Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. «Клинико-морфологическая характеристика лейомиомы матки» 13
1.1. Эпидемиология и факторы риска развития лейомиомы матки... 13
1.2. Патогенез лейомиомы матки 15
1.2.1. Генетические аспекты патогенеза лейомиомы матки 15
1.2.2. Характеристика гормонального статуса при лейомиоме матки 16
1.2.2.1. Влияние гормонального фона на ткани лейомиомы матки 16
1.2.2.2. Роль особенностей локального тканевого гомеостаза в патогенезе лейомиомы матки 20
1.2.3. Молекулярно-биологические особенности лейомиомы матки 22
1.2.3.1. Характеристика пролиферативной активности тканей лейомиомы матки 22
1.2.3.2. Роль апоптозав патогенезе лейомиомы матки 28
1.3. Морфологическая характеристика и морфогенез лейомиомы матки 30
1.3.1. Морфогенез и механизмы роста лейомиомы матки 30
1.3.2.Морфологическая характеристика вторичных изменений в узлах лейомиомы матки 33
1.3.3. Классификация лейомиомы матки 35
1.4. Клиническая характеристика и диагностика лейомиомы матки 37
1.5. Особенности сочетания лейомиомы матки с заболеваниями женской половой системы 40
Глава 2. Материал и методы 45
2.1. Клиническая и морфологическая характеристика материала 45
2.2. Методы исследования 46
2.2.1. Клинико-морфологические сопоставления 46
2.2.2. Морфологическое исследование 46
2.2.3. Иммуногистохимическое исследование 47
2.2.4. Tunel-метод in situ labeling hybridization для выявления апоптоза 50
2.2.5. Статистическое исследование 52
Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 53
3.1. Морфологические особенности лейомиомы матки 53
3.2. Молекулярно-биологические особенности лейомиомы матки 65
3.2.1. Пролиферация в разных гистологических типах лейомиомы матки 65
3.2.1 1. Маркеры пролиферации КІ67 и PCNA 65
3.2.1.2. Онкопротеины Bcl-2, С-тус 71
3.2.1.3. Факторы роста ЭФР, ТцФР, ИПФР-1 и ЭФР-Р 76
3.2.2. Апоптоз в разных гистологических типах лейомиомы матки 90
3.2.2.1. Уровень апоптоза (ApopDETEK тест) 90
3.2.2.2. Fas рецептор 93
3.2.2.3. Онкопротеин Вах 96
3.2.3. Соотношение процессов гипертрофии, пролиферации и апоптоза в разных гистологических типах лейомиомы матки 99
Заключение 106
Выводы 115
Список литературы 117
- Патогенез лейомиомы матки
- Клиническая характеристика и диагностика лейомиомы матки
- Tunel-метод in situ labeling hybridization для выявления апоптоза
- Молекулярно-биологические особенности лейомиомы матки
Введение к работе
Актуальность работы.
Лейомиома матки (Лм) - это истинная доброкачественная опухоль миометрия, что было доказано ее клинико-морфологическими особенностями и моноклональным происхождением (Towsend D.E., 1970). Распространенность Лм достигает 77% у женщин репродуктивного возраста, из них 15% Лм сочетается с гиперплазией эндометрия и 30 % - с аденомиозом (Бохман Я.В., 1995; Железнов Б.И., Стрижаков А.Н., 1990). Лм может вызывать бесплодие, маточные кровотечения, нарушение функции тазовых органов и является одной из основных причин для гистерэктомии. Хирургическое лечение Лм признано основным патогенетически обоснованным методом лечения. По поводу Лм выполняется до 50-70 % оперативных вмешательств в гинекологических стационарах, из которых 60,9 - 95,5% приходится на радикальные операции, в том числе и в репродуктивном возрасте (24-26,8%), когда предпочтительными должны быть органосохраняющие методы лечения (Вихляева Е.М., Железнов Б.И., Запорожан В.Н., 1997).
При выборе тактики лечения Лм в настоящее время практически не учитывается гистологический тип Лм. Одной из проблем является то, что морфологические особенности Лм при гистологическом исследовании авторами оцениваются по-разному, в связи с чем в руководствах представлены различные классификации Лм. ВОЗ рекомендует выделять Лм, которую в русскоязычной литературе часто обозначают как простую или обычную Лм (Хмельницкий O.K., 1999), и ее гистологические варианты (клеточная, митотически активная, эпителиоидная, миксоидная, атипическая Лм и липолейомиома и т.д.) (ВОЗ, 2003). Известно, что разные гистологические типы Лм обладают различным пролиферативным
7 потенциалом, и вследствие этого могут требовать разного тактического подхода к лечению.
