Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1 .Эпидемиологические данные о гиперплазии эндометрия и аденокарциноме эндометрия
1.2. Классификация и воспроизводимость диагнозов ГЭ 12
1.2.1 .Определение и исторические подходы к наименованию гиепрпластических процессов слизистой тела матки
1.2.2.Воспроизводимость современной классификации! ГЭ (ВОЗ, 2003)
1.3 .Этиология ГЭ 19
1 АПатогенез ГЭ 22
1.5. Особенности реализации сигнальных путей системы рецептора инсулиноподобного фактора роста I типа в эндометрии в норме и при ГЭ. «Мишени» триггерных мутаций для развития гиперпластических процессов и предраковых изменений слизистой тела матки
1.6. Потенциально эффективные иммуногистохимические маркеры для диагностики ГЭ
Глава 2. Материал и методы исследования
2.1. Материал и критерии отбора больных 50
2.2. Методы исследования 52
2.2.1. Морфологический метод исследования 52
2.2.2. Иммуногистохимические методы исследования 52
2.2.3. Статистические методы исследования 57
Глава 3. Результаты собственного исследования и их обсуждение
3.1. Оценка воспроизводимости диагнозов ГЭ 58
3.1.1. Оценка воспроизводимости диагнозов ГЭ согласно классификации ВОЗ (2003)
3.1.2. Оценка воспроизводимости диагнозов ГЭ по упрощенной бинарной классификации
3.2. Иммуногистохимическая характеристика гиперпластических изменений и предраковых состояний эндометрия
3.2.1. . Иммуногистохимическая характеристика рецепторов к стероидным гормонам в неизмененном и патологически измененном эндометрии
3.2.2. Иммуногистохимическая характеристика процессов пролиферации и апоптоза
3.2.3 Иммуногистохимическая характеристика компонентов IGF-IR- зависимого сигнального пути
Глава 4. Общее заключение 108
Выводы 111
Список литературы
- Классификация и воспроизводимость диагнозов ГЭ
- Особенности реализации сигнальных путей системы рецептора инсулиноподобного фактора роста I типа в эндометрии в норме и при ГЭ. «Мишени» триггерных мутаций для развития гиперпластических процессов и предраковых изменений слизистой тела матки
- Иммуногистохимические методы исследования
- Оценка воспроизводимости диагнозов ГЭ согласно классификации ВОЗ (2003)
Введение к работе
Актуальность проблемы. Гиперплазия эндометрия (ГЭ) представляет собой гетерогенную группу патологических изменений слизистой тела матки, часть которых является предшественником аденокарциномы эндометрия (АКЭ).
Актуальность проблемы диагностики и лечения ГЭ в настоящее время связана с ростом заболеваемости гиперплазии эндометрия и аденокарциномы. ГЭ диагностируется у 6 - 50% женщин (Насырова И. Н., 2007; Чернуха Г.Е.; 2009; Кузнецова И.В., 2010), а заболеваемость АКЭ составляет более 24,8 на 100 000 человек (Табакман Ю.Ю., 2009). По данным патологоанатомического отделения Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии за последние 5 лет также наблюдался рост заболеваемости ГЭ (для простой ГЭ - с 45 случаев до 72, для сложной ГЭ - с 10 до 29, для простой атипической - с 4 до 7, для сложной атипической с 5 до 18), а также АКЭ (с 3 до 8 случаев). При этом известно, что риск развития АКЭ на фоне ГЭ выше, чем в популяции, и он увеличивается с усилением тяжести ГЭ. Таким образом, выявление ГЭ на ранних этапах развития является одним из главных мероприятий, позволяющих снизить заболеваемость и выживаемость при АКЭ. Кроме того, актуальность проблемы связана с нередким рецидивирующем течением ГЭ, дифференциально-диагностическими трудностями, возникающими в отношении некоторых вариантов данной патологии, а также большим числом женщин репродуктивного возраста, страдающих ГЭ и нуждающихся в сохранении репродуктивной функции.
Известно, что «золотым стандартом» диагностики ГЭ является гистологическое исследование, однако эффективность верификации ГЭ остается невысокой. В настоящее время в качестве наиболее эффективных методов улучшения диагностики ГЭ рассматриваются модификация действующей классификационной системы (ВОЗ, 2003) и внедрение в практику молекулярных и иммуногистохимических (ИГХ) методов исследования,
На основании нескольких крупных исследований, проведенных в Европе и США (Skov В., 1997; Bergeron С. 1999; Zaino R., 2006; Narges I., 2009) показано, что наиболее приемлемым было бы введение двух групп вместо четырех, что не только облегчило бы диагностику среди патологов и повысило бы воспроизводимость их диагнозов, но и привело бы к улучшению взаимопонимания между клиницистами и патологами, в большей мере структурировало бы тактику ведения пациенток с ГЭ.
