование ЖГВ может быть эффективным против высокопатогенных вирусов гриппа даже в случае неполного антигенного соответствия между вакцинным вирусом и инфекционным штаммом (экспериментальная модель). Тем не менее, вакцинация штаммом нового подтипа до наступления пандемии является нецелесообразной, так как в настоящее время неизвестен вирус, который вызовет пандемию.
Прототип ЖГВ «Орвакс» подтипа A(H5N2) является безвредным, генетически стабильным препаратом и способен к репродукции в носоглотке человека. При оценке иммуногенности ЖГВ подтипа Н5 показано, что сочетанное применение реакции торможения гемагглютинации и теста микронейтрализации в наибольшей степени удовлетворяет критериям чувствительности и специфичности (клиническое изучение).
6. Реассортантная ЖГВ на основе доноров аттенуации
А/Ленинград/134/17/57(Н2Н2) и В/СССР/60/69 является безвредной и
эффективной для всех групп населения, включая детей от 3-х лет и пожилых
людей старше 65 лет, страдающих хроническими заболеваниями (клиническое изучение).
7. В случае появления нового пандемического штамма рекомендуется проведение двукратной прививки соответствующей моновакциной. Включение штамма нового антигенного подтипа в состав поливалентной живой гриппозной вакцины является нецелесообразным, так как его иммуногенность при этом снижается (экспериментальные данные).
Внедрение результатов работы. По теме работы получено 4 патента на изобретения. Подана 1 заявка на патент. Подготовлены методические рекомендации «Вакцинопрофилактика гриппа с помощью живой гриппозной вакцины среди лиц пожилого возраста». Внесены изменения в Фармакопейную Статью на «Вакцину гриппозную аллантоисную интраназальную живую сухую» ФСП 42-0504-4097-04.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на 4-й Международной конференции по проблемам гриппа (Крит, Греция, 2000), 1-й и 2-й Европейских конференциях по проблемам гриппа (Мальта, 2002, 2005), 2-м Международном симпозиуме по проблемам респираторных инфекций (Ла Романа, Доминиканская Республика, 2002), 2-й Международной конференции по ортомиксовирусам (Нью-Джерси, США, 2003), 5-й Международной конференции по проблемам гриппа (Окинава, Япония, 2003), 1-й Международной конференции по вирусным вакцинам (Лиссабон, Португалия, 2004), Первой всероссийской конференции «Вакцинология 04» (Москва, 2004), VIII и IX Всероссийских научных Форумах с международным участием имени академика В. И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004, 2005), Международной научной конференции «Актуальные вирусные инфекции - теоретические и практические аспекты» (Санкт-Петербург, 2004), 4-й Международной конференции по проблемам птичьего гриппа (Лондон, Великобритания, 2006), 2-й Международной конференции по вирусным вакцинам (Вена, Австрия, 2006). 6-й Международной конференции по проблемам гриппа (Торонто,
16 Канада, 2007), Заседании ВОЗ по вопросам подготовки к пандемии (Женева, Швейцария, 2007), 3-й Европейской конференции по проблемам гриппа (Виламоура, Португалия, 2008). Материалы работы также представлялись и обсуждались на заседаниях Отдела вирусологии НИИЭМ РАМН (2004 г., 2005 г.) и Центра по контролю заболеваемости США, Атланта, США (2001 г., 2004 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 77 печатных работ, в том числе 29 статей (20 - в журналах, рекомендованных ВАК), 4 патента РФ, 1 научный обзор и 43 тезиса докладов общим объемом более 200 страниц.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 328 страницах текста, включая 61 таблицу и 20 рисунков; состоит из введения, трех глав обзора литературы, семи глав собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы, который содержит 485 источников, из них 98 отечественных и 387 - иностранных.
Личный вклад автора. Тема и план диссертации, ее основные идеи и содержание разработаны автором на основании многолетних (1998-2007 г.г.) исследований. Реассортантные штаммы апатогенных вирусов гриппа птиц A(H5N2), A(H7N3) и A(H9N2), а также реассортанты эпидемических вирусов гриппа А и В, подготовленные на основе ХА штаммов A/MocKBa/21/17/65(H2N2) и В/СССР/60/69, получены, проанализированы и апробированы в доклинических исследованиях на животных (мыши, хорьки) лично автором. Автор принимала личное участие в клинических исследованиях в домах престарелых и детских садах Санкт-Петербурга и Ленинградской области, а также на базе Военного госпиталя № 1137. Во всех совместных исследованиях по теме диссертации, наряду с личным участием в их проведении, автору принадлежит участие в разработке программы исследований, а также анализ полученных данных. Все материалы, использованные в диссертационной работе, проанализированы и обобщены лично автором.
