Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Гемостатическии гомеостаз в норме и при патологии печени (обзор литературы)
1.1. Особенности функционирования гемостатического гомеостаза
1.1.1. Сосудистое звено гемостаза. Место медиаторов эндотелия в гомеостазе
1.1.2. Роль тромбоцитов в гемостазе
1.1.3. Место коагуляционного звена в гемостатических реакциях
1.1.4. Роль системы физиологических антикоагулянтов в гемостазе
1.1.5. Система фибринолиза как компонент гемостатического гомеостаза
1.2. Состояние гемостатического гомеостаза при патологии печени
1.3. Роль гемостатического гомеостаза в развитии морфологических изменений в печени
1.4. Влияние противовирусной терапии на гемостатический гомеостаз при вирусных заболеваниях печени
1.5. Показатели гемостатического гомеостаза в прогнозировании течения цирроза печени
ГЛАВА 2. Клиническая характеристика больных
ГЛАВА 3. Методы исследования
Получение биологических образцов для специального исследования
3.2. Методы исследования эндотелиальных маркеров в плазме крови 86
3.2.1. Определение содержания эндотелина-1 в плазме 86
3.2.2. Определение уровня оксида азота в плазме 87
3.2.3. Определение содержания тромбомодулина в плазме 88
3.2.4. Определение активности фактора Виллебраида в плазме 89
Методы исследования показателей тромбоцитарного гемостаза 89
3.3.1. Определение содержания тромбоцитов периферической крови 89
3.3.2. Определение содержания тромбопоэтина в плазме 89
3.3.3. Определение содержания р-тромбоглобулина в плазме 90
Методы исследования показателей свертывания 91
3.4.1. Определение протромбинового времени 91
3.4.2. Определение активированного частичного тромбопластинового времени 91
3.4.3. Определение тромбинового времени 92
3.4.4. Определение содержания фибриногена 92
Методы исследования показателей системы физиологических антикоагулянтов 93
3.5.1. Определение активности антитромбина III в плазме 93
3.5.2. Определение общей активности системы протеина С 94
Методы исследования показателей системы
фибринолиза 94
3.6.1. Определение концентрации и активности тканевого активатора плазминогена 94
3.6.2. Определение содержания ингибитора активатора плазминогена 1 типа 96
3.6.3. Определение уровня плазминогена 96
3.6.4. Определение ХПа-зависимого фибринолиза 97
3.6.5. Определение уровня трансформирующего фактора роста-р! в сыворотке крови 98
3.7. Методы исследования маркеров активации
гемостаза 99
3.7.1. Определение растворимых фибрин-мономерных комплексов в плазме 99
3.7.2. Определение уровня D-димера в плазме 99
3.7.3. Определение уровня комплекса плазмин-а.2-антиплазмин в плазме 100
3.8. Статистический анализ данных 101
ГЛАВА 4. Состояние гемостатического гомеостаза при хронической патологии печени (собственные данные) 104
4.1. Эндотелиальные маркеры при хроническом вирусном гепатите и циррозе печени 104
4.2. Показатели тромбоцитарного гемостаза при хроническом вирусном гепатите и циррозе печени 111
4.3. Показатели коагуляционного гемостаза при хроническом вирусном гепатите и циррозе печени 116
Показатели системы физиологических антикоагулянтов при хроническом вирусном гепатите и циррозе печени 122
4.5. Показатели фибринолиза при хроническом вирусном гепатите и циррозе печени 126
4.6. Маркеры активации гемостаза при хроническом
вирусном гепатите и циррозе печени 134
4.7. Роль параметров гемостаза в идентификации цирроза печени 140
4.8. Роль параметров гемостаза в диагностике выраженности варикозного расширения вен пищевода при циррозе печени 143
ГЛАВА 5. Взаимосвязь показателей гемостатического гомеостаза с гистологическими изменениями в печени при хронических вирусных заболеваниях (собственные данные) 153
5.1. Взаимосвязь эндотелиальных маркеров и гистологических изменений в печени 153
5.2. Взаимосвязь тромбоцитарного гемостаза и гистологических изменений в печени 156
5.3. Взаимосвязь показателей свертывания и гистологических изменений в печени 159
5.4. Взаимосвязь системы физиологических антикоагулянтов и гистологических изменений в печени 162
5.5. Взаимосвязь системы фибринолиза с гистологическими данными активности и фиброза 164
5.6. Взаимосвязь маркеров активации гемостаза и гистологических изменений в печени 169 Математическое моделирование индексов
5.7. гистологической активности и фиброза при хроническом вирусном гепатите и вирусном циррозе печени 172
ГЛАВА 6. Влияние противовирусной терапии на показатели гемостатического гомеостаза при хроническом вирусном гепатите и вирусном циррозе печени (собственные данные) 180
6.1. Влияние противовирусной терапии на эндотелиальные маркеры 180
6.2. Влияние противовирусной терапии на содержание тромбоцитов в периферической крови 186
6.3. Влияние противовирусной терапии на показатели свертывания крови 193
6.4. Влияние противовирусной терапии на показатели физиологических антикоагулянтов 197
6.5. Влияние противовирусного лечения больных на показатели фибринолиза 201
6.6. Влияние противовирусной терапии на активацию гемостаза 206
ГЛАВА 7. Взаимосвязь показателей гемостатического гомеостаза с исходами цирроза печени (собственные данные) 216
7.1. Взаимосвязь показателей гемостаза и кровотечения из вен пищевода у больных циррозом печени 216
7.2. Взаимосвязь показателей гемостаза и исходов цирроза печени 230
Обсуждение результатов 251
Выводы 285
Практические рекомендации 288
Библиография
- Система фибринолиза как компонент гемостатического гомеостаза
- Определение содержания тромбомодулина в плазме
- Показатели тромбоцитарного гемостаза при хроническом вирусном гепатите и циррозе печени
- Взаимосвязь системы физиологических антикоагулянтов и гистологических изменений в печени
Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема хронических заболеваний печени в настоящее время привлекает пристальное внимание исследователей. Это обусловлено широким распространением данной патологии, тяжелым, прогредиентным течением, недостаточной эффективностью применяемых способов диагностики, лечения, профилактики и нередко неблагоприятным прогнозом для больного.