В настоящее время известно, что экспрессия маркеров, которые предложены для улучшения диагностики ГЭ, изменяется уже на ранних этапах канцерогенеза (при развитии ГЭ без атипии), хотя наиболее выраженной она становится при атипической ГЭ. Согласно данным литературы, при развитии предраковых состояний слизистой тела матки изменяется экспрессия рецепторов к стероидным гормонам, генов-супрессоров опухолевого роста (PTEN, р53), генов-регуляторов клеточного цикла (Cyclin D1), факторов роста (IGF I, EGF) и их рецепторов, вторичных мессенджеров сигнальных путей (РОК, Akt) (Lax S., 2007; Banzai N. ,2009; Llobet D., 2009). Также установлено, что при прогрессии ГЭ изменяется пролиферативная активность клеток и их запрограммированная гибель (Risberg В., 2002; Altaner S., 2006;Horree N., 2007). Однако, эффективность применения отдельных маркеров и их сочетаний для диагностики ГЭ все еще остается недостаточно изученной, как и молекулярно-биологические механизмы, которые способствуют развитию ГЭ без атипии, атипической ГЭ и АКЭ.
Цель исследования состояла в улучшении диагностики гиперпластических процессов и предраковых состояний эндометрия на основании модификации действующей классификационной системы гиперплазии эндометрия (ВОЗ, 2003) и молекулярно-биологические аспектов ее патогенеза
Для осуществления цели были поставлены следующие задачи: 1. Определить воспроизводимость современной классификации гиперплазии эндометрия (ВОЗ, 2003).
2.0пределить воспроизводимость модифицированной бинарной
классификационной системы гиперплазии эндометрия.
3. Изучить показатели экспрессии рецепторов к стероидным гормонам и
соотношение процессов пролиферации и апоптоза при различных формах
гиперплазии эндометрия и аденокарциномы эндометрия.
-
Изучить экспрессию компонентов сигнального пути рецептора к инсулиноподобному фактору роста первого типа (PTEN, IGF I и его рецептор) на разных этапах канцерогенеза в эндометрии.
-
Сравнить экспрессию иммуногистохимических маркеров в различных вариантах гиперплазии эндометрия, выяснить молекулярно-биологические особенности канцерогенеза в эндометрии и на их основании предложить диагностическую панель гиперплазии эндометрия.
Научная новизна.
Впервые оценена воспроизводимость бинарной системы классификации ВОЗ, предполагающей объединение простой и сложной ГЭ без атипии, а также простой и сложной атипической ГЭ. Установлены молекулярно-биологические особенности вариантов ГЭ и АКЭ и на их основе разработаны механизмы канцерогенеза в эндометрии. Выявлены достоверные различия в экспрессии рецепторов к стероидным гормонам между гиперпластическими изменениями и предраковыми состояниями слизистой тела матки, а также отмечено более плавное усиление процессов пролиферации, а также резкое снижение апоптоза при предраковых состояниях слизистой тела матки. Отмечается важная роль снижения апоптоза при увеличении тяжести ГЭ по сравнению с усилением интенсивности процессов пролиферации. Впервые показано, что совместное определение числа PTEN-позитивных эндометриальных желез, интенсивности экспрессии PTEN и локализации его распределения повышает эффективность диагностики патологических изменений в слизистой тела матки. Выделены группы маркеров, экспрессия которых коррелирует друг с другом и таким образом повышает чувствительность применения предложенной диагностической иммуногистохимической (ИГХ)-панели для верификации ГЭ.
Практическая значимость
Применение модифицированной (бинарной) классификации ГЭ позволяет существенно повысить воспроизводимость патологоанатомических диагнозов и оптимизировать тактику ведения пациенток с ГЭ клиническими специалистами.
Использование ИГХ-панели, включающей определение рецепторов к стероидным гормонам, Ki-67, Bcl-2, PTEN и рецептора к IGF-I дает возможность более точно верифицировать варианты ГЭ. Снижение экспрессии ER-a, PgR, Ki-67, Bcl-2, PTEN по сравнению с неизмененным эндометрием характерно для о ГЭ низкой степени тяжести; усиление экспрессии ER-a, Ki-67, Bcl-2, IGF-IR и снижение экспрессии PgR и PTEN по сравнению с доброкачественными изменениями слизистой тела матки- свидетельствует о ГЭ высокой степени риска развития АКЭ.
Результаты исследования могут быть использованы в педагогическом процессе в соответствующих разделах курсов патологической анатомии и гинекологии для студентов медицинских ВУЗов и в постдипломном обучении патологоанатомов и гинекологов.