Механизмы роста и развития разных гистологических типов Лм сегодня изучены недостаточно. В то же время в литературе описана гормонозависимость Лм от эстрогенов и прогестеронов (Irwin J.С, 1991; Rein M.S., 1998; Wu J., 1995). В ряде работ установлена роль фактора роста фибробластов, сосудистого фактора роста, бета-трансформирующего фактора роста, тромбоцитарного фактора роста (ТцФР), эпидермального фактора роста (ЭФР), инсулиноподобного фактора роста 1 типа (ИПФР-1), фактора некроза опухолей и их регуляция гормонами в развитии и прогрессировании Лм (Anania В., 1998;. Guidice L.C., 1993; Kalmes А., 2000). В некоторых работах изучалась экспрессия онкомаркеров р53, Вс1-2, Вах, С-myc, Bad, маркеров пролиферации КЇ67, PCNA, FAS рецептора и лиганда, уровень апоптоза в ткани Лм, прилежащего миометрия и эндометрия (Gao Z., 2002; Kevin D., 2000; Matsuo H., 1997). Однако остается неясным вопрос, с чем связан регресс Лм и каковы его молекулярные механизмы. В ранее проведенных исследованиях процессы клеточной гибели, гипертрофии и пролиферативная активность опухолевых клеток Лм не сопоставлялись, а апоптоз лейомиоцитов не изучался с учетом гистологического типа Лм (Shimomura Y., 1998; Vos S, 1994).
Целью настоящего исследования явилось изучение соотношения процессов пролиферации, гипертрофии и апоптоза лейомиоцитов, а также факторов их регулирующих, в разных гистологических типах Лм с использованием морфологического и иммуногистохимического анализа.
Для реализации цели поставлены следующие задачи:
1. Дать сравнительную морфологическую характеристику
простой, клеточной и митотически активной Лм.
Изучить иммуногистохимшо маркеров пролиферации (КІ67, PCNA), факторов роста (ЭФР, ЭФР-Р, ИЛФР-1, ТцФР) и уровень экспрессии онкобелков (C-myc, Вс1-2) в простой, клеточной и митотически активной Лм.
Исследовать уровень апоптоза (ApopDETEK тест, экспрессию FAS рецепторов, Вах) в простой, клеточной и митотически активной Лм.
Сравнить соотношение процессов пролиферации, гипертрофии и апоптоза лейомиоцитов в простой, клеточной и митотически активной Лм.
Охарактеризовать механизмы увеличения размеров простой, клеточной и митотически активной Лм
Научная новизна.
В результате проведенного исследования показаны патогенетические и морфогенетические различия между простой, клеточной и митотически активной Лм. Установлено, что разные гистологические типы Лм характеризуются особенностями нарушения процессов пролиферации, гипертрофии и апоптоза лейомиоцитов в опухолевых клетках, что обуславливает различия в механизмах их роста.
Простая Лм отличается преобладанием гипертрофии и апоптоза лейомиоцитов над их пролиферацией, что подтверждается высоким уровнем апоптоза (TUNEL-метод) и экспрессией проапоптотических факторов - Вах, Fas рецептора, на фоне низкой экспрессии маркеров пролиферации КІ67, PCNA и онкобелков C-myc и Вс1-2. Увеличение размеров такой опухоли, вероятно, является результатом ее вторичных изменений, а также пролиферации элементов стромы под влиянием ЭФР, ИПФР-1 и гипертрофии лейомиоцитов.
Клеточные Лм характеризовались самым низким уровнем апоптоза, экспрессией Вах и FAS рецептора среди всех типов Лм, на фоне средней экспрессии маркеров пролиферации КІ67, PCNA в опухолевых клетках. Тогда как уровни ЭФР и его рецептора, ИПФР-1 были максимальными по сравнению с другими типами Лм. Увеличение размеров клеточной Лм связано с выраженной гипертрофией и увеличением количества лейомиоцитов, вероятно, за счет удлинения срока их жизни.