Печень играет центральную роль в поддержании гемостаза, так как большинство коагуляционных факторов, антикоагулянтных протеинов, компонентов системы фибринолиза и стимуляторов тромбопоцитопоэза синтезируются гепатоцитами. Кроме того, ретикулоэндотелиальная система печени обеспечивает клиренс активированных форм гемостатических факторов. Изменения функции печени при острых и хронических заболеваниях инициируют гемостатические отклонения, предрасполагающие к манифестации кровотечения или тромбоза (Amitrano L. et al., 2002; Northup P.G. et al., 2006; M. Peck-Radosavljevic, 2007; Northup P.G. et al., 2008).
Несмотря на многочисленные свидетельства нарушений различных компонентов гемостаза при патологии печени, до сих сохраняется точка зрения о сохранении гемостатического баланса даже в условиях ее тяжелого поражения (Lisman T. et al., 2010). Это создает основу для суждений о незначительной инициирующей и предикторной роли коагуляционных расстройств в развитии геморрагических событий при хронических заболеваниях печени, в том числе кровотечений из желудочно-кишечного тракта (Mannucci P.M., 2006; Matsushita T. et al., 2006; Tripodi A. et al., 2010). С другой стороны, высказывается мнение о частой предрасположенности пациентов с патологией печени к гиперкоагуляции и тромбозам (Amitrano L. et al., 2004; Fimognari F.L. et al., 2005; Kujovich J.L., 2005; Violi F., 2006; Peck-Radosavljevic M., 2007; Northup P.G. et al., 2008; Lisman T. et al., 2010). Указанные обстоятельства значительно затрудняют работу практического врача и требуют уточнения диагностических подходов к оценке больных хроническими заболеваниями печени.
Разработки по комплексной оценке нарушений гемостатического гомеостаза при хронической патологии печени находятся в стадии поиска решения этой проблемы. Сохраняются противоречия в отношении характера, выраженности и направленности гемостатических отклонений при хроническом гепатите и циррозе печени. Отсутствуют убедительные сведения о сопряженности изменений гемостатического баланса с этиологией и клиническими составляющими патологии печени, в том числе с формированием пищеводных флебэктазий. Многие патогенетические аспекты геморрагического синдрома и роль в нем гемостатических сдвигов при хронических заболеваниях печени остаются не изученными.
Практически отсутствуют данные и о взаимосвязи гемостатического гомеостаза с процессами воспаления, фиброза и тканевого ремоделирования при хроническом гепатите и циррозе печени, что является ключом к пониманию патогенеза хронической вирусной патологии печени и основой для совершенствования неинвазивной диагностики морфологических изменений.
Отсутствуют сведения о влиянии противовирусной терапии вирус-ассоциированных заболеваний печени на показатели гемостаза. Изучение динамики гемостатических параметров на фоне применения противовирусных агентов дало бы возможность не только открыть новые механизмы реверсии печеночного воспаления и фиброза, но и прогнозировать возникновение и стабильность вирусологической ремиссии заболевания.
В единичных исследованиях представлены сведения о важной роли показателей гемостаза как маркеров течения цирроза печени. Работы, посвященные изучению предикторной роли гемостатических параметров в долгосрочном прогнозе заболевания, практически отсутствуют.
В связи с этим изучение клинико-патогенетического и прогностического значения нарушений гемостатического гомеостаза при хронической патологии печени представляет несомненный теоретический и практический интерес так как, с одной стороны, позволит уточнить особенности нарушений гемостаза и установить их взаимосвязь с клиническими проявлениями хронических заболеваний печени, а, с другой, обогатит арсенал практических врачей новыми критериями, которые могут использоваться для совершенствования дифференциально-диагностических и лечебных программ и для формирования групп риска неблагоприятного течения патологии печени.
Цель исследования. Определить клинико-патогенетическое и прогностическое значение нарушений гемостатического гомеостаза при хронических заболеваниях печени.
Задачи исследования:
-
Изучить содержание в крови показателей функции эндотелия, тромбоцитарного, коагуляционного звеньев гемостаза, систем физиологических антикоагулянтов и фибринолиза у больных хроническим вирусным гепатитом и циррозом печени и предложить дифференциально-диагностические критерии неинвазивной диагностики цирроза печени.
-
Установить взаимосвязь параметров гемостатического гомеостаза с этиологией заболевания, фенотипическими особенностями гепатотропных вирусов, основными клинико-лабораторными синдромами патологии печени и оценить возможность использования показателей гемостаза в диагностике варикозного расширения вен пищевода.
-
Выявить взаимосвязь гемостатических отклонений с выраженностью гистологической активности и степенью печеночного фиброза и разработать на ее основе модели неинвазивной диагностики активности воспаления и фиброза печени.
-
Определить динамику гемостатических показателей в процессе противовирусной терапии с целью выработки предикторов эффективности лечения хронических вирусных заболеваний печени.
-
Сопоставить изучаемые показатели у больных циррозом печени с характером течения заболевания, в том числе развитием осложнений, создать прогностические индикаторы и сформировать группы риска больных в отношении кровотечений из пищеводных флебэктазий и летального исхода.
Научная новизна работы. Впервые на большом клиническом материале проведено комплексное изучение и установлены закономерности нарушений всех компонентов гемостатического гомеостаза при хронической патологии печени. Раскрыты новые особенности гемостатических сдвигов в зависимости от этиологии заболевания. Впервые получены новые данные, свидетельствующие, что наиболее выраженные изменения гемостаза присущи алкогольному циррозу печени в сочетании с острым алкогольным гепатитом. Впервые показана взаимосвязь отклонений гемостаза и клинико-биохимических синдромов патологии печени: углубление гемостатических нарушений с усилением цитолиза, мезенхимального воспаления, тяжести портальной гипертензии и гепатоцеллюлярной недостаточности. Впервые определено повышенное содержание посредников эндотелия, тканевого активатора плазминогена и низкие показатели тромбоцитов, протеина С при высоких градациях пищеводных венэктазий. Доказана информативность ряда параметров гемостаза для целенаправленного выявления цирротической трансформации печени и варикозного расширения вен пищевода.