Положения выносимые на защиту
-
Воспроизводимость современной классификации (ВОЗ, 2003), выделяющей четыре варианта гиперплазии эндометрия, существенно ниже (на 18%), чем предполагающей выделение двух вариантов гиперплазии эндометрия бинарной модифицированной классификационной системы, что позволяет рекомендовать последнюю для улучшения эффективности диагностики ГЭ.
-
Гиперплазия эндометрия без атипии отличается от атипической гиперплазии эндометрия рецептивностью слизистой тела матки в отношении стероидных гормонов: атипической гиперплазии эндометрия свойственна повышенная экспрессия эстрогеновых рецепторов типа альфа и снижение экспрессии прогестероновых рецепторов. При развитии аденокарциномы эндометрия отмечается снижение экспрессии как эстрогеновых, так и прогестероновых рецепторов.
-
Гиперпластически измененная слизистая тела матки, предраковые состояния эндометрия и аденокарцинома эндометрия отличаются между собой нарушениями баланса между процессами пролиферации и апоптоза.
-
Развитие последовательных стадий канцерогенеза в эндометрии сопровождается нарушением регуляции сигнального пути рецептора к инсулиноподобному фактору роста первого типа, что выражается в:
постепенном снижение экспрессии опухолевого супрессора PTEN от простой к сложной гиперплазии эндометрия и далее к атипической гиперплазии эндометрия и аденокарциноме эндометрия, уменьшении интенсивности окрашивания, а также в изменении локализации экспрессии PTEN с ядерной, характерной для нормальной слизистой тела матки и гиперплазии эндометрия на цитоплазматическую в клетках аденокарицномы эндометрия,
отсутствии различий в экспрессии инсулиноподобного фактора роста первого типа между вариантами гиперплазии эндометрия и усилении его экспрессии при аденокарциноме эндометрия по сравнению с атипической гиперплазией эндометрия,
усилении экспрессии рецептора к инсулиноподобному фактору роста первого типа при атипической гиперплазии эндометрия по сравнению с гиперплазией эндометрия без атипии.
Апробация работы
Материалы и основные положения диссертации были доложены и обсуждались на V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (май 2008), X международном форуме «Мать и дитя» (Москва, октябрь 2009), IV международном конгрессе по репродуктивной медицине (январь 2010), межлабораторной концеренции Учреждения Российской академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт морфологии человека РАМН» (ноябрь 2010).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 3 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации
Классификация и воспроизводимость диагнозов ГЭ
Гиперпластические изменения эндометрия представляют собой-гетерогенную группу патологических изменений слизистой тела матки, часть которых является предшественником аденокарциномы. В: связи с актуальностью проблемы диагностики и лечения ГЭ.; улучшение эффективности диагностики ГЭ, воспроизводимости диагнозов Э среди морфологов и выявление факторов прогноза- в настоящее время являются проблемой номер: один; для: гинекологических патологов: во всем- мире. В последние десятилетия опубликовано большое число работ, посвященных данной проблеме. Их анализ выявляет значительные трудности, связанные с отсутствием среди; патологов-единых критериев? оценки/ состояния патологических- изменений эндометрия, а среди гинекологов - единых принципов терапии больных с гиперпластическими: изменениями и предраковыми состояниями слизистой тела матки. Вместе с темг в настоящее время, благодаря; использованию молекулярно-биологических методов, морфо- и стереометрии и. других современных методов исследования, отмечается прогресс в понимании; не только патогенеза пролиферативных поражений, слизистой тела матки, но и канцерогенеза в эндометрии. пегтапМ., 2000).
Слизистая, тела; матки является многокомпонентной системой!, все клеточные элементы которой на протяжении менструального цикла; и при ановуляции находятся под воздействием: овариальных гормонов, и ежедневно подвергаются структурно-функциональным изменениям. Как известно, гиперплазия характеризуется повышением числа клеток в ткани или органе, что приводит к увеличению объема данного анатомического образования. Гиперпластические поражения эндометрия, которые развиваются преимущественно в условиях относительной и/или абсолютной гиперэстрогении, характеризуются разнообразием в: отношении распространенности поражения, распределения и конфигурации маточных желез, функционального состояния железистого эпителия, изменений стромального и сосудистого компонентов. (Кондриков Н.И., 2008). Эта гетерогенность является одной из причин существования многочисленных наименований гиперпластического процесса, причем оценка структурных сдвигов в гиперплазированном эндометрии производится на основании субъективных морфологических критериев, часто выработанных преимущественно на основании личного опыта работы в области гинекологической патологической анатомии.
