Введение к работе
Актуальность проблемы. Забота об окружающей среде в условиях быстрого индустриального развития многих стран мира делает необходимым переход промышленных процессов на качественно новый технологический уровень, направленный на использование возобновляемых природных ресурсов и минимизацию потерь. Одним из направлений решения данной задачи является сочетание «мягких» в отношении окружающей среды микробиологических процессов с дешевыми и легкодоступными видами сырья. К таким видам сырья можно отнести метанол, получаемый из природного газа и имеющий сравнительно низкую стоимость. В последнее время в биотехнологической индустрии метанолу уделяется большое значение, как альтернативному источнику углерода широко используемым для этих целей сахарам.
Бактерии, способные расти на метаноле, широко распространены в природе и характеризуются большим разнообразием. Доступность сырья и его сравнительно невысокая стоимость позволяют рассматривать метилотрофы в качестве перспективных и выгодных объектов индустриальной биотехнологии. В настоящее время метилотрофные бактерии все шире используются в промышленности для производства таких важных биологически активных веществ, как: секретируемые природные и рекомбинантные белки (Belanger L. et al., 2004; Fitzgerald К. and Lidstrom M, 2003) витамины, ферменты, полисахариды, аминокислоты (Bourque D. et al., 1995; Korotkova N. et al., 2002; MotoyamaH. etal., 1993,2001; Tani Y., 1991).
Создание штаммов-продуцентов с заданными свойствами и высокой эффективностью продукции предполагает детальное знание генетики организма, его метаболитических путей, процессов регуляции клеточного метаболизма, а также наличия определенного набора генетических методов, необходимых для направленной модификации исследуемого объекта. Промышленное использование метилотрофов значительно увеличило интерес к изучению генетического контроля С-1 метаболизма у определенных видов этих бактерий (Anthony С, 1993). За последние 5 лет были секвенированы геномы некоторых метилотрофных микроорганизмов (Chistoserdova L. et al., 2007; GiovannoniS. etal, 2008; HouS. et al., 2008; Kane S. etal.,2007; VuilleumierS. et al., 2009; Ward N. et al., 2004), значительный прогресс достигнут в понимании их метаболизма (Growther G. et al., 2008) и существенно расширен набор полезных методов для генетической и метаболической инженерии (Cue D. et al, 1997; Gliesche С, 1997; Marx С. and Lidstrom M., 2001). К таким методам можно отнести, например, недавнее использование системы транспозона Тп7 для сайт-специфической интеграции в геном метилотрофов рекомбинантных ДНК (Choi У. et al, 2006). Однако и сейчас большинство метилотрофов плохо изучены и набор генетических инструментов для работы с ними сильно ограничен. По этой причине разработка новых подходов генетического анализа метилотрофрых бактерий с их последующим применением в конструировании штаммов-продуцентов представляется на данном этапе актуальной.
Methylophilus methylotrophus AS1, являющийся объектом наших исследований, в 70-е годы прошлого века был широко использован в микробиологической индустрии для производства бактериальной биомассы {Senior P.. and Windass J., 1980, Vasey R. and Powell K., 1984). В связи с чем начальные стадии углеродного и энергетического метаболизма этого организма в этот период были всесторонне исследованы (Сох J. et al., 1992; Hothi P. et al., 2003), однако мало что известно о метаболитических путях биосинтеза аминокислот в М. methylotrophus. Недавно специалистами Аджиномото (Ajinomoto Со, Inc.) было проведено изучение синтеза L-лизина у М. methylotrophus, начиная с исследования путей биосинтеза (Gunji Y. et al., 2004; Tsujimoto N. et al., 2006) и заканчивая конструированием и усовершенствованием продуцента L-лизина на метаноле (Gunji Y. et al., 2006; Gunji Y. and Yasueda H., 2006; Ishikawa K. et al., 2008 (1-3)). Задачей наших исследований было создание методов, облегчающих создание на основе М. methylotrophus штаммов-продуцентов ароматических аминокислот. Как известно, на первом этапе конструирования продуцентов аминокислот необходимо отобрать мутанты с ослабленным ингибировакием ключевых ферментов конечным продуктом биосинтеза и блокировать возможные пути деградации целевого продукта и его предшественников созданием соответствующих ауксотрофных мутантов (Bongaerts J. et al., 2001; Ikeda M., 2006; Parekh S. et al, 2000). Для облигатных метилотрофов получение ауксотрофных мутантов является особой трудностью (de Vries G. et al., 1990). Причиной может быть неспособность некоторых соединений проникать внутрь и экспортироваться из клеток этих микроорганизмов. И хотя отдельные случаи получения ауксотрофных мутантов у М. methylotrophus AS1 все же были описаны (Bohanon М. et al., 1988; Gunji Y. et al., 2004; Kim С and Wood Т., 1997), их число сильно ограничено. Кроме того, применение различных подходов и разработка новых методов для получения мутантов не привели к созданию коллекции ауксотрофных мутантов М. methylotrophus AS1, которые могли быть полезными для исследования путей биосинтеза аминокислот. С другой стороны, имевшиеся в литературе (Tsujimoto N. et al., 2006; Gunji Y. and Yasueda #., 2006), а также и наши собственные экспериментальные данные свидетельствовали в пользу того, что многие клонированные гены Е. coli способны достаточно эффективно экспрессироваться в М. methylotrophus, что позволяло надеяться на возможное практическое использование уже хорошо разработанных генетических модулей и систем для функционирования в этих новых реципиентах.