Раскрыты особенности патогенеза геморрагического синдрома при хроническом вирусном гепатите и циррозе печени, проявляющиеся нарушением функции эндотелия, низким количеством циркулирующих тромбоцитов, изменением показателей свертывания и дисбалансом в системе фибринолиза.
Впервые проведенная оценка морфологических изменений в печени с учетом отклонений гемостатического гомеостаза позволила установить вовлеченность гемостаза в процессы воспаления и фиброза при хронической вирусной патологии печени и выявить весомую роль в ремоделировании печени повышенных уровней оксида азота, тромбомодулина, тканевого активатора плазминогена, комплекса плазмин-a2-антиплазмин и сниженных количеств антитромбина III, плазминогена и тромбоцитов периферической крови. Впервые разработаны и обоснованы модели неинвазивной диагностики гистологической активности и печеночного фиброза, включающие ряд показателей гемостаза.
Впервые определены особенности позитивного влияния противовирусной терапии на гемостатические нарушения при хронических вирусных заболеваниях печени. Выявлен более выраженный нормализующий эффект противовирусных средств у больных хроническим вирусным гепатитом (ХВГ С, ХВГ В) и ограниченность динамики показателей гемостаза в случаях цирроза печени. Впервые оценена роль ряда параметров гемостаза как прогностических критериев устойчивого вирусологического ответа у больных хроническим вирусным гепатитом С.
Впервые выявлены особенности гемостатических нарушений, имеющих диагностическое значение и оценивающих долгосрочный прогноз при развитии неблагоприятных событий цирроза печени (кровотечение из вен пищевода, летальный исход), и определены группы риска их развития.
Практическая значимость. Комплекс гемостатических параметров может быть использован для целенаправленной верификации цирроза печени. На основе регрессионной модели выведена формула, значительно повышающая возможности неинвазивной диагностики степени варикозного расширения вен пищевода у больных циррозом печени с использованием показателей эндотелина-1, D-димера и тромбоцитов.
Оценка ряда компонентов гемостатического гомеостаза позволит с учетом выявленной взаимосвязи с морфологическими проявлениями воспаления повысить возможности диагностики высокой гистологической активности у больных хронической вирусной патологией печени. Диагностические модели, включающие параметры гемостаза, дадут возможность осуществлять неинвазивную оценку воспаления и печеночного фиброза с целью оптимизации дальнейших лечебных мероприятий.
Установленная зависимость результатов противовирусной терапии с динамикой параметров гемостаза составила основу прогностических критериев устойчивого вирусологического ответа у больных хроническими вирусным гепатитом С. Оценка содержания тромбоцитов периферической крови при проведении противовирусной терапии на 2-й (при использовании короткодействующего интерферона-a) и на 8-й (при применении пегилированных форм) неделях лечения повысит возможности своевременной диагностики и профилактики развития критического цитопенического синдрома.
Факт перспективного влияния гемостатических отклонений на течение заболевания, в частности, кровотечение из вен пищевода, летальный исход у больных циррозом печени в течение 1 и 5 лет наблюдения обосновывает использование ряда параметров гемостаза для формирования групп риска появления данных осложнений.
Основные положения, выносимые на защиту:
особенности отклонений всех компонентов гемостатического гомеостаза у больных хроническими вирусным гепатитом и циррозом печени; частая встречаемость тромбоцитопении при циррозе печени, ассоциированной с высокими количествами плазменного тромбопоэтина;
отсутствие влияния вида вируса при хроническом гепатите, фенотипических его особенностей и степени виремии на направленность и выраженность гемостатических нарушений; более глубокие изменения параметров гемостаза у пациентов с алкогольным циррозом печени по сравнению с вирусным – особенно в случаях сочетания алкогольного цирроза с острым алкогольным гепатитом;
сопряженность отклонений гемостатического гомеостаза с выраженностью цитолитического и мезенхимально-воспалительного синдромов патологии печени, прогностически тяжелыми вариантами цирроза печени, с общим прогнозом заболевания;
роль изменения функции эндотелия, показателей свертывания крови, уровня циркулирующих тромбоцитов и дисбаланса системы фибринолиза в патогенезе кровоточивости при циррозе печени; взаимосвязь патологии тромбоцитов, свертывания и активности тканевого активатора плазминогена с геморрагическим синдромом в случаях хронического гепатита;
зависимость высоких градаций пищеводных венэктазий с высокими значениями эндотелиальных маркеров, активности и содержания тканевого активатора плазминогена и с низкими показателями тромбоцитов, протеина С и коэффициента ИАП/ТАП; вклад эндотелина-1, D-димера и тромбоцитов периферической крови в развитие варикозного расширения вен пищевода при циррозе печени;
возможность использования показателей гемостаза с целью прогноза риска манифестации кровотечения из вен пищевода и развития летального исхода в течение 1 и 5 лет наблюдения;
взаимосвязь показателей гемостатического гомеостаза с воспалением, фиброзом и тканевым ремоделированием при хронической вирусной патологии печени; значимость показателей оксида азота, тромбомодулина, тромбоцитов, антитромбина III, ТАП, плазминогена и комплекса ПАП в неивазивной диагностике гистологической активности и степени фиброза печени;
способность противовирусной терапии к нормализации показателей гемостаза более выраженная у больных ХВГ С, ХВГ В, а также в случаях формирования раннего и устойчивого вирусологического ответов.
Внедрение в практику. Результаты исследования внедрены в практику работы отделений ГУЗ «Ставропольский краевой клинический центр специализированных видов медицинской помощи» г. Ставрополя, МУЗ «2-я городская клиническая больница» г. Ставрополя, МУЗ «Шпаковская ЦРБ» г. Михайловска. Итоговые материалы работы используются в лекциях и на практических занятиях со студентами, клиническими ординаторами, врачами и аспирантами кафедр внутренних болезней №1 с курсом физиотерапии, пропедевтики внутренних болезней, кафедр поликлинической терапии и терапии ФПДО Ставропольской государственной медицинской академии.