Митотически активная Лм отличается преобладанием процессов пролиферации над апоптозом опухолевых клеток за счет высокого уровня КІ67, PCNA, C-myc, Bcl-2, ЭФР, ИПФР-1, особенно в клетках периваскулярных зон, что и является основным условием роста данной опухоли. Стромообразование, гипертрофия лейомиоцитов и удлинение сроков их жизни также могут вносить вклад в увеличение размеров митотически активной Лм.
Важную роль в механизме роста Лм играют стромально-паренхиматозные взаимоотношения. Было отмечено, что разные гистологические типы Лм отличаются составом и количеством стромы. В простой Лм обнаруживается зрелая по составу строма с преобладанием коллагеновых волокон и клеток фибробластического ряда, для которой характерны вторичные изменения. В клеточной Лм строма представлена соединительной тканью с небольшим количеством коллагеновых волокон и сосудов. В митотически активной Лм количество стромы меньше по сравнению с паренхимой, она менее зрелая, с признаками неоангиогенеза и наличием «зон роста» клеток фибробластического ряда и лейомиоцитов вокруг сосудов.
Было отмечено, что при сочетании Лм с аденомиозом и гиперплазией эндометрия происходит усиление процессов пролиферации в опухолевых клетках по ауто- и паракринному механизмам.
Данные морфологического и иммуногистохимического исследований позволили выделить группу основных патологических процессов, участвующих в росте Лм: гипертрофию, пролиферацию и апоптоз лейомиоцитов, стромообразование, а также вторичные изменения в опухолях. В разных типах Лм соотношение этих процессов различно. При этом усиление экспрессии ЭФР, ИПФР-І приводит не столько к усилению пролиферации лейомиоцитов сколько к их гипертрофии.
Полученные результаты, показали, что при митотически активных и клеточных Лм, особенно при субмукозной локализации опухоли, обильные кровотечения встречаются чаще, чем при простых Лм. При этом экспрессия гепарин-связанных факторов роста в них выше, чем в простой Лм, что, вероятно, может способствовать не только неоангиогенезу в ткани Лм и в эндометрии, но и местной гипокоагуляции, что приводит к обильным кровотечениям.
Практическая значимость работы.
Результаты исследования могут быть использованы при определении тактики ведения больных с лейомиомой и определения прогноза заболевания. Полученные данные могут служить патогенетической базой для создания органосохраняющего лечения, особнно у женщин репродуїсгивного возраста, направленного на ингибицию ангиогенеза, пролиферации, гипертрофии лейомиоцитов и усиления в них апоптоза.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Простая, клеточная и митотически активная Лм отличаются
морфологическими особенностями строения и механизмами роста. Основные патологические процессы, участвующие в росте Лм это: пролиферация, гипертрофия и апоптоз лейомиоцитов, стромообразование и вторичные изменения в
11 опухоли. В разных типах Лм соотношение этих процессов различно.
Рост Лм связан с экспрессией факторов роста (ИПФР-1, ЭФР, ТцФР), онкопротеинов C-myc, Bcl-2, которые, судя по низкой экспрессии маркеров пролиферации КІ67 и PCNA, подтверждающих доброкачественный характер опухоли, приводят не столько к пролиферации лейомиоцитов, сколько к их гипертрофии. Максимальный уровень маркеров пролиферации наблюдается в митотически активной Лм и определяет рост данного типа опухоли.
Разные гистологические типы лейомиом характеризуются особенностями апоптоза в клетках опухоли. Самый высокий уровень апоптоза лейомиоцтов выявляется в простой Лм. Наименьший уровень апоптоза - в клеточных и митотически активных Лм, что может способствовать удлинению жизни лейомиоцитов и в сочетании с относительно высокой пролиферацией накоплению клеток и росту опухоли.
Соотношение процессов пролиферации и апоптоза лейомиоцитов в простой, клеточной и митотически активной Лм различно, что позволяет сделать вывод о разных механизмах их роста. Увеличение размеров простой Лм, является результатом не только пролиферации опухолевых клеток, но и их гипертрофии под влиянием ЭФР, ИПФР-1, а также пролиферации элементов стромы и ее вторичных изменений. Рост клеточной Лм связан с гипертрофией и увеличением количества лейомиоцитов, вероятно, за счет удлинения срока их жизни на фоне относительно низкого уровня апоптоза. Митотически активная Лм отличается
преобладанием процессов пролиферации над апоптозом опухолевых клеток, за счет высокого уровня КІ67, PCNA, С-тус, Вс1-2, ЭФР, ИПФР-1, особенно в клетках периваскулярных зон, что и является основным условием роста данной опухоли.