Реассортантные ЖГВ и доноры аттенуации для их подготовки
Первые реассортантные вакцинные штаммы были получены в Англии на основе лабораторного штамма A/PR/8/34, который является /w-мутантом, поскольку история его культивирования насчитывает более 1000 пассажей в различных системах. В процессе пассажей вирус A/PR/8/34 утратил болезнетворность для человека, но остался патогенным для белых мышей. Рекомбинация проводилась в куриных эмбрионах с эпидемическими вирусами A(H3N2), выделенными в 70-е годы [139]. Хотя клинические наблюдения показали широкую вариабельность реактогенных свойств реассортантов для человека, отдельные клоны удовлетворяли основным требованиям к кандидатам в вакцинные штаммы ЖГВ: они были ареактогенными для человека и индуцировали выработку противогриппозных антител. Указанное наблюдение послужило стимулом к широкому изучению вакцины из рекомбинантного штамма МРС-2 ("Alice"), полученного при скрещивании вирусов А/Англия/42/72(НЗШ) и A/PR/8/34 [114]. Несмотря на то, что в ряде клинических испытаний, проведенных в Англии, Австрии и США, была показана ареактогенность и иммуногенность вакцины "Alice", ряд клонов, полученных при реассортации, оказались высоковирулентными, что не коррелировало со свойствами авирулентного родителя. Трудности в отборе аттенуированных реассортантов при скрещивании штамма A/PR/8/34, обусловленных точно неизвестной историей его культивирования, сохранением реактогенности для людей его реассортантами, отсутствием лабораторных маркеров для отбора и контроля кандидатов в вакцинные штаммы, привели к отказу от его использования в качестве донора аттенуации. Сейчас он используется только для подготовки высокоурожайных вакцинных штаммов для производства ИГВ.
Американскими исследователями Chanock R.M. и Murphy B.R. предпринимались также попытки использования температурочувствительных (ts ) мутантов для получения реассортантных ЖГВ [139, 322]. Для этих целей использовались ts -мутанты, полученные методом направленного мутагенеза, и имеющие мутации в генах полимеразного комплекса и NP. Однако исследования показали неполную аттенуацию и генетическую стабильность этих вирусов, ревертирующих к дикому типу при размножении в дыхательных путях восприимчивых лиц, как это было показано для реассортантов эпидемических вирусов A(H3N2), содержащих РВ2 и РА гены te-мутанга А/Удорн/72 1А2 [437]. В работе Л.А Зазимко показана опасность применения в качестве доноров аттенуации вирусов гриппа, пассированных при оптимальной температуре, поскольку изменения в генах, кодирующих их внутренние белки, являются недостаточными для передачи реассортантам авирулентности для человека. Так, было показано усиление вирулентности, превосходящее таковую для родительских штаммов, при реассортации эпидемического вируса А/Бразилия/11/78(НШ1) с пассажым /zr-мутантом А/Ленинград/9/46(НШ1) [39].
Избежать недостатков, присущих hr- и Is — донорам удалось только с началом применения ХА штаммов вирусов гриппа. Начиная с 1977 г. в нашей стране накоплен большой опыт конструирования и внедрения в практику здравоохранения реассортантных штаммов на основе ХА доноров аттенуации [6, 35, 67, 102, 360]. ЖГВ для взрослых получали на основе ХА вируса А/Ленинград/134/17/57(H2N2) [3], а детский вариант - на основе вируса А/Ленинград/134/47/57(H2N2) [22, 29]. В США для этих целей используют ХА вирус А/Энн Арбор/6/60 [298]. Различия между донорским штаммом А/Ленинград/13 4/17/57 и американским донором аттенуации А/ Энн Арбор/6/60, недавно лицензированным в США для производства ЖГВ, заключаются как в общем количестве пассажей, включая пассажи при пониженной температуре, так и клеточной модели, на которой осуществлялось пассирование. Так, для штамма А/Ленинград/134/17/57(Н2Ы2) это были РКЭ, а для А/Энн Арбор — преимущественно культура ткани (первичная культура почки цыпленка) [3].