Публикации и апробация работы. По теме диссертации всего опубликовано 49 научных работ. Работ, опубликованных в ведущих рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ – 13, в том числе 2 патента на изобретение. Издана монография «Патология печени и функция тромбоцитов (клинико-патогенетический анализ)» (Ставрополь, 2008) тиражом 500 экземпляров.
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на III конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004), 7 съезде научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 2007), Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные проблемы гастроэнтерологии» (Железноводск, 2008), 14 Российской конференции «Гепатология сегодня» (Москва, 2009), 15 Российской гастроэнтерологической неделе (Москва, 2009), 4 Национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2009); на заседании научного координационного совета Ставропольской государственной медицинской академии (2010).
Личный вклад автора в исследование. Диссертантом определены основные идеи и дизайн исследования. Автор самостоятельно проанализировал современную литературу по проблеме исследования и провел определение ряда показателей гемостаза. Курировал больных в течение всего времени наблюдения, участвовал в проведении всех лабораторных и инструментальных исследований, формировал программы и оценивал результаты лечения больных. Результаты исследований зафиксированы в индивидуальных картах больных и компьютерной базе данных. Статистическая обработка и анализ полученных данных выполнены автором самостоятельно. На этой основе автором сделаны обоснованные выводы и даны практические рекомендации.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 335 страницах машинописного текста, содержит 88 таблиц, 6 рисунков, 8 клинических наблюдений, состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций, библиографического указателя, включающего 466 источников литературы, из которых 83 наименования на русском языке и 343 – на иностранных.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Ставропольской государственной медицинской академии в рамках федеральной целевой программы №21 «Предупреждение и борьба с социально значимыми заболеваниями (2007-2011 годы)». Подпрограмма «Вирусные гепатиты». Номер государственной регистрации №01200850594.
Система фибринолиза как компонент гемостатического гомеостаза
Сосуды играют важную роль в гемостатическом гомеостазе, так как эндотелий образует барьер между кровью и сосудами, действуя в качестве модулятора их функций [9, 39]. Общепризнано участие эндотелия в регуляции гемостатических реакций, тонуса и проницаемости сосудов, процессов воспаления, регенерации, метаболизма внеклеточного матрикса, в выполнении транспортных, барьерных функций, что обеспечивает баланс между процессами анти- и протромбоза, вазодилатации и вазоконстрикции, про- и противовоспалительными факторами, ингибиторами и промоутерами роста, анти- и прооксидантами [32, 38, 39, 63, 64, 451].
Нормальный эндотелий обеспечивает гемостатический баланс, обладая антитромбогенной и прокоагулянтной (проагрегационной) активностью. Антитромбогенные свойства эндотелия (тромборезистентность) включают способность к подавлению активации тромбоцитов и свертывания крови, обусловленную отрицательным зарядом эндотелия и продукцией ряда биологически активных молекул [71, 77, 281].
Циркулирующие в сосудах тромбоциты не адгезируют к интактному эндотелию, что связано с отрицательным электрическим зарядом тромбоцитов и эндотелия [27, 77, 281] и с образованием простациклина, который ингибирует агрегацию через увеличение синтеза цАМФ тромбоцитами [4, 38, 71, 77, 221].
Оксид азота является антикоагулянтом, снижает адгезию и агрегацию тромбоцитов (посредством изменения экспрессии Р-селектина, рецепторов IIb-ІІІа и увеличения образования цГМФ), угнетает экспрессию фактора активации тромбоцитов, влияет на систему фибринолиза [6, 13,38, 54, 67, 71, 85]. Оксид азота относится к свободнорадикальным веществам, образуясь при участии синтетазы N0. Мембраносвязанная эндотелиальная NOS сконцентрирована в эндотелии, неирональная локализована в цитозоле нейронов, индуцибельная NOS экспрессируется в клетках сосудистой стенки, лейкоцитах и гепатоцитах под влиянием цитокинов, эндотоксинов и липополисахаридов [6, 13, 96]. Ранее считалось, что синтез физиологических количеств NO осуществляется только за счет эндотелиальной и нейрональной NOS, а дополнительная продукция оксида азота -исключительно за счет индуцибельной. В последующем выявлено участие индуцибельной NOS в физиологическом синтезе оксида азота и первых двух - в дополнительном синтезе при инфекционных болезнях [67, 74].
В поддержание антитромбогенной активности эндотелия вносят вклад продуцируемые эндотелиальными клетками тромбомодулин, антитромбин III и тканевой активатор плазминогена [6, 38, 46]. Так, тромбомодулин, экспрессируемый эндотелиоцитами, мегакариоцитами, тромбоцитами и лейкоцитами, существует в виде высокомолекулярной формы, связанной с мембраной эндотелиоцитов и в виде низкомолекулярной, характеризующей высокий плазменный пул при повреждении эндотелия [22, 46, 133]. Тромбомодулин усиливает активацию протеина С, стимулирует активируемый тромбином ингибитор фибринолиза и подавляет активацию тромбоцитов и факторов VIII, V [46, 406, 133].