Внедрение результатов в практику.
Результаты исследований используются при чтении лекций и проведении практических занятий со студентами по темам: «Повреждение и гибель клеток и тканей», «Процессы адаптации», «Мезенхимальные опухоли» на кафедре патологической анатомии ММА им. И.М. Сеченова, а также в лечебно-диагностической работе в клиниках ММА им. И.М. Сеченова.
Апробация работы.
Апробация работы проведена 15 декабря 2004 года на заседании кафедры патологической анатомии ММА им. И.М.Сеченова. Результаты работы были доложены на 7 конгрессе Европейского общества клеточной патологии (апрель, 2001г., Франция), на конференции молодых ученых «Татьянин день» (январь, 1999г., Москва).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 6 работ, из них статей в центральных журналах - 1, тезисов в материалах научных конференций - 4 и публикаций в зарубежных изданиях - 1.
Объем и структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, трех глав (обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения), заключения, выводов и списка изпользованной литературы.
13 Текст диссертации изложен на 130 страницах машинописного текста, иллюстрирован 4 таблицами и 29 рисунками, в том числе цветным и монтажами микрофотографий. Библиографический указатель включает 119 источников.
Патогенез лейомиомы матки
При сравнении морфологических, гормонозависимых, биохимических свойств клеток нормального миометрия и Лм в различных исследованиях, стало ясно, что миоциты миометрия и Лм имеют ряд существенных отличительных признаков [10]. В дальнейшем было показано, что в развитии Лм придается большое значение различным цитогенетическим аномалиям. В клетках доброкачественных миом матки выявляются следующие хромосомные аномалии: делеция хромосомы 7, комплексные транслокации хромосом X, 5,14, и X, 3,14; инсерция участка хромосомы 4 на хромосому 1, делеция с вовлечением хромосомы 3, нереципрокная транслокация между хромосомой 14 и 15; моносомия хромосомы 22 с деривацией хромосомы 14; трисомия 7 [62,63,64]. По мнению J.M. Geurts et al. (1997), M.Nilbert et al. (1990), гены, расположенные в локусах 12q и 14q, могут играть важную роль в патогенезе миом.
Различия в характере мутаций доброкачественных миом и леиомиосарком позволяют предположить, что развитие узла изначально идет по одному из двух путей, и этот принцип можно применить для ранней диагностики и прогнозирования роста опухоли [65].
Имеется также ряд работ, в которых показана связь между размером лейомиоматозного узла и хромосомными абберациями (26).
Одним из центральных аспектов в проблеме патогенеза миомы матки занимает вопрос об особенностях гормонального статуса и функциональном состоянии репродуктивной системы по мере развития заболевания.
Проведенные исследования показали, что у 2/3 больных гормональные параметры менструального цикла не отличаются от соответствующих нормативных показателей. У больных с недостаточностью лютеиновой фазы и с ановуляторными циклами отмечаются изменения в содержании в крови ФСГ и ЛГ, зависящие в большей степени от функционального состояния репродуктивной системы, чем от наличия опухоли матки [49].
R. Maheux et al. (1988), M.N. Neuman et al. (1991), Y. Watanabe et al. (1992) сообщают, что назначение агонистов гонадолиберина (декапептид, образующийся в ядрах медиального гипоталамуса) приводит к существенному снижению уровней эстрогенов и прогестерона и уменьшению размеров миомы матки. Принято считать, что этот эффект обусловлен влиянием агонистов гонадолиберина на клетки-гонадотрофы аденогипофиза, секретирующие ФСГ и ЛГ. Однако в последние годы получены данные, в значительной мере дополняющие эту точку зрения. В своих исследованиях М. Marinaccio et al. (1994), обнаружили в ткани миоматозных узлов и нормального миометрия специфические точки связывания гонадолиберина, что указывает, по мнению авторов, на возможность прямого действия гонадолиберина и его агонистов на ткань миомы и миометрия [58].
Предполагается, что соматотропин (гормон роста) также может играть роль инициатора развития миомы матки. Это подтверждается тем, что у женщин с акромегалией чаще возникают миомы матки. Наличие мРНК-рецептора соматотропина в ткани миометрия и миомы подтверждает возможность действия соматотропина непосредственно на миометрий, а не через синтез в печени инсулиноподобного фактора роста 1 [66].
