Введение к работе
Актуальность проблемы. Динамика биологических макромолекул, наряду с их структурой, является определяющим фактором их функционирования как составляющих частей живого организма. Исследование функций белков и нуклеиновых кислот па молекулярном уровне, а также их роли в процессах жизнедеятельности, напрямую связано с определением их структурных и динамических характеристик, т.е. характера движений и информационных переходов в этих молекулах. В связи с этим, применение в молекулярной биологии метода электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), в частности, метода спиновых меток, представляет значительный интерес. Данный метод позволяет исследовать структурные и динамические свойства макромолекул в интервале температур, соответствующему физиологическим нормам. Метод является чувствительным к молекулярным движениям в диапазоне времен корреляции Ю-11 - Ю-7 с, и поэтому позволяет исследовать более быстрые процессы, чем родственный метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР).
В настоящее время существует значительное число подходов к расчету спектров ЭПР нитроксильных радикалов, используемых в качестве спиновых меток, в растворе, включая методы стохастической динамики, методы, основанные на модели SRLS (Slowly Relaxing Local Structure: Liang Z., J. Phys. Chem. 1999, 103, 6384), а также расчеты по методу молекулярной динамики (МД, например, Sezer D., J. Phys. Chem. В 2008, 112, 5755). Несмотря на это, проблема решения обратной задачи — надежного определения динамических и структурных характеристик исследуемого объекта (ансамбля спин-меченых макромолекул), исходя из данных ЭПР, остается открытой. Недостатком наиболее распространенных методов многомерной параметрической оптимизации (например, сопряженных градиентных методов: Budil D.E., J. Magn. Reson. 1996, 120, 155), за исключением простейших случаев, является неоднозначность полученных результатов, вызванная зависимостью от выбора начального приближения. В системах со сложной динамикой, каковыми являются биологические макромолекулы, различные компоненты молекулярного движения могут иметь сходное влияние па форму спектров ЭПР, что также создает затруднения при интерпретации таких спектров. Возможное решение этой проблемы состоит в комбинации теоретических моделей и экспериментальных техник, обладающих селективностью по отношению к движениям разного типа. Следовательно, развитие уже существующих и разработка новых способов моделирования эффектов динамики спин-меченых макромолекул
в спектрах ЭПР, с учетом описанных особенностей, является весьма актуальной задачей.
Таким образом, разработка методов решения обратной задачи ЭПР для сшш-меченых макромолекул, основанных на селективном моделировании различных по природе динамических эффектов, позволит расширить круг решаемых практических задач. Это определяет актуальность темы диссертационной работы.
Цели и задачи работы. Целью работы являлась разработка комбинированного метода, позволяющего проводить однозначную интерпретацию спектров ЭПР растворов спин-меченых биологических макромолекул, базирующегося на моделировании быстрой компоненты движения метки путем усреднения спинового гамильтониана. В ходе работы были решены следующие задачи:
-
Обобщение модели быстрых ограниченных осцилляции, расширяющее область ее применимости на более широкий класс движений. Вывод частных случаев, соответствующих известным моделям, основанным на частичном усреднении спинового гамильтониана.
-
Модификация процедуры обработки результатов эксперимента по темпе-ратурно-вязкостной зависимости спектров ЭПР с учетом ее совместного использования с обобщенной моделью быстрых осцилляции.
-
Разработка метода для решения обратной задачи ЭПР для спин-меченых биомакромолекул в растворе, позволяющая определять параметры упорядоченности и величины времени корреляции, и моделировать спектры ЭПР. Схема такого метода предполагает использование данных по температурно-вязкостной зависимости, что обеспечивает селективность по отношению к разным типам движения (быстрых анизотропных осцилляции и медленного вращательного броуновского движения), и, соответственно, однозначную интерпретацию спектров ЭПР.
-
Исследование с помощью разработанных подходов характера белок-белковых взаимодействий в системе барстар-барназа, а также различий в Fab-фрагмен-тах нормального и ревматоидного (RF) иммуноглобулинов М человека.
Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые рассматривается обобщенная модель быстрых осцилляции и построенная на ее базе схема решения обратной спектроскопической задачи для спектров ЭПР биологических систем со сложной динамикой. Сводимость сложных процессов к сравнительно небольшому набору параметров, а также использование дополнительных экспериментальных данных, таких, как температурно-вязкостная зависимость спектров, позволяет в рамках этой схемы производить однозначную интерпретацию спектров ЭПР и надежно определять динамические и структурные характеристики (времена корреляции и параметры порядка) с помощью метода спиновых меток. Это открывает новые перспективные пути использования метода спиновых меток применительно к биологическим системам и процессам, в частности, к проблеме белок-белкового узнавания, как в случае с взаимодействием барстар-барназа. Применение разработанного подхода для изучения динамики фрагмента Fab человеческого иммуноглобулина М привело к обнаружению внутренней гибкости фрагмента Fab ревматоидного IgM (RF). Это является существенным шагом в исследовании молекулярных механизмов патогенеза ряда автоиммунных болезней, таких как болезнь Вальденштрема и ревматоидный артрит, и сужает возможные направления поиска новых методов молекулярной диагностики и терапии подобных заболеваний.
Апробация работы. Основные материалы и результаты работы докладывались на международных конференциях «4th International Conference on Nitroxide Radicals: Synthesis, Properties and Implications of Nitroxides» (Новосибирск, 2005 г.), «Modern Development of Magnetic Resonance»(Казань, 2007 г.), «EUROMAR-2008 Magnetic Resonance Conference»(Санкт-Петербург, 2008 г.), «5th International Conference on Nitroxide Radicals»(Ancona, Italy, 2008), «EUROMAR-2009 Magnetic Resonance Conference»(Gothenburg, Sweden, 2009), XXI симпозиуме «Современная химическая физика» (Туапсе, 2009 г.) и молодежной школе «XI International Young Scientific School «Actual Problems of Magnetic Resonance and its Applications» (Казань, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы в ведущих отечественных и зарубежных журналах, и представлено 10 докладов на международных конференциях и симпозиумах.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 9 разделов, включая литературный обзор и экспериментальную часть, выводов, приложения и списка литературы. Материал изложен на 116 страницах, содержит 10 таблиц и 42 рисунка. Список литературы содержит 137 наименований.