Прокоагулянтные и проагрегантные эффекты эндотелия связаны с коллагеном, эндотелином-1, фактором Виллебранда, ингибитором активатора плазминогена-1, тканевым тромбопластином, фибронектином [71, 77, 281]. Эндотелин-1 синтезируется эндотелиоцитами, лейкоцитами, гладкомышечными клетками, гепатоцитами под влиянием ангиотензина II, TGF-p и IGF, тромбина, цитокинов, тогда как простациклин и N0 ингибируют продукцию эндотелина [9, 13]. Эндотелин-1 способствует ингибированию экспрессии тромбомодулина и рецептора протеина С, инициирует адгезию и агрегацию тромбоцитов посредством ЭТА-рецепторов [46, 62]. Формирование проагрегантных свойств эндотелия также происходит за счет высвобождения фактора Виллебранда, тромбоцитактивирующего фактора, а также экспрессии на эндотелиоцитах тромбоцит-эндотелиальных адгезионных молекул [179]. Фактор Виллебранда, являясь продуктом мегакариоцитов и эндотелиоцитов, высвобождается при повреждении эндотелия и активации тромбоцитов под влиянием эндотоксинов, цитокинов и агонистов агрегации, обеспечивает адгезию тромбоцитов к коллагену субэндотелия, вызывает их агрегацию, стабилизирует и стимулирует синтез фактора VIII, являясь, по сути, посредником во взаимодействии плазменного и сосудисто-тромбоцитарного гемостаза [28, 281].
Снижение фибринолитической активности происходит в результате стимулированного ангиотензином II синтеза ингибитора активатора плазминогена 1 типа и торможения образования тканевого активатора плазминогена [38, 71, 98].
Эндотелий также участвует в регуляции сосудистого тонуса, вырабатывая вазодилататоры (оксид азота, простациклин, брадикинин и др.) и вазоконстрикторы (ангиотензин II, тромбоксан Аг, эндотелин-1) [9, 13, 27, 38, 64]. Оксид азота - основной вазодилататор, способствующий накоплению цГМФ в гладкомышечных клетках и тормозящий синтез и рилизинг эндотелина-1 и норадреналина [6, 71, 38, 52, 54, 67]. Вазоконстрикция обеспечивается воздействием эндотелина-1, приводящим к повышению содержания кальция в гладкомышечных клетках и снижению в сосудах уровня оксида азота [9, 13, 62].
Эндотелиальные клетки играют важную роль в реализации пролиферативного потенциала клеток, что достигается выработкой ингибиторов пролиферации (оксид азота, простациклин и др.) либо, наоборот, синтезом промоутеров роста (эндотелин-1, ангиотензин II и др.) [64, 71]. Сохранение нормальной активности эндотелия рассматривается как важное условие поддержания гомеостаза. Ключевую роль в инициации повреждения эндотелия играет оксидативный стресс. Дисфункция эндотелия - состояние, характеризующееся дисбалансом различных медиаторов, обеспечивающих гемостаз, сосудистый тонус, течение реакций воспаления, регенерации и фиброза [27, 33, 39, 63, 71]. При длительном воздействии указанных факторов происходит повреждение и/или активация эндотелиальных клеток, приводящие к патологическому ответу в виде длительной вазоконстрикции, тромбообразования, усиления пролиферации и ремоделирования тканей, прооксидантного состояния, усугубляющих эндотелиальную дисфункцию. Маркером дисфункции эндотелия, помимо снижения эндотелийзависимой дилатации, по мнению ряда авторов, может быть измененное содержание регуляторных молекул [6, 39, 62, 63, 71, 81].
Определение содержания тромбомодулина в плазме
Содержание антигена ингибитора активатора плазминогена 1 типа в плазме крови определяли с использованием стандартного тест-набора («Technoclone GmbH», Австрия) в соответствии с инструкцией.
Образцы исследуемой плазмы, калибровочные и контрольные образцы вносились в лунки планшета с сорбированными моноклональными антителами к ингибитору активатора плазминогена 1 типа, добавляли буфер и инкубировали в течение 60 минут при 37 С. После этого добавляли конъюгат других моноклональных антител анти-ИАП-1, меченных пероксидазой, с последующей инкубацией в течение 60 минут при 37 С. Затем вносили субстратный раствор тетраметилбензидина, инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре, останавливали реакцию добавлением стоп-реагента. Интенсивность окраски раствора измеряли с определением оптической плотности при длине волны 450 нм.
Строили калибровочную кривую, по которой находили искомые концентрации ингибитора активатора плазминогена в образцах плазмы. У 20 здоровых добровольцев плазменная концентрация ингибитора активатора плазминогена составила 20,82+1,62 нг/мл. Коэффициент ИАП/ТАП у 20 здоровых добровольцев равнялся 2,98±0,41 у.е.
Принцип метода определения активности плазминогена основан на его способности образовывать комплекс со стрептокиназой, катализирующий отщепление пара-нитроанилина от хромогенного субстрата, абсорбция которого прямо пропорциональна активности плазминогена.
Для определения активности плазминогена использовали набор реагентов (Реахром-плазминоген, НПО «Ренам», Россия). К разведенной в 15 раз исследуемой или контрольной плазме добавляли раствор стрептокиназы, инкубировали в течение 5 мин при 37 С, вносили раствор хромогенного субстрата, повторно инкубировали в течение 3 минут при 37 С и останавливали реакцию путем добавления концентрированной (96%) уксусной кислоты. После измерения оптической плотности образца на спектрофотометре при длине волны 405 нм определяли активность плазминогена, используя калибровочный график и значение оптической плотности исследуемого образца. У 30 здоровых добровольцев активность плазминогена в плазме была равной 9б,03±2,03%.
Принцип метода заключается в выделении из плазмы эуглобулиновой фракции с последующим лизисом сгустка фибрина (образованного при добавлении кальция хлорида) плазмином, активированным фактором ХПа.
Использовали набор реагентов для определения фибринолитической активности плазмы крови (ХПа-зависимый фибринолиз) (НПО «Ренам», Россия). Вносили дистиллированную воду, 1% раствор уксусной кислоты, исследуемую плазму и 0,5% суспензию каолина, перемешивали и инкубировали 30 минут при температуре 37 С. После инкубации центрифугировали смесь в течение 6 минут при 1500 об/мин, удаляли супернатант и в пробирку с осадком вносили прогретый буферный раствор, раствор кальция хлорида и наблюдали образование сгустка фибрина. В момент образования сгустка включали секундомер и определяли время полного лизиса сгустка. У 28 здоровых добровольцев длительность ХПа-зависимого фибринолиза была равной 352,14+22,68 сек.