В прошлом в отношении гиперпластических изменений эндометрия применяли такие наименования как доброкачественная гиперплазия, железистая (железисто-кистозная) и простая гиперплазия, смешанная кистозная и аденоматозная гиперплазия, гиперплазия с минимальной, умеренной и выраженной атипией клеток, аденоматозная гиперплазия нерезкой и выраженной формы или I-III степени тяжести, атипическая гиперплазия «архитектурная» без и с атипией клеток, аденоматозная атипическая гиперплазия с патологией архитектуры и эпителиальных клеток и другие. По аналогии с цервикальной интраэпителиальной неоплазией предлагались также термины интраэндометриальная неоплазия (IEN) (Fox Н., 1982), железистая интраэпителиальная неоплазия (GIN) (Ruffold Е., 1983) и эндометриальная интраэпителиальная неоплазия (EIN) (Mutter G., 2007). Следует отметить, что разные исследователи при сходной морфологической картине пользовались различной терминологией и, наоборот, употребляли идентичные наименования применительно к разным структурным особенностям патологически измененного эндометрия. Не было однозначным и отношение исследователей к понятиям аденоматозной- и атипической гиперплазии: одни использовали их только при структурной перестройке маточных желез, другие - применительно к гиперплазированному эндометрию с пролиферацией и/или атипией железистого эпителия (независимо от конфигурации маточных желез). Тем не менее, несмотря на противоречия в терминологии предпринимались многочисленные попытки создания классификации ГЭ. Campbell и соавт. (Campbell Р., 1961) выделяли доброкачественную гиперплазию, атипическую гиперплазию I, II и III типов, Beutler и соавт. (Beutler Н., 1963) предлагали различать кистозную пролиферацию, железистую гиперплазию и железистую гиперплазию с атипической пролиферацией эпителия. Gore и соавт. (Gore Н., 1966) разделяли ГЭ на кистозную гиперплазию, аденоматозную гиперплазию, анаплазию и карциному in situ. Hendrickson и соавт. (Hendrickson М., 1982) предлагали выделять гиперплазию без атипии и гиперплазию с легкой, умеренной и тяжелой атипией. Приведенные наименования патологических изменений слизистой тела матки применяли несмотря на рекомендации ВОЗ (1975 г.) различать кистозную, аденоматозную и атипическую гиперплазию эндометрия (Poulsen Н. 1975).
Следует согласиться с тем, что анархия в классификациях гиперпластических поражений эндометрия была обусловлена не только вариабельностью терминологии, понятий и различиями в концепциях, но и отсутствием у патологов стремления к согласию в отношении критериев патологических изменений эндометрия (Fox H., 1982.)
В 1994 г. ВОЗ предложила выделять простую и сложную гиперплазии и простую и сложную атипическую гиперплазии эндометрия. В соответствии с данной классификацией простая гиперплазия эндометрия в структурном отношении соответствует железистой (железисто-кистозной) гиперплазии слизистой тела матки, сложная ГЭ отличается более компактным расположением желез преимущественно причудливой формы. Железистый эпителий при простой и сложной ГЭ в функциональном отношении соответствует таковому слизистой тела матки ранней — поздней стадии пролиферации у женщин с регулярным менструальным циклом. Простая атипическая ГЭ в структурном отношении имеет некоторое сходство со сложной ГЭ, но отличается более интенсивной пролиферацией железистого эпителия, не свойственной эндометрию ранней - поздней стадии пролиферации и простой и сложной гиперплазиям слизистой тела матки, тогда как при сложной атипической ГЭ наблюдается атипия ядер клеток железистого эпителия в сочетании с изменениями их тинкториальных свойств. (Scully R., 1994).