В последние годы появляется все больше исследований, посвященных пролактину. Исследуя особенности выделения пролактина при миоме матки, Е.М. Вихляева и соавт. (1997), Г.А. Паллади и соавт. (1986) установили, что у больных моложе 40 лет содержание пролактина в плазме находится в пределах доверительного интервала нормы здоровых женщин, а у больных старше 40 лет - в значительной мере превышает ее. Установлено, что клетки миомы матки также секретируют пролактин. Однако роль этого гормона в патогенезе миомы матки и его влияние на рост опухоли еще уточняются [67]. По данным Е.А. Stewart et al. (1996) блокатор прогестероновых рецепторов RU 486 подавляет синтез пролактина в миоматозных узлах и в нормальном миометрий. Авторы полагают, что поскольку RU 486 вызывает торможение роста миоматозных узлов у определенной группы больных, пролактин, наряду с прогестероном, может быть одним из факторов роста миоматозных узлов.
Традиционное мнение о ведущей роли эстрогенов в патогенезе миомы подтверждается данными современных исследований [60, 65]. Содержание рецепторов эстрадиола и прогестерона в ткани миомы выше, чем в неизмененном миометрии и подвержено циклическим изменениям [49]. После длительного лечения (3-4 месяца) агонистами гонадолиберина (гипоталамический рилизинг-фактор) отмечается уменьшение объемов миоматозных узлов и значительное снижение содержания рецепторов эстрогенов в миометрии и тканях миомы, что подтверждает гипотезу о роли эстрогенов в патогенезе миомы [68].
Содержание эстрогенов при миоме матки изучалось многими исследователями, однако выводы, к которым они пришли, оказались противоречивыми. Так, одни из исследователей наблюдали повышение уровня эстрогенов у больных с миомой матки, другие приводят данные о нормальном содержании эстрогенов и даже снижение их уровня [60, 69]. По мнению ряда исследователей [49,51] значение имеет не столько количество выделяемых эстрогенов, сколько нарушение их экскреции и метаболического превращения, а таюке нарушение качественного соотношения между фракциями эстрогенов. Проведенные Г.А. Паллади и соавт. (1986) исследования показали, что экскреция эстрогенов в суточной моче у больных миомой матки зависит от величины опухоли и характера менструального цикла. При этом авторы отмечают, что преобладающей фракцией эстрогенов является эстриол, эта особенность значительно выражена у больных с тенденцией к росту опухоли. Авторы считают, что преобладание эстриола в сумме эстрогенов приводит к более выраженным изменениям миометрия, о чем свидетельствует появление быстрорастущих миом без нарушения менструального цикла. При повышенном содержании эстрадиола повреждается эндометрий и клиническая картина характеризуется небольшими размерами опухоли и кровотечениями.
Клиническая характеристика и диагностика лейомиомы матки
Наиболее характерными клиническими проявлениями, сопутствующими росту и развитию опухоли, являются кровотечения, боль, ощущение тяжести и давления внизу живота, которые выявляются по мере роста опухоли. В процессе развития опухоли к указанным симптомам могут добавляться проявления как вторичных дегенеративных и воспалительных процессов в ткани опухоли, так и общих системных изменений. Однако далеко не у всех женщин развитие Лм сопровождается четко определенными клиническими симптомами и почти у каждой 3-й больной опухоль выявляется лишь при гинекологическом исследовании или оказывается случайной находкой при лапароскопической операции.
Клиника заболевания во многом зависит от расположения, величины и направленности роста узлов. При формировании подбрюшинных узлов опухоли (чаще на широком основании, реже на ножке, через которую проходят питающие опухоль сосуды) ни сократительная функция миометрия, ни характер менструального кровотечения обычно не меняются. Возникновение болей у ряда больных с подбрюшинной формой опухоли чаще объясняется сдавлением соседних органов, растяжением за счет опухоли серозного покрова матки, натяжением или частичным перекрутом ножки опухоли, и в отдельных случаях при возникновении осложнений (некроз, перекрут ножки узла, сращение последнего с тазовой брюшиной) развивается клиника "острого живота".