Определение уровня трансформирующего фактора pocma-fii в сыворотке крови Содержание ростового фактора в сыворотке крови определяли с использованием стандартного тест-набора («Biosource International Inc.», США) в соответствии с инструкцией.
Трансформирующий фактор роста-Рь содержащийся в образцах сыворотки и стандартах, связывался с иммобилизованными в лунках планшета антителами к ростовому фактору одним сайтом связывания и с добавляемыми биотинилированными моноклональными антителами (в виде конъюгата с биотином) - вторым сайтом связывания. После инкубации в течение 3 часов при комнатной температуре и удаления избытка вторых антител добавлялась стрептавидин-пероксидаза, связывающаяся с биотинилированными антителами с формированием сэндвич-комплекса из 4-х реагентов. После второй инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре и промывки удалялся несвязавшийся фермент и добавлялся субстратный раствор с хромогеном, который взаимодействовал с ферментом, образуя цветной комплекс. После инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте реакция останавливалась добавлением стоп-реагента при изменении цвета раствора на желтый. Интенсивность окраски раствора измеряли, определяя оптическую плотность на фотометре при длине волны 450 нм.
Строили калибровочную кривую, по которой находили искомые концентрации трансформирующего фактора роста-Pi в образцах сыворотки. У 12 здоровых добровольцев сывороточное содержание ростового фактора составило 2,09±0,30 нг/мл. 3.7. Методы исследования маркеров активации гемостаза
Принцип определения в плазме растворимых фибрин-мономерных комплексов заключается в появлении в плазме, содержащей растворимые фибрин-мономерные комплексы, зерен фибрина после добавления к ней раствора фенантролина.
Для определения использовали набор реагентов (ООО «Технология-Стандарт», Россия). В пробирку к исследуемой плазме добавляли раствор фенантролина и включали секундомер. При непрерывном покачивании пробирки в проходящем свете регистрировали время появления первых зерен фибрина. По таблице определяли количество растворимых фибрин-мономерных комплексов в исследуемой плазме. У 35 здоровых добровольцев плазменная концентрация РФМК составила 3,14+0,05 мг/дл или 3 (3-3) мг/дл.
Показатели тромбоцитарного гемостаза при хроническом вирусном гепатите и циррозе печени
Плазменные показатели эндотелиальных медиаторов не различались в зависимости от возраста и пола пациентов.
Содержание эндотелина-1, тромбомодулина и активность фактора Виллебранда не зависели от этиологии гепатита, гено- и фенотипических особенностей и уровня вирусной нагрузки HBV и HCV (табл. 4.2). Показатели оксида азота были максимальными у пациентов с хроническим гепатитом D, отличаясь достоверно от соответствующих значений при HBV-и HCV-инфекции. При инфицировании «диким» штаммом HBV определялась более высокая концентрация оксида азота по сравнению с HBeAg-негативным вариантом. Концентрация оксида азота имела более высокие значения в случаях высокой вирусной нагрузки. Выявлена в плазме были увеличены у больных вирусным и алкогольным циррозом печени с более высоким содержанием оксида азота у пациентов с алкогольной этиологией процесса. Сочетание алкогольного цирроза печени с острым алкогольным гепатитом сопровождалось тенденцией к более высоким уровням эндотелина-1 и достоверно более высокими значениями оксида азота, тромбомодулина, фактора Виллебранда в плазме крови (табл. 4.3).
Был также проведен анализ уровня эндотелиальных медиаторов с учетом наличия и выраженности основных клинико-биохимических синдромов. В случаях хронического гепатита содержание оксида азота и тромбомодулина были сопряжены с подъемом АлАТ. При циррозе печени наблюдалось возрастание эндотелина-1 и оксида азота, ассоциированное с тяжестью цитолиза. При ХВГ установлена позитивная корреляция между уровнем эндотелина-1, тромбомодулина, с одной стороны, и активностью апаниновой аминотрансферазы, с другой (г= 0,25; г= 0,25; р 0,05).
В случаях хронического вирусного гепатита плазменная концентрация эндотелина-1 и оксида азота была достоверно более высокой при тяжелом МВС по сравнению с умеренным, а показатели тромбомодулина и фактора Виллебранда не зависели от его выраженности. При циррозе печени такая взаимосвязь выявлена только для эндотелина-1, оксида азота и фактора Виллебранда.
При циррозе печени в случаях холестаза определялось достоверно более высокое количество оксида азота по сравнению с пациентами, не имеющими его признаков. С нарастанием тяжести цирроза печени уровни эндотелина-1, оксида азота и тромбомодулина повышались, достигая максимума при прогностически неблагоприятных случаях (класс С), достоверно различаясь при компенсированном и субкомпенсированном вариантах заболевания (табл. 4.4). Активность фактора Виллебранда у больных ЦП была увеличена при любом классе Child-Pugh. Уровни эндотелина-1, оксида азота и тромбомодулина при циррозе печени позитивно коррелировали с индексом Child-Pugh (г= 0,38; г= 0,37; г= 0,42; р 0,05); концентрация оксида азота и тромбомодулина также позитивно коррелировала с уровнем билирубина (г= 0,56; г= 0,39; р 0,05), а активность фактора Виллебранда находилась в обратной связи с альбумином крови (г= -0,35; р 0,05).
Удельный вес больных циррозом печени класса А с показателями эндотелина-1 более 0,31 фмоль/мл (78,5% случаев), имеющих содержание оксида азота более 150 мкмоль/л (50% случаев), с показателями тромбомодулина, превышающими 5 нг/мл (35,7% случаев), был достоверно увеличен (соответственно %2=16,6; х2=28,4; /2=5,8; р 0,05).
С ухудшением портальной гемодинамики концентрация эндотелина-1, оксида азота и тромбомодулина в крови возрастала, достигая максимума в случаях декомпенсированнои портальной гипертензии и превышая соответствующие значения при компенсации портальной гемодинамики (а в случае тромбомодулина и у пациентов с субкомпенсированной портальной гипертензией). Активность фактора Виллебранда была увеличена независимо от степени изменений портальной гемодинамики.