Особенности реализации сигнальных путей системы рецептора инсулиноподобного фактора роста I типа в эндометрии в норме и при ГЭ. «Мишени» триггерных мутаций для развития гиперпластических процессов и предраковых изменений слизистой тела матки
Микросателлитные последовательности ДНК представляют собой последовательности состоящие из многократно повторяющегося элемента (мотива), например ди-, три-, тетрануклеотида, более или менее случайно разбросанные по геному. Микросателлитная нестабильность (MSI) представляет собой нарушение репарации ДНК. MSI это часто встречающееся повреждение в эндометриоидных АКЭ (20-45%) по сравнению со смешанными и особенно с неэндометрилидными АКЭ (0-5%) (Matias-guiu X., 2001; Prat J., 2007; Llobet D., 2009,) В спорадических АКЭ эпигенетической причиной MSI наиболее часто становится недостаточность MMR вследствие гиперметилирования соответствующих генов (Catasus L., 2009). Такая эпигенетическая инактивация часто встречается при атипической ГЭ, что свидетельствует о том, что гиперметилирование предшествует MSI и происходит на ранних этапах неопластической трансформации (Prat J., 2007, Catasus L., 2009)
5. Экспрессия инсулиноподобных факторов роста и их рецепторов. Интерес к белкам IGF патогенезе рака эндометрия, проявленный исследователями в последние годы во многом объясняется тем, что регуляторные пути, компоненты которых уже рассматривались выше, имеют своим верхним регуляторным звеном именно IGF и рецептор к IGF I. Так как мутации расположенных ниже в структуре сигнальных путей компонентов выялялись в достоточно большом проценте ГЭ, АГЭ и АКЭ (это касается и PTEN, и KRAS, и р-катенина и РІЗК/Akt, то регуляция тех процессов, в которых они принимают участие неизбежно должна и затрагивать и IGF, а также IGF-I по механизмам обратной связи, а также посредством эстрогена и других гормональных и ростовых факторов. Так, по мнению некоторых авторов, автономная или индуцированная эстрадиолом и тамоксифеном продукция ИФР-І и/или ИФР-П гиперплазированным эндометрием или опухолью при наличии IGF-IR в тканях может приводить к избыточной пролиферации клеток, их пониженной чувствительности к проапоптотическим стимулам и повышенной клеточной подвижности. В опухолевых клетках такие события могут привести к значительной инвазии в нормальные ткани и отдаленному метастазированию; Существенную роль в регуляции биодоступности ИФР отводят IGFBPSJ экспрессияжоторых,- в свою; очередь, регулируется эстрогенами, прогестероном; специфическими протеазами и самими ИФР.(Бочкарева Н.В., 2008) Заключение к обзору литературы В настоящее время профилактика развития гиперпластических изменений и предраковых состояний является одним из наиболее приоритетных направлений в области гинекологии. В последнее десятилетие наблюдается рост заболеваемости ГЭ как в России, так ив Европейских странах и США. И это значит, что не только растет число женщин, страдающих мено-и метроррагией, дисменореей, бесплодием, женщин со сниженным качеством жизни, но и увеличивается риск развития АКЭ, так как в зависимости от формы ГЭ частота ее перехода в АКЭ составляет от 1 до 29%. Это отражают данные, касающиеся заболеваемости АКЭ - данная патология занимает в России 2-ое место среди причин смертности среди женщин, уступая лишь раку молочной железы;
Известно, что «золотым стандартом» постановки диагноза ГЭ и АКЭ является гистологическое исследование. Вот почему улучшение диагностики различных форм ГЭ среди патологов, увеличение показателя воспроизводимости диагнозов ГЭ и улучшение взаимопонимания между патологами и гинекологами являются одной из базовых-задач на пути решения проблемы профилактики: и лечения ГЭ и АКЭ. Обзор литературных данных показал, что для решения данной проблемы существует несколько путей: усиление материальной базы патологанатомических отделений (введение компьютерной морфометрии и дополнительных специалистов для проведения стандартизованных исследований эндометрия), модификация существующей классификации ГЭ для упрощения постановки диагноза и увеличения показателя воспроизводимости, стандартизация тактики лечения в зависимости от формы ГЭ, разработка панели иммуногистохимических маркеров для более точной верификации диагноза, которая впоследствии может быть также-использована для прогностических целей, а также в качестве дополнительного способа контроля за индивидуальным лечением. Какой из этих методов или их сочетаний окажется наиболее эффективным, могут показать только мультицентровые исследования, охватывающие большое число пациенток и включающие проспективную составляющую наблюдений.
Однако уже в настоящее время доступны некоторые данные о положительном результате модификации современной классификации ВОЗ, выражающиеся в улучшении воспроизводимости диагнозов (Bergeron С, 1999; Scov В., 2004; Narges I., 2009;). Кроме того, проведено огромное число исследований экспрессии различных маркеров, а также повреждений в кодирующих их генах, что позволило пролить свет на некоторые этапы патогенеза-ГЭ и АКЭ и выделить перспективные маркеры для диагностической и прогностической целей. Некоторые этапы патогенеза ГЭ по-прежнему остаются неизученными, однако следует указать на остающуюся несомненно важной роль относительной/абсолютной- гиперэстрогении в- инициации развития гиперпластических изменений и предраковых, состояний слизистой тела матки, которые известны на протяжении уже многих десятилетий; и наряду с этим - на большое значение молекулярных и генетических нарушений, которые были выявлены сравнительно недавно и которые играют важную роль в нарушении нормального функционирования различных сигнальных путей в клетках эндометриальной стромы и железистого эпителия. Гормональная регуляция этих путей тесно связана с регуляцией на пара-и аутокринном уровне, что лежит В основе многочисленных положительных и отрицательных обратных связей, которые характерны для сигнальных путей, участвующих в регуляции метаболизма клеток компонентов эндометрия, (схемы 1,2) Посредством этих связей осуществляется дублирующая регуляция, которая, возможно, является одним из механизмов защиты нормального функционирования данных путей, предотвращая инициацию гиперпластических и/или неопластических процессов в слизистой тела матки при поломке какого-либо звена.