В последнее время в молекулярной биологии большое внимание уделяется изучению транспортных систем клетки. Мы надеялись, что использование гетерологичных генов Е. coli, кодирующих специфические транспортные белки, поможет увеличить проницаемость цитоплазматической мембраны М. methylotrophus, и, возможно, облегчит процедуру получения ауксотрофных мутантов.
В настоящее время развитие генетических инструментов для изучения метилотрофов включает в себя создание плазмидных векторов для клонирования и экспрессии генов, а также совершенствование методов
транспозонного мутагенеза {Marx С, and Lidstrom М, 2004; Koch В. et al., 2001). Поскольку из-за существующих законодательных ограничений использование плазмид нежелательно при создании промышленных продуцентов биологически активных веществ, то приоритетное значение имеет дальнейшее развитие методов конструирования бесплазмидных рекомбинантных штаммов. Нам представлялось, что и система транспозиции хорошо известного фага Ми (Symonds N. et al., 1987) также могла быть успешно адаптирована для интеграции фрагментов ДНК в геном М. methylotrophus.
Цель и задачи работы. Таким образом, целью настоящей диссертационной работы была разработка новых генно-инженерных подходов для направленной модификации бактериального генома М. methylotrophus при создании бесплазмидных рекомбинантных штаммов-продуцентов.
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
1. исследовать возможность адаптации системы транспозиции
бактериофага Ми для интеграции рекомбинантной ДНК в хромосому М
methylotrophus AS1, в том числе:
сконструировать интегративные плазмиды, содержащие mini-Mu транспозон с РЬР-.ГЛТ'-вырезаемым селективным маркером устойчивости к канамицину и способные к мобилизационному переносу из клеток Е. coli в клетки М. methylotrophus AS1;
осуществить конструирование хелперных плазмид, содержащих термоиндуцибельные гены факторов транспозиции MuA, MuB и способных к репликации в клетках М. methylotrophus AS1;
исследовать возможность интеграции и амплификации mini-Mu транспозона в хромосоме М. methylotrophus AS1;
изучить влияние энхансерной последовательности (IAS) бактериофага Ми на амплификацию mini-Mu в хромосоме М. methylotrophus AS 1;
2. создать коллекцию ауксотрофных мутантов с нарушенным
биосинтезом ароматических аминокислот у М. methylotrophus AS1, для чего:
сконструировать специальный штамм М. methylotrophus AS\::aroPEal с повышенной проницаемостью цитоплазматической мембраны к ароматическим веществам;
клонировать гены ароматического пути биосинтеза М. methylotrophus AS1;
инактивать гены ароматического пути биосинтеза в хромосоме М. methylotrophus AS 1 ::aroP^ca.
Научная новизна и практическая ценность работы. Двухплазмидная система транспозиции бактериофага Ми успешно адаптирована для целей интеграции рекомбинантной ДНК в хромосому М. methylotrophus AS1.
Установлено, что основным механизмом функционирования mini-Mu-транспозона в клетках метилотрофов в рамках данной системы является репликативная транспозиция, за счет которой может быть осуществлена амплификация интегрированных фрагментов ДНК в бактериальном геноме.
Показано, что наличие энхансерной последовательности фага в составе mini-Mu транспозона существенно увеличивает эффективность транспозиции в хромосоме М. methylotrophus AS1. Данная система представляет собой удобный генетический инструмент, прикладным значением которого является конструирование бесплазмидных безмаркерных штаммов-продуцентов биологически активных веществ.
Сконструирован штамм Methylophilus methylotrophus ASl::aroPEa> с геном транспортера агоР&о, интегрированным в хромосому, и обладающий повышенной проницаемостью цитоплазматической мембраны к ароматическим веществам. На основе этого штамма создана коллекция ауксотрофных мутантов с нарушенным биосинтезом ароматических аминокислот.
Разработанные генетические инструменты были успешно использованы в работах НИИ «Аджиномото-Генетика» при конструировании метанол утилизирующих штаммов-продуцентов L-фенилаланина.
Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 6 в журналах, рекомендованных ВАК, и 1 патентная заявка. Материалы диссертации докладывались на конкурсе работ сотрудников ЗАО «АГРИ» (июнь 2004) и Международной научной конференции (Лиссабон, декабрь 2010 г). Диссертационная работа была апробирована на совместном семинаре НТС ЗАО «АГРИ» и секции «Молекулярная биология» Ученого Совета ФГУП ГосНИИгенетика 9 марта 2010 года.
Стуктура и объем работы. Диссертация состоит из 6 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список цитируемой литературы». Работа изложена тУЗЗ страницах, включая <2т рисунков и % таблиц. Список цитируемой литературы содержитдсу источника, в том числе -6 на русском языке.