При наличии асцита концентрация эндотелина-1, оксида азота и тромбомодулина в плазме крови была достоверно выше (2,43±0,64 фмоль/мл, 300,74±79,32 мкмоль/л и 7,84±0,86 нг/мл соответственно), чем у здоровых и у больных циррозом печени с отсутствием абдоминального выпота (1,01+0,31 фмоль/мл, 151,87±19,81 мкмоль/л и 5,07±0,70 нг/мл соответственно). Плазменная активность фактора Виллебранда, будучи увеличенной у всех больных ЦП, не различалась в зависимости от наличия или отсутствия свободной жидкости в брюшной полости.
Был проведен анализ изучаемых эндотелиальных маркеров в зависимости от наличия и выраженности пищеводных венэктазий. Уровни эндотелина-1, оксида азота, тромбомодулина и фактора Виллебранда, сохраняясь повышенными при любой степени варикозного расширения вен пищевода, достоверно возрастали от 0-1 степени (1,00+0,34 фмоль/мл, 152,77+20,35 мкмоль/л, 5,76+0,79 нг/мл и 92,8413,71% соответственно) ко 2-3 степени пищеводных флебэктазий (2,22±0,57 фмоль/мл, 317,55+88,81 мкмоль/л, 8,01±0,93 нг/мл и 105,2±2,86% соответственно).
Наличие или отсутствие симптомов кровоточивости у больных хроническим вирусным гепатитом не было связано с плазменной концентрацией медиаторов эндотелия. При циррозе печени показатели оксида азота, тромбомодулина и фактора Виллебранда имели достоверно более высокие уровни при наличии симптомов кровоточивости.
Таким образом, при хронической патологии печени отмечается увеличение плазменных уровней эндотелина-1, оксида азота и фактора Виллебранда с наиболее высокими значениями у пациентов с цирротической трансформацией процесса. Показатели тромбомодулина не изменяются в случаях хронического гепатита и повышаются при циррозе печени. Концентрация эндотелиальных медиаторов не зависит от возраста и пола больных. Увеличенные уровни эндотелиальных маркеров наблюдаются при ХВГ В, ХВГ С и ХВГ D с максимальными значениями оксида азота при HDV-инфекции. Особенности и степень вирусной нагрузки HBV и HCV не оказывают влияния на показатели эндотелия за исключением более высоких количеств оксида азота при инфицировании «диким» штаммом вируса гепатита Вив случаях высокой виремии. Содержание эндотелиальных медиаторов в плазме увеличивается при вирусном (вне зависимости от типа гепатотропного вируса) и алкогольном циррозе печени с более высокими значениями оксида азота у пациентов с алкогольной этиологией процесса. Сочетание алкогольного цирроза печени с острым алкогольным гепатитом сопровождается более высокими плазменными количествами оксида азота, тромбомодулина и фактора Виллебранда. Уровни оксида азота и тромбомодулина при хроническом гепатите и эндотелина-1 и оксида азота в случаях цирроза печени сопряжены с выраженностью цитолитического синдрома. При тяжелом мезенхимально-воспалительном синдроме показатели эндотелина-1 и оксида азота (а при циррозе печени также фактора Виллебранда) возрастают более значительно по сравнению с умеренным мезенхимальным воспалением. Холестатический синдром сопровождается более высокими показателями оксида азота у больных циррозом печени. Прогностически тяжелые варианты цирроза печени (класс С по Child-Pugh, декомпенсированная портальная гипертензия, асцит и высокие градации пищеводных венэктазий) характеризуются максимальными уровнями эндотелина-1, оксида азота и тромбомодулина с наличием позитивной корреляции с индексом Child-Pugh. Геморрагический синдром у больных хроническим гепатитом не связан с концентрацией медиаторов эндотелия. В случаях цирроза печени показатели оксида азота, тромбомодулина и фактора Виллебранда возрастают в большей степени при наличии симптомов кровоточивости.
Взаимосвязь системы физиологических антикоагулянтов и гистологических изменений в печени
При изучении динамики тромбоцитов на фоне лечения больных ХВГ С в зависимости от типа применяемого интерферона-а (короткого действия или пегилированного) оказалось, что при использовании пегилированных интерферонов-ос на протяжении всего курса терапии наблюдалось достоверное снижение показателей тромбоцитов. При этом максимум снижения (на 28,7%) наблюдался на 8 неделе с дальнейшей стабилизацией на низком уровне в пределах 21-24,5%. Следует отметить, что средние значения тромбоцитов даже после снижения находились в пределах диапазона нормальных величин. Уменьшение количества клеток на протяжении всего курса противовирусной терапии отмечалось у 56,8% больных, показатели тромбоцитов менее 100х109/л (преимущественно 1-я степень тромбоцитопении) были зарегистрированы у 29,5% (26 пациентов), и только у трех больных (3,4%) определялись значения тромбоцитов менее 50x109/л (Ш-я степень тромбоцитопении), потребовавшие редукции дозы препарата. Антипролиферативный эффект пегилированного интерферона-а сохранялся и через 4 недели после окончания лечения с восстановлением содержания клеток до исходного уровня через 12 недель после окончания терапии (достоверно более низкого, чем в контроле). К концу 24 недель наблюдения отмечалось достоверное увеличение (на 14,8%) количества тромбоцитов — до нормы.
В случаях назначения короткодействующих препаратов на протяжении всего лечения наблюдалось достоверное уменьшение уровня тромбоцитов. При этом максимум снижения (на 14,1%) наблюдался на 2 неделе терапии, в дальнейшем значения клеток стабилизировались, оставаясь пониженными не более, чем на 9,3-10,7%. Средние показатели тромбоцитов при этом находились в диапазоне нормальных величин. Снижение клеток на протяжении всего курса противовирусного лечения наблюдалось у 43,6% больных, показатели тромбоцитов менее 100х109/л (абсолютное большинство с 1-й степенью тромбоцитопении) были зарегистрированы только у 7,7% пациентов, и ни в одном случае значения тромбоцитов не были менее 50х109/л. Антипролиферативный эффект короткодействующих интерферонов нивелировался к окончанию терапии (к 48 неделе): происходило восстановление содержания клеток до исходных значений (достоверно более низких, чем в контроле). Через 24 недели наблюдения количество тромбоцитов возрастало (на 8,7%) — фактически нормализовалось.