Иммуногистохимические методы исследования
Для морфологического исследования использовались соскобы эндометрия, полученные в результате диагностического выскабливания слизистой тела матки. Полученный материал фиксировали в 10% нейтральном формалине с фосфатным буфером, обрабатывали в аппарате гистологической проводки тканей фирмы Shandon и заливался в парафин. Суммарное время фиксации, проводки и заливки материала, как правило, не превышало 48 часов. Затем готовились парафиновые срезы толщиной 4-5 микрон. Срезы фиксировали на предметные стекла и инкубировали в термостате при 37С в течение 12 часов. Далее срезы обрабатывали в автомате окраски гистологических/цитологических препаратов и заключали под покровное стекло.
Для иммуногистохимического исследования использовались 7 коммерческих моно- и поликлональных антител к рецепторам стероидных гормонов - эстрогеновым ER и прогестероновым PgR, маркеру пролиферативной активности Кі-67, маркеру апоптоза Вс1-2, супрессору опухолевого роста PTEN, инсулиноподобному фактору роста I типа (IGF I) и рецептору к IGF I (IGF-IR).
IGF-IR(Tyr 1116) поликлональные Santa Cruz Biotechnology, Inc. (США) 1:50 121С,рН 6.0, цитратный буфер Материал для исследования методами иммуногистохимии фиксировали 10% нейтральным формалином в течение 24 ч., заливали в парафин, готовили срезы толщиной 4 мкм, которые наносили на высокоадгезивные стекла и высушивали при температуре 37С в течение 18ч часов. Восстановление антигенной активности проводили в миниавтоклаве «21 OORetrieval» («Pick Cell») при температуре 121 С в течение 20 мин. и последующим остывании 90 мин. Остывшие стекла помещали во влажные камеры (для предотвращения высыхания срезов) и инкубировали 15 минут с 3% раствором перекиси водорода. Восстановление проводили в цитратном буфере рН 6,0. В качестве детекционной системы применяли систему «EnVision» («Dako Cytomation»), в качестве хромогена - диаминобензидин и АЕС. Для получения результатов пригодных для количественной обработки реакции проводили с помощью автоматического иммуногистостейнера «Autosteiner Dako».
Для ИГХ реакций ставили положительные и отрицательные контроли. В качестве отрицательных контролей брали образцы исследуемых срезов, которые подвергались стандартной процедуре иммуногистохимии, но без добавления первичных антител. Положительные контроли для каждого антитела выбирали в соответствии со спецификациями от фирмы производителя. (Препарат протокового рака молочной железы для ERa, препарат рака молочной железы для PgR, препарат миндалины для Ki-67, препарат фолликулярной лимфомы для Вс1-2, препарат здоровой молочной железы для PTEN, препарат поджелудочной железы, содержащей (3-клетки для IGF-I, препарат предстательной железы для IGF-IR.
Для оценки показателя воспроизводимости диагнозов к были применены следующие критерии: 0,00-0,20-очень низкая, 0,21-0,40-низкая, 0,41-0,60-средняя, 0,61-0,80-высокая, 0,81-1,00-очень высокая; для конкордантности: 0-20%-очень низкая, 21-40%-низкая, 41-60%-средняя, 61-80%-высокая, 81-100%-очень высокая. Оценка результатов ИГХ-исследования проводилась несколькими способами: Интенсивность реакций, в результате которых выявлялось цитоплазматическое окрашивание (Bcl-2, IGF I, IGF-IR, PTEN) оценивали полуколичественным способом по балльной шкале от О до 3 (О-отсутсвие экспрессии, 1-слабая, 2 - умеренная, 3 - сильная экспрессия) оценка экспрессии Ki 67 производилась методом подсчета количества окрашенных ядер на 100 клеток в 3 полях зрения, результат выражался в процентах и оценивался по принятой шкале: 1) 0%-20% - низкая пролиферативная активность, 2) 21%-50% - умеренная пролиферативная активность, 3) 51%-100% - высокая пролиферативная активность экспрессия рецепторов к стероидным гормонам оценивалась с помощью вычисления показателя H-score, рассчитанного по формуле: H-score=la+2b+3c, где а - процент слабо окрашенных клеток, Ь-процентное содержание умеренно окрашенных клеток и с - процентное содержание сильно окрашенных клеток. Число ядер с разной интенсивностью окраски подсчитывали на 500 клеток. Оценка полученных значений H-score производилась по следующей шкале: 1) 0-50 баллов — отрицательная экспрессия, 2) 51-100 баллов - низкая экспрессия, 3) 101 -200 баллов - умеренная экспрессия, 4) 201-300 баллов - высокая экспрессия Отдельно оценивалась локализация экспрессии PTEN (ядерная или цитоплазматическая), а также процент случаев, в которых маркер экспрессировался более чем в 50% желез Для получения цветного изображения