Изучение полной последовательности нуклеотидов шести генов, кодирующих негликозилированные белки ХА донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2Ы2), выявило 10 нуклеотидных замен по сравнению с «диким» вариантом А/Ленинград/134/57(H2N2), 8 из которых являются кодирующими. Эти мутации привели к аминокислотным заменам в белках РВ1, РА (по две), РВ2, Ml, М2, NS2 (по одной). Все указанные мутации сохранились и в геноме прошедшего 30 дополнительных пассажей при пониженной температуре дополнительно аттенуированного штамма
А/Ленинград/13 4/47/5 7(H2N2), использовавшегося при подготовке реассортантных вакцинных штаммов детского варианта ЖГВ, который при этом приобрел еще 4 мутации, 3 из которых являются значащими [52, 189, 272]. Таким образом, в шести «внутренних» генах донора А/Ленинград/134/47/57 всего выявлено 14 нуклеотидных замен, 11 из которых приводят к заменам аминокислот в белках РВ1 (три), РВ2, РА (по две), NP, Ml, М2 и NS2 (по одной).
Антигенная изменчивость вирусов A(H5N1) и способность к трансмиссии от человека к человеку
С 1997 по 2001 г. гемагглютинин ВП вирусов подтипа Н5 оставался антигенно стабильным. Однако начиная с 2002 года, были отмечены дрейфовые изменения НА, которые усилились к 2004 году. Начиная с 2003 года, наблюдается необычайно высокий уровень эволюции вирусов A(H5N1). Анализ показал разделение высокопатогенных вирусов A(H5N1), выделенных у домашней птицы и человека, на 3 ветви, отличающиеся между собой как антигенно, так и генетически [51, 140, 235]. К первой относятся вирусы, выделенные в 2003-2004 году во время вспышки в Юго-восточной Азии. Вторая генетическая ветвь, которая в настоящее время является доминирующей, подразделяется в свою очередь на 6 подгрупп, три из которых (1, 2, 3) различались по географической локализации и представлены штаммами, вызвавшими заболевания людей в Индонезии в 2004-2005 гг. (1-я подгруппа), в Монголии, Турции (2-й подгруппа). К этой подгруппе также относятся изоляты, выделенные во время вспышки среди диких птиц в Южном Китае на озере Цинхай. 3-я подгруппа представлена более поздними изолятами 2005-2006 года, выделенными в Китайской провинции Анжу, Гонконге и Японии. И, наконец, третья ветвь представлена вирусами, выделенными во время вспышки 1997 года в Гонконге. Обращает на себя внимание, что ряд высокопатогенных вирусов A(H5N1) был выделен от диких водоплавающих птиц, как это случилось во время вспышки в 2005 году на озере Цинхай, что может свидетельствовать о наличии обратного заноса подобных вирусов от домашних птиц к диким, чего ранее не наблюдалось [43, 140, 468].
Начиная с середины 2005 года вспышки высокопатогенного птичьего гриппа, вызванного вирусами A(H5N1), были зарегистрированы на территории России и стран ближнего зарубежья, а также в ряде стран Европы и Африки [13, 53, 54, 91]. При этом наблюдались случаи инфицирования людей, вызванные вирусами 1-й и 2-й антигенных линий, которые сопровождались высокой смертностью [140].
Необходимо отметить, что до сих пор во всех случаях инфицирования людей птичьими вирусами не было прямых доказательств устойчивой передачи вируса A(H5N1) от человека к человеку [130, 247, 394]. Тем не менее, во время ликвидации последствий вспышки в Гонконге в 1997 г. антитела к вирусам Н5 были обнаружены у 3% лиц, привлеченных к уничтожению поголовья кур, 17% работников птицеферм, 3,7%) медиков, имеющих контакт с вирусами Н5 и у 0,7%) - не имеющих такого контакта [130].
В условиях постоянного появления высокопатогенных вирусов A(H5N1) в человеческой популяции трудно исключить возможность возникновения такой передачи при близких контактах [220]. Так, во время вспышки высокопатогенного гриппа A(H5N1) в 2004 году в Таиланде зарегистрирован случай семейного заболевания, когда предположительно от больной девочки могли заразиться ее тетя и мать, которая впоследствии скончалась, как и сама девочка [448]. Если у взрослых инфекция гриппом A(H5N1) была подтверждена вирусологически и серологически, то заболевание ребенка было диагностировано по клиническим проявлениям и посмертным изменениям, что является одной из причин, не позволяющих сделать заключение о 100% вероятности заражения взрослых от больного ребенка, поскольку также не исключена возможность их контакта с больной птицей.