Клинические проявления тромбоцитопении в виде геморрагического синдрома отсутствовали при любой схеме терапии.
Начиная со 2 недели лечения, на протяжении всего курса терапии и на 4-й неделе последующего наблюдения в группе пациентов, получавших пегилированный интерферон-а в комбинации с рибавирином, определялись достоверно более низкие показатели тромбоцитов по сравнению с больными, леченными интерфероном-а короткого действия, что свидетельствует о более выраженном антипролиферативном эффекте пегилированных интерферонов.
У 12 больных хроническим вирусным гепатитом С, имевших исходные показатели клеток менее нижней границы диапазона нормы и получавших ПЕГ-интерферон-а-2а и рибавирин, достоверное снижение уровня тромбоцитов по сравнению с исходным (на 14,2%) регистрировалось только через 2 недели лечения. К 12-й неделе наблюдения наблюдалось достоверное увеличение содержания клеток, сохраняющееся до конца периода наблюдения (на 34,5% и 61,6%). Через 24 недели наблюдения количество тромбоцитов (200,60±14,88х10 /л) было ниже, чем у здоровых, находясь в диапазоне нормы.
У больных ЦП С снижение уровня тромбоцитов наблюдалось начиная с 8 недели лечения (на 23,6%). В дальнейшем уровень клеток оставался стабильно низким: на 21,5-22,9%. Антипролиферативный эффект интерферона-а исчезал через 4 недели после окончания терапии, а концу периода наблюдения регистрировалось достоверное увеличение (на 22,3%) количества тромбоцитов, не достигающее нормы.
Установлено, что вне зависимости от генотипа HCV (1 или не-1) на протяжении всего курса лечения наблюдалось достоверное снижение тромбоцитов с наличием сравнительно более высокого их содержания на 4 и
12 неделе терапии у пациентов с не-1 генотипом. К 12 неделе после завершения лечения показатели тромбоцитов восстанавливались до исходных величин, а к окончанию периода наблюдения (к 24 неделе) их количество нормализовалось вне зависимости от генотипа HCV. Динамика показателей тромбоцитов при различной вирусной нагрузке (высокой или низкой) была сопоставимой. При низкой вирусной нагрузке через 6 месяцев наблюдения происходила нормализация количества клеток, а при высокой исходной виремии определялось увеличение содержания тромбоцитов.
В случаях достижения раннего вирусологического ответа выявлено снижение уровня тромбоцитов на протяжении всего курса терапии, тогда как при сохранении виремии уменьшение содержания клеток носило достоверный характер только на 2, 8, 24, 48 неделях лечения. После окончания терапии вне зависимости от ее результатов наблюдалось восстановление клеток до исходного количества к 12 неделе и нормализация содержания тромбоцитов к 6 месяцу наблюдения.
При наличии устойчивого вирусологического ответа у больных ХВГ С количество тромбоцитов, измеренное до начала лечения, было достоверно выше, чем в случаях с отсутствием элиминации вируса. Количество клеток к концу периода наблюдения было достоверно выше у пациентов с УВО, чем у больных с сохраняющейся виремией.
Таким образом, через 24 недели после окончания противовирусной терапии наблюдается нормализация тромбоцитов у больных ХВГ и повышение содержания клеток, не достигающее значений контроля, в случаях цирроза печени. Нормализующий эффект лечения не зависит от этиологии хронического гепатита (В или С), генотипа HCV, выбранной схемы терапии (аналоги нуклеозидов или пегилированный интерферон-а при HBV-инфекции или комбинация рибавирина с пегилированным или стандартным интерфероном-а в случаях HCV-инфекции) и достижения раннего вирусологического ответа. ХВГ С с высокой виремией протекает с увеличением количества тромбоцитов периферической крови через 6 месяцев наблюдения. У пациентов с низкой вирусной нагрузкой уровень клеток в эти сроки не отличается от нормы. У больных ХВГ С, достигших устойчивого вирусологического ответа, происходит нормализация содержания тромбоцитов в конце б-месячного периода наблюдения. У нон-респондеров через 24 недели после окончания терапии показатели пластинок, не достигая нормы, возрастают, оставаясь ниже, чем у респондеров. Кроме того, при наличии УВО исходное количество тромбоцитов более высокое, чем в случаях с отсутствием элиминации вируса. У больных ХВГ С и исходно сниженным уровнем тромбоцитов увеличение их количества (исчезновение тромбоцитопении) через 6 месяцев наблюдения остается ниже нормы.
Динамика тромбоцитов в процессе терапии ХВГ В пегилированным интерфероном-а или ХВГ С пегилированным интерфероном-а и рибавирином характеризуется достоверным уменьшением на протяжении всего курса лечения с минимальными значениями на 8 неделе (на 34,3% и 28,7% соответственно) и исчезновением антипролиферативного эффекта к 12 неделе после завершения лечения. У пациентов с хроническим вирусным гепатитом С, леченных короткодействующим интерфероном-а и рибавирином, количество тромбоцитов в процессе лечения снижается (менее значимо по сравнению с пегилированными интерферонами) с минимальными значениями на 2 неделе (на 14,1%) и исчезновением антипролиферативного эффекта к 48 неделе терапии. При лечении пегилированным интерфероном-а и рибавирином больных циррозом печени С-вирусной этиологии уровни тромбоцитов достигают минимума на 8 неделе (на 23,6%), а антипролиферативное влияние интерферона-а исчезает к окончанию курса лечения. Лечение пегилированным интерфероном-а и рибавирином больных хроническим гепатитом С с тромбоцитопенией приводит к достоверному уменьшению показателей клеток уже на 2 неделе лечения (на 14,2%) и далее не изменяется.