Миоматозные узлы, исходящие из передней стенки матки (даже небольшой величины), могут давить на область шейки мочевого пузыря и треугольника Льето и приводить к дизурическим расстройствам. При развитии подбрюшинного узла на задней стенке матки над областью внутреннего зева рост узлов может происходить ретроцервикально, приводить к заполнению опухолью всей полости малого таза, со сдавлением прямой кишки, смещением тела матки к симфизу и смещением уретры, вследствие чего образуется задержка мочи и перерастяжение мочевого пузыря. Подобное расположение узлов механически затрудняет акт дефекации, приводит к возникновению хронического запора с последующим застоем кровообращения в венозных сосудах малого таза и развитию геморроя. Рост миоматозных узлов может способствовать тромбозу вен малого таза. Давление узлов на подвздошную и нижнюю полую вены иногда ведет к застою и расширению вен нижних конечностей. Узлы опухоли могут сдавливать крестцовые нервы и вызывать боль в пояснице с иррадиацией в нижние конечности, вызывая корешковые боли (вторичный ишиас).
При интрамуральном или межмышечном расположении узлов происходит увеличение объема полости и площади поверхности эндометрия над узлами опухоли, что приводит к нарушению регионарного кровообращения, продолжительности менструации. Из вторичных изменений при этой форме опухоли чаще наблюдается отек узла, нередко с последующим гиалиновым перерождением стенок сосудов и полным их запустеванием. При длительном нарушении микроциркуляции в ткани опухоли с явлениями отека развивается асептический некроз, с последующим образованием полостей, содержащих серозную жидкость и остатки некротической ткани. При частичном или полном некрозе в узле развивается отек, пальпация опухоли вызывает резкую болезненность, отмечается повышение температуры. Осложнения подобного рода нередко возникают во время беременности или после родов.
Подслизистые узлы деформируют полость матки, они связаны со стенкой матки широким основанием или, разрастаясь и, как бы отшнуровываясь, сохраняют с ней связь на тонкой мышечной ножке (стебельчатая Лм). В дальнейшем по мере роста, а также из-за неизбежных сокращений миометрия ножка истончается, удлиняется и узел постепенно смещается в нижние отделы матки. Клиника этой формы расположения узлов у подавляющего большинства больных характеризуется кровотечением по типу мено-, метроррагий. К типичным клиническим проявлениям подслизистой миомы матки относится также наличие схваткообразных болей внизу живота и в пояснице. При некрозе субмукозного узла появляются жидкие, бурые выделения со зловонным запахом. Рождающийся миоматозный узел с явлениями некроза может быть ошибочно принят за саркому матки или неполный аборт.
Самым частым симптомом миомы является кровотечение. При нормальной менструации величина кровопотери составляет 60-80 мл, наличие менометроррагий приводит к увеличению объема кровопотери свыше 80 мл и развитию железодефицитной анемии, столь часто встречающейся при миоме матки, иногда даже до момента выявления опухоли. Причины кровотечений при миоме матки разнообразны: нарушение сократительной способности миометрия; возрастание площади эндометрия по мере роста опухоли; изъязвление эндометрия при подслизистой миоме; нарушение кровообращения в толще мышечной оболочки; нарушение процесса отслойки эндометрия, обусловленное нарушением гормональной регуляции.
Tunel-метод in situ labeling hybridization для выявления апоптоза
Апоптоз оценивали с помощью Тшіеі-метода in situ labeling hybridization (ENZO ApopDETEK Cell Death Assay System). С помощью TUNEL-метода (terminal deoxyribonucleotidil transferase - mediated dUTP nickend labeling) удается получить реальное представление об интенсивности процессов апоптоза в ткани, а также выявить клетки, содержащие разрывы в ДНК. Метод обнаружения ранних стадий структурных изменений хроматина осуществляется путем присоединения меченного олигонуклеотида (Bio-16-dUTP) на 3 -ОН - конец ДНК с помощью терминальной дезоксинуклеотидил трансферазы при использовании ApopDETEK теста (ENZO ApopDETEK Cell Death Assay System). Для визуализации реакции использовалась метка - фермент пероксидаза хрена в присутствии субстрата пероксида водорода и колориметрического реактива 3,3-диаминобензидина (ENZO Simply Sensitive Horsradish Peroxidase-DAB In Situ Detection System). В качестве контрастирующего вещества применяли гематоксилин (табл. 4).