использовали световой микроскоп Axioplan 2 (Karl Zeiss, Германия), сопряженный с фотокамерой Axiocam HRc (Karl Zeiss, Германия) и компьютером. Для получения стандартизованных результатов в качестве пакета программного обеспечения использовался анализатор изображения Axio Vision 4.5 (Carl Zeiss, Германия). Изображения захватывались при увеличении 10-40 х 100. С каждого микропрепарата захватывалось по 3-10 полей зрения. Все изображения фиксировались с одинаковыми настройками микроскопа, фотокамеры и балансировки белого цвета, что позволяет проводить последующее сравнение изображений. Цветовые и контрастные расхождения между компьютерным изображением и визуальной картиной участка микропрепарата были минимальными. Перед определением таких параметров, как H-score и пролиферативная активность, в дальнейшем используемых при сравнении исследуемых групп, для более полноценного автоматического подсчета необходимо было провести ряд корректирующих манипуляций, в связи с чем использовалась программа Axio Vision, версия 4.5. Для каждого определения экспрессии использовался следующий алгоритм: - коррекция яркости, контраста и яркости изображения (на основе заданного эталона); - снижения уровня шумов в изображении; - усиление границ анализируемого объекта; - сегментация (с индивидуальной корректировкой для каждого поля зрения); - удаление артефактов; -учет , влияния окружающей среды на объект (с индивидуальной корректировкой для каждого поля зрения); -удаление артефактов; -разделение объектов линиями (с индивидуальной корректировкой для каждого поля зрения); - измерение параметров отдельно железистого и стромального компонентов; -измерение количества окрашенных ядер в железистом и стромальном компонентах; -занесение данных в таблицу (формат Excel). Таким образом, получали изображение, в котором все положительно окрашенные структуры ядер клеток ограничены от остального поля зеленными линиями, граница между структурами четкая, структуры определяются программой анализа изображений. Правильность выделения компонентов изображения проверяется визуально по исходному изображению при открытии файла с исходным изображением, сохраняющегося автоматически.
Статистическая обработка полученных результатов проводилась на персональном компьютере Samsung R20 при помощи пакета программного обеспечения Statistica 6.0 (StatSoft Inc. (США). Для определения воспроизводимости диагнозов использовалось вычисление взвешенной каппы Козна и ее стандартной ошибки. Для обработки результатов иммуногистохимических исследований, как для принадлежащих к интервальной шкале, первоначально проверялось распределение полученных данных. Поскольку распределение отличалось от нормального, для анализа полученных данных и выявления статистически значимых различий между переменными использовался непараметрический критерий Крускала-Уоллиса.
Оценка воспроизводимости диагнозов ГЭ согласно классификации ВОЗ (2003)
Для исследования воспроизводимости по классификации ВОЗ отобранные препараты были разделены на 7 групп (слизистая тела матки стадии пролиферации, стадии секреции, простая ГЭ, сложная ГЭ, простая атипическая ГЭ, сложная атипическая ГЭ и высокодифференцированная аденокарцинома эндометрия (АКЭ).
Слизистая тела матки стадии пролиферации и секреции были включены в исследование в качестве контроля и дополнительного усложнения диагностической задачи для патологов, для верификации образцов эндометрия без патологии патологи пользовались традиционными критериями, микрофотографии соответствующих препаратов представлены на рисунках 4, 5.
Простая ГЭ характеризуется наличием многочисленных неравномерно распределенных желез разной формы и величины, включая кистозно-расширенные. Железистый эпителий в структурном отношении мало отличается от эпителия желез эндометрия стадии пролиферации. Клетки железистого эпителия с овальными темно-окрашенными ядрами, базофильной цитоплазмой, местами имеются митозы. В кистозно-расширенных железах эпителий преимущественно однорядный, цилиндрический или уплощенный, митозы отсутствуют (рис. 6 А)
Сложная ГЭ отличается структурой перестройкой железистого компонента, а именно, среди многочисленных желез, разной формы и величины преобладают ветвящиеся, со складчатостью в направлении просвета железы, отмечается тенденция к компактному расположению желез. Железистый эпителий одно-(редко), двух- и трехрядный (чаще), митотическая активность вариабельная, обычно менее 5 митозов в 10 полях зрения при большом увеличении (рис. 6 Б).