Ранее считалось, что вирусы птичьего гриппа неспособны передаваться от птиц непосредственно людям. Какие же причины приводят к заболеванию людей птичьим гриппом? Большинство птичьих вирусов являются исходно маловирулентными, вызывая у диких водоплавающих птиц транзиторные бессимптомные инфекции [461]. Вирусы подтипов Н5 и Н7, которые часто выделяют от перелетных птиц, попадая в домашние хозяйства, могут получать широкое распространение среди домашней птицы, приобретая при этом свойства повышенной патогенности в результате дополнительной адаптации и рекомбинационного процесса, как было показано во время вспышек, вызванных вирусами подтипа Н5 в 1983 и 1994-95 годах в Северной Америке [185, 253, 460], подтипа Н7 - в Европе и в Австралии [107, 279, 396]. Впервые «чума птиц», заболевание, вызванное (как теперь известно) высокопатогенными вирусами гриппа, была описана в 1878 г во время вспышки среди кур в Италии. Возбудитель был выделен в 1902 г. (вирус A/Chicken/Brescia/1902(H7N7)). Во время похожих вспышек, неоднократно наблюдавшихся в Европе и по всему миру, было выделено еще несколько вирусов подтипа Н7. В 1955 г. была установлена их принадлежность к группе вирусов гриппа [458]. Первый из высокопатогенных (ВП) вирусов подтипа H5N3 A/Tern/South Africa/61 был выделен в 1961 г. [116]. Высокопатогенные (ВП) штаммы способны за короткое время вызвать массовую гибель кур в результате диссеминации инфекции, протекающей у домашней птицы с быстро прогрессирующими неврологическими симптомами, диареей и смертельным исходом [13]. Ниже будут рассмотрены факторы, приводящие к повышению вирулентости вирусов гриппа.
Основные требования, предъявляемые к гриппозным вакцинам при подготовке к пандемии и пути усовершенствования вакцинных препаратов
Что касается требований, предъявляемых к гриппозным вакцинам, то независимо от вида антигена, это в первую очередь безвредность, иммуногенность, эффективность и доступность. В соответствии с классификацией, принятой Комитетом вакцин и сывороток Минздрава РФ: реакция отсутствует - при температуре 37,0С; слабая реакция — с повышением температуры тела до 37,5С; средняя реакция — с температурой 37,6-38,5С; сильная реакция - с повышением температуры выше 38,6С. Показатели реактогенности ЖГВ регламентированы фармакопейной статьей. Допускается наличие реакций с повышением температуры тела выше 37,5С не более, чем у 3% привитых. Продолжительность температурной реакции не должна превышать 3 суток.
Европейским комитетом по контролю медицинских препаратов были установлены следующие критерии иммуногениости вакцинных препаратов на основе как эпидемических, так и потенциально пандемических вирусов гриппа: кратность приростов антител не менее 2,5 для лиц 18-60 лет и развитие достоверных сероконверсий у 40% привитых [467]. При этом уровень коллективного иммунитета, оцениваемый по числу лиц с защитными титрами антител, определяемых методом радиальной иммунодиффузии в агарозном геле, должен составлять не менее 70%.