Результаты апоптоза представлены в виде процента выявленных апоптозных телец на 3000 клеток с вычислением среднего арифметического и стандартного отклонения.
Проводился статистический анализ полученных результатов. Среднеквадратическая (стандартная) ошибка и доверительные интервалы средних арифметических величин оценивались по таблицам Р.Б. Стрелкова [28]. Уровень значимости доверительного интервала был взят р=0,05, при котором степень достоверности воспроизведения оцениваемого явления равняется 95%. Проводился корреляционный анализ с вычислением коэффициента корреляции.
Молекулярно-биологические особенности лейомиомы матки
КІ67 - ядерный белок, который играет главную роль в поддержании клеточной пролиферации. Процент КІ67 положительных клеток выявляет растущую фракцию. Однако следует отметить, что КІ67 определяется во всех фазах клеточного цикла за исключением S фазы [75]. Поэтому, истинный уровень пролиферации в опухоли всегда выше, чем экспрессия КІ67. Пик уровня экспрессии КІ67 обычно наблюдается в М фазе.
Продукт реакции КІ67 обнаруживается в ядрах отдельных лейомиоцитов и клеток стромы: в перицитах вокруг сосудов синусоидного типа (в «зонах роста»), в ядрах железистых и эпителиальных клеток эндометрия и очагов аденомиоза, фибробластов и макрофагов (рис. 6 а,б).
Уровень КІ67 в ткани Лм в целом достаточно низкий и колеблется от 0,1% до 1,2%. Однако в клетках Лм всех гистологических типах КІ67 достоверно выше по сравнению с окружающим миометрием, что согласуется с данными литературы [4].
При исследовании КІ67 продукт реакции обнаруживается в основном в митотически активной и клеточной Лм. Средний уровень КІ67 в простой Лм в лейомиоцитах равен 0,1%±0,05%, тогда как в строме 0,4%±0,05%.
Экспрессия КІ67 в клеточной и митотически активной Лм отмечается в основном в паренхиме опухоли и достоверно выше по сравнению с простой (0,27%±0,05%; 1,20%±0,05%). Митотически активная Лм превосходит клеточную как по количеству очагов пролиферации, так и по среднему показателю уровня экспрессии маркера (1,2% и 0,27% соответственно) (рис. 7). При этом КЇ67 не выявляется в окружающем Лм миометрии, а в секреторном эндометрии определяется на сравнительно низком уровне, как в клетках стромы, так и эпителия. В гиперплазированном эндометрии средний уровень экспрессии КІ67 составляет 2 % в эпителии и строме. PCNA — ядерный белок, повышение уровня его экспрессии начинается в поздней G1 фазе митотического цикла и достигает максимума в S фазе в пролиферирующих клетках, в других клетках он не определяется [68]. По уровню экспрессии PCNA можно судить о пропорции пролиферирующих клеток в нормальных и опухолевых клетках [98]. Также было показано, что PCNA участвует в репарации ДНК [81,98].
Экспрессия PCNA отмечается в ядрах лейомиоцитов и клеток стромы: в перицитах вокруг сосудов синусоидного типа (в «зонах роста») особенно в подкапсулярной зоне узлов, в ядрах железистых и эпителиальных клеток эндометрия и очагов аденомиоза, фибробластов и макрофагов (рис. 8а,б). PCNA обнаруживается в больших количествах по сравнению с 161, но повторяя те же закономерности распределения и количественных различий (рис. 9).
Процент PCNA положительных клеток всегда выше по сравнению с КІ67. Разница между экспрессией PCNA и КІ67 - A (%+PCNA клеток -%+Кі67клеток) отражает процессы репарации ДНК, которые наиболее активно идут в клеточных и митотически активных Лм и в группе сочетания с аденомиозом, что также согласуется с данными литературы, в которых указано, что эстрогены понижают экспрессию PCNA (рис.10).
Полученные результаты показали, какие клетки и в каких типах Лм пролиферируют. При этом пролиферирующие клетки в основном располагаются в периваскулярных зонах в основном в подкапсулярной зоне узла Лм. Пролиферативная активность по КІ67 и PCNA невысока и отмечается в основном в митотически активных и меньше в клеточных Лм. Следует отметить о несоответствии между количеством митотических фигур и уровнем маркеров пролиферации. В литературе этот факт объясняется тем, что клетки вступают в S фазу митотического цикла, который прерывается или растягивается во времени [11].