Атипическая ГЭ характеризуется пролиферацией эндометриальных желез с наличием атипии клеток железистого эпителия, которая может быть представлена потерей полярности клеток, а также атипией ядра клеток (наличие диспергированного или глыбчатого хроматина, увеличение размера ядер, их плейоморфизм, заметные ядрышки.
О простой атипической ГЭ свидетельствует отсутствие лежащих «спина к спине» скученных, ветвящихся желез (рис. 7 А) Сложную атипическую ГЭ отличает компактное расположение желез, в том числе причудливой формы с пальцеобразными инвагинациями в направлении их просвета и наличием микропапиллярных формирований, в единичных железах они характеризуются тенденцией к формированию «эпителиальных перемычек, (рис. 7 Б).
Для диагностики АКЭ использовались следующие критерии: Опухоль состоит из многочисленных железистых структур вариабельной формы, включая тубулярные, выстланных эпителием эндометриального типа с признаками пролиферации и атипии ядер клеток, местами имеются участки папиллярного строения, строма между железами в небольшом количестве с коллагеновыми волокнами и капиллярами (рис. 8) . (Кондриков Н.И., 2008, Silvelberg S., 2003) Все 60 включенных в исследование образцов оценивались независимо тремя экспертами, и на основании их заключений была сформирована итоговая панель диагнозов (табл. 5) В итоговую панель вошли те заключения, которые совпадали между исследователями Б и В, а также между патологами А и Б и А и В в случае несогласия Б и В. Если же все три исследователя ставили разные диагнозы, то приоритетным считалось заключение специалиста В, главы экспертной группы. Затем попарно сравнивались диагнозы, поставленные патологами А и Б, А и В, Б и В. Таблица 5. Итоговая панель диагнозов. Гистологическое заключение Количество наблюдений (% от общего числа) Слизистая тела матки стадии пролиферации 11 (19%) Слизистая тела матки стадии секреции 10(17%) Простая ГЭ 12 (20%) Сложная ГЭ 4 (7%) Простая атипическая ГЭ 3 (5%) Сложная атипическая ГЭ 13 (22%) АКЭ 7 (10%) Степень тяжести патологического процесса по итоговой панели диагнозов оказалась выше, чем при оценке тех же препаратов каждым из исследователей, при этом всего из 60 диагнозов полное согласие патологов наблюдалось в 31 случае. В остальных случаях один или два патолога ставили либо диагноз, соответствующий более легкой степени тяжести патологического процесса (в 24 препаратах), либо более тяжелой (в 9 препаратах). При этом согласие патологов при попарном сравнении было более высоким (на 8% между А и В, на 23%) между А и Б и на 23%) между Б и В.) Воспроизводимость диагнозов, поставленных патологами А и В (по классификации ВОЗ). Патологи А и В выставили один и тот же диагноз в 38 случаях (63% ). При этом конкордантность их диагнозов по конкретным формам патологического процесса была следующей: для слизистой тела матки стадии пролиферации -83%, для слизистой стадии секреции - 100%), для простой - 39%), для сложной ГЭ - 20%, для простой атипической ГЭ-0% , для сложной атипической ГЭ 83%), для АКЭ-71%). При этом исследователь А был склонен оценивать патологический процесс как менее тяжелый (в 18 случаях), в то время как исследовать В поставил более легкий диагноз только в 4 случаях. Таким образом, при сравнении диагнозов патологов А и В показатель воспроизводимости каппа (K±SE) составил 0,567±0,074 Воспроизводимость диагнозов, поставленных патологами А и Б (по классификации ВОЗ). Патологи А и Б выставили один и тот же диагноз в 40 случаях (67% ). При этом конкордантность их диагнозов по конкретным формам патологического процесса была следующей: для для слизистой тела матки стадии пролиферации - 92%, для слизистой стадии секреции - 100%, для простой - 56%, для сложной ГЭ - 40%), для простой атипической ГЭ-0% , для сложной атипической ГЭ -52%, для АКЭ-72%). При этом исследователь А был склонен оценивать патологический процесс как менее тяжелый (в 15 случаях), в то время как исследовать Б поставил более легкий диагноз только в 5 случаях. Таким образом, при сравнении диагнозов патологов А и Б показатель воспроизводимости каппа (K±SE) составил 0,603±0,072
![Совершенствование ультразвуковой пренатальной диагностики врожденных пороков на основе стандартизированного подхода к эхографическому исследованию плода [Электронный ресурс]](/i/i/4483/210374.png "Совершенствование ультразвуковой пренатальной диагностики врожденных пороков на основе стандартизированного подхода к эхографическому исследованию плода [Электронный ресурс] Зайкина Ирина Эдуардовна")