Безопасность при производстве и использовании гриппозных вакцин. Поскольку использование высокопатогенных птичьих вирусов в качестве источника поверхностных антигенов создает проблемы биологической безопасности при работе с ними, возникает необходимость получения авирулентных вариантов с применением методов обратной генетики. Там не менее, повышенные меры безопасности требуются не только в процессе получения реассортантов высокопатогенных птичьих вирусов, но и при работе с уже готовыми кандидатами в вакцинные штаммы. Появились данные о восстановлении высокой расщеплляемости НА после пассажей на курах генетически модифицированных реассортантов высокопатогенных птичьих вирусов [236]. Учитывая высокую степень вирулентности A/PR/8/34 для мышей, необходимо оценивать вероятность влияния его внутренних генов на адаптацию реассортантов на его основе для других видов животных и человека. Известно, что вирус A/PR/8/34, используемый для подготовки реассортантов с современными эпидемическими вирусами для производства инактивированной вакцины, безвреден для человека. Subbarao et al. была также продемонстрирована безвредность A/PR/8/34 для кур [422], а ряд исследований на животных показали безвредность реассортантов подтипа Н5 и Н9 на основе A/PR/8/34 для мышей, кур и хорьков [142, 312, 422]. Тем не менее, Brown et al. показано, что в процессе адаптации к репродукции в легких мышей вирусов A(H3N2) повышение вирулентности было связано с приобретением ряда мутаций, характерных не только для ВП штаммов A(H5N1), но мутации в РА гене, характерной для A/PR/8/34 (РА-556) [128]. Это может указывать на потенциальную опасность для животных, связанную с приобретением реассортантами с вирусами гриппа птиц внутренних генов A/PR/8/34. Полученные позднее реассортанты A/PR/8/34 с вирусами A(H5N1) А/Вьетнам /1203/2004 и А/Индонезия/05/2005, предварительно аттенуированными методами обратной генетики, оказались высоковирулентными для мышей [83, 128]. Есть также данные, что реассортанты между низкопатогенным птичьим штаммом А/утка/Приморье/2621/2001(H5N2) и A/PR/8/34, унаследовавшие 7, 6 или 5 генов от штамма A/PR/8/34, были вирулентными для мышей. Уровень патогенности реассортантов с составом генома 7:1, 6:2 и 5:3 был сопоставимым с родительским штаммом A/PR/8/34 в отличие от низкой патогенности для мышей птичьего штамма А/утка/Приморье/2621/2001(Н5Н2) [384]. В связи с этим, целесообразным может являться использование для получения реассортантов с вирусами гриппа птиц ХА варианта A/PR/8/59/1, селекционированного в процессе длительного пассирования при пониженной температуре вируса A/PR/8/34 и полностью утратившего свойства вирулентности для мышей [164].
В то время как преимущества живых вакцин были показаны в борьбе с такими инфекциями, как оспа, полиомиелит, корь, краснуха, в случае пандемии, вызванной вирусами гриппа, высказываются опасения о возможности взаимодействия между ХА реассортантными вирусами, входящими в состав ЖГВ и циркулирующими эпидемическими вирусами с формированием новых вирулентных реассортантов. До настоящего времени нет доказательств в пользу таких предположений. Наоборот, было показано, что в дополнение к своей способности индуцировать широкий спектр иммунного ответа, живые ХА реассортантные вакциннные штаммы могут напрямую интерферировать с вирусами «дикого» типа при смешанной инфекции хорьков [463]. Проведенные клинические испытания американской реассортантной ЖГВ на основе донора аттенуации H2N2 А/Энн Арбор/6/60 показали, что при применении ЖГВ в условиях эпидемического подъема, вызванного вирусами H3N2, не происходило реассортации между вакцинными штаммами и дикими вирусами [257]. Более того, именно вакцинные штаммы выступали как доминирующие вирусы при опытах на хорьках и клиническом изучении волонтерах, снижая уровень репродукции коинфицирующих диких вирусов [463,481].
Клиническое изучение безвредности и эффективности ЖГВ, содержащей реассортантные вакцинные штаммы на основе холодоадаптированных доноров аттенуации
Современные реассортантные живые вакцины против циркулирующих в настоящее время эпидемических вирусов подтипов получают на основе ХА доноров аттенуации, при этом наследование 5 или 6 генов внутренних и неструктурных белков обеспечивает сочетание необходимого уровня аттенуации с иммуногенностыо [34]. Как следует из литературных источников, изучению молекулярных основ аттенуации и патогенносте вирусов гриппа посвящено множество исследований, тем не менее, остается неясным, какие именно мутации появляются в процессе пассажей при пониженной температуре при традиционном способе получения холодоадаптированных штаммов. Поскольку в каждом конкретном случае в основе аттенуации могут лежать различные механизмы, при создании живых вакцин необходимо подробно изучить эти механизмы, для того чтобы понять, какой из них способен привести к получению наиболее эффективного препарата. Проведено изучение аттенуированного последовательным пассированием при пониженной температуре штамма A/MocKBa/21/17/65(H2N2) как потенциально нового донора аттенуации, так и вакцинного штамма для иммунизации населения в случае возвращения в циркуляцию вируса гриппа A(H2N2). Учитывая, что подтип A(H2N2) исчез из циркуляции более 40 лет назад, и во всем мире количество штаммов данного подтипа, обладающих документрованной безвредностью для человека, ограничено вакцинными штаммами, применявшимися в 1960-е годы XX века, их изучение представляет интерес при поиске возможных закономерностей в механизмах аттенуации среди подобных штаммов.
Донор аттенуации А/Ленинфад/134/17/57(Н2Ы2), полученный на основе штамма А/Ленинград/134/5 7(H2N2), выделенного в самом начале периода циркуляции вирусов подтипа A(H2N2), полностью охарактеризован и может быть использован в качестве вакцинного штамма в случае необходимости. Однако невозможно предсказать, какой именно антигенный вариант вирусов подтипа A(H2N2) способен вернуться в циркуляцию, поэтому желательно иметь в коллекции вакцинных штаммов также и вирус, завершающий эру циркуляции вирусов подтипа A(H2N2).
Как уже упоминалось в главе 1, основы холодовой аттенуации вируса гриппа и получения холодоадаптированной живой гриппозной вакцины в России были заложены в 1960-е годы в процессе получения безвредных для детей вакцинных вирусов гриппа А и В, а затем при разработке на основе этих вирусов холодоадаптированных рекомбинантов. Один из таких вирусов -А/Москва/21/17/65 (H2N2) - является холодоадаптированным вариантом эпидемического штамма A/MocKBa/65(H2N2). Вакцинный штамм А/Москва/21/17/65(Н2Ы2), включенный в состав ЖГВ для детей в 1967 году [10], был получен Г.И. Александровой после дополнительного 17-кратного пассирования при пониженной до 25-26С температуре стандартного вакцинного штамма A/MocKBa/21/65(H2N2). До проведения пассажей при пониженной температуре штамм А/Москва/21/65(Н2Ы2) прошел 20 пассажей при оптимальной температуре (30-32С) и использовался в качестве вакцинного штамма для взрослых в 1966 г. Штамм А/Москва/21/17/65(Н2Ы2) характеризуется документированной безвредностью и высокой иммуногенностыо для детей, что было неоднократно подтверждено за время его использования как в виде моновакцины, так и в составе дивакцины в 1966 -1967 годах [10, 14,84].
С целью изучения молекулярных изменений, приводящих к аттенуации и холодовой адаптации штамма A/MocKBa/21/17/65(H2N2), было проведено секвенирование всех его генов, а также секвенирование генов А/Москва/21/65(Н2Ы2). Данный раздел работы был выполнен в Центре по контролю и предупреждению заболеваний США, г. Атланта. Также были изучены биологические свойства штаммов A/MocKBa/21/17/65(H2N2) и A/MocKBa/21/65(H2N2) в экспериментальных условиях на различных чувствительных системах.
Для сравнительного анализа генетических признаков, отвечающих за температурочувствительность и адаптацию к пониженной температуре репродукции, были предприняты попытки выявления дикого температуроустойчивого варианта вируса А/Москва/65 или наиболее близкого к нему эпидемического штамма подтипа A(H2N2) 1964-65 годов выделения из коллекции эпидемических штаммов Центра по контроля и предупреждения заболеваний США. Результаты сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей НА1 приведены на рисунке 1.
По данным молекулярно-генетического анализа НА1 штаммов H2N2, выделенных в этот период было показано, что наиболее близким по количеству аминокислотных замен к вирусу А/Москва/21/65 является эталонный штамм подтипа A(H2N2), выделенный в 1964 году - А/Англия/1/64.
При изучении репродукции в условиях повышенной температуры имеющихся в наличии эпидемических штаммов A(H2N2) оказалось, что ни один из них не являлся температуроустойчивым при 40С, полностью утрачивая способность к репродукции при данной температуре, кроме штамма А/Нью Джерси/3/65, который репродуцировался до 3,5 lg ЭИД5о/мл, однако разница в показателях репродукции при оптимальной и повышенной температуре составила 6 lg ЭИД5о, так что и этот штамм оказался температуроустойчивым. Кроме того, все штаммы имели довольно длительную пассажную историю: А/Олбани/1/65 - 11 пассажей, А/Кумамото/1/65 -17, А/Питтсбург/2/65 - 13, А/Таиланд/394/65 11, А/Ныо Джерси/3/65 - 16, то есть представляли собой пассажные варианты исходных штаммов «дикого» типа.
