Введение к работе
Актуальность проблемы. Липофусциновые гранулы (ЛГ) - сложные образования липидно-белковой природы, которые в течение жизни накапливаются в клетках ретинального пигментного эпителия (РПЭ) человеческого глаза. Долгое время они считались безопасным побочным продуктом жизнедеятельности клеток. Оказалось, однако, что ЛГ обладают способностью к фотоиндуцированной генерации активных форм кислорода (Островский и др., 1992; Boulton et al., 1993), что лежит в основе их потенциальной фототоксичности в отношении клетки РПЭ. Исследования последних лет выявили корреляцию между накоплением ЛГ в РПЭ и некоторыми офтальмологическими заболеваниями человека. Это, в первую очередь, старческая макулярная дегенерация сетчатки, которая является основной причиной слабовидения и слепоты пожилых людей, болезнь Штаргардта и другие дегенеративные заболевания. Фототоксичностью ЛГ может быть обусловлена опасность усугубляющего действия коротковолнового (фиолетово-синего) видимого света при дегенеративных заболеваниях сетчатки глаза.
Структура и состав ЛГ клеток РПЭ, а также влияние процесса старения и действия света на них остаются малоизученными. Протеомный анализ белков ЛГ из клеток РПЭ показал, что в составе гранул присутствуют как специфические для наружных сегментов палочек (НСП) белки (например, рековерин), так и неспецифические белки цитоскелета, ферменты, белки-шапероны и канальные белки. Наличие фрагментов белков митохондриального происхождения показывает, что в формировании вещества липофусциновых гранул участвуют не только остатки обломков НСП, не до конца подвергшиеся химическому и ферментативному разложению, но и продукты аутофагоцитоза органелл клеток РПЭ. Показано, что, в отличие от липофусцина из клеток других тканей, флуорофоры ЛГ из РПЭ состоят в основном из производных ретиналя. Идентифицирован и подробно охарактеризован только один из флуорофоров - так называемый N-ретинилиден-М-ретинилэтаноламин, или А2Е. Существуют данные, что А2Е может вызывать фотоповреждение клеток.
В связи с этим понимание процессов, происходящих в липофусциновых гранулах РПЭ глаза человека при действии видимого света (изменение содержания в них различных флуорофоров) и в зависимости от возраста, может пролить свет на понимание их роли в развитии дегенеративных заболеваний сетчатки глаза.
Цель диссертационной работы. Изучить влияние видимого света и процесса старения доноров на состав флуорофоров, перешедших в хлороформный экстракт из ЛГ клеток РПЭ кадаверного глаза человека. Определить флуоресцентные характеристики флуорофоров/групп флуорофоров ЛГ из клеток РПЭ. Провести сравнительную оценку вклада
этих флуорофоров/групп флуорофоров в суммарный спектр флуоресценции хлороформного экстракта из ЛГ.
Основные задачи исследования.
Провести компонентный анализ флуорофоров/групп флуорофоров ЛГ, выделенных из клеток РПЭ кадаверных глаз человека, и определить их спектральные характеристики.
Сравнить компонентный состав флуорофоров/групп флуорофоров из ЛГ, выделенных из клеток РПЭ кадаверных глаз человека различных возрастных групп.
Исследовать действие видимого света на ЛГ, их флуорофор А2Е и другие компоненты хлороформного экстракта из ЛГ.
Провести оценку возможного вклада отдельных флуорофоров/групп флуорофоров в суммарный спектр флуоресценции хлороформного экстракта из ЛГ РПЭ кадаверных глаз человека. Научная новизна.
Впервые детально описаны спектры флуоресценции отдельных флуорофоров/групп флуорофоров хлороформного экстракта из ЛГ, выделенных из РПЭ кадаверных глаз человека.
Проведена оценка возможного вклада этих флуорофоров/групп флуорофров в суммарный спектр флуоресценции хлороформного экстракта из липофусциновых гранул.
Показано, что А2Е не является основным флуорофором хлороформного экстракта из ЛГ.
Показано, что с возрастом относительное содержание окисленных форм флуорофоров в ЛГ увеличивается.
Показано, что реакция фотоокисления молекулы А2Е приводит к образованию как эпокси-, так и фураноидных ее форм; эта реакция происходит при участии нескольких окислительных реагентов, одним из которых является радикал супероксида.
Научная и практическая ценность работы
Полученные в диссертационной работе результаты имеют фундаментальное значение для понимания природы и состава флуорофоров, содержащихся и накапливающихся в липофусциновых гранулах клеток ретинального пигментного эпителия с возрастом и при патологии. Знание спектральных характеристик флуорофоров липофусциновых гранул, особенно в зависимости от возраста, представляет практический интерес для дальнейшего усовершенствования метода аутофлуоресцентной диагностики глазного дна, а именно для разработки его компонентного спектрального анализа.
Основные положения, выносимые на защиту: 1. Определены спектральные свойства отдельных флуорофоров/групп флуорофоров липофусциновых гранул клеток ретинального пигментного эпителия кадаверных глаз человека.
2. A2E не является основным флуорофором в суммарном спектре
флуоресценции хлороформного экстракта из липофусциновых гранул.
Наряду с А2Е значительной флуоресценцией обладают вещества, более
полярные, чем А2Е, к которым относятся также окисленные формы А2Е.
3. С возрастом относительное содержание окисленных форм флуорофоров в
липофусциновых гранулах увеличивается.
4. Реакция фотоокисления молекулы А2Е приводит к образованию как
эпокси-, так и фураноидных ее форм; эта реакция происходит при участии
нескольких окислительных реагентов, одним из которых является радикал
супероксида.
Апробация диссертации и публикации результатов исследования Основные материалы диссертации опубликованы в 4 статьях; докладывались и обсуждались на различных Международных и Всероссийских симпозиумах, конференциях, съездах: XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. (Москва, 2007); итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2007); итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2008); конференции и семинары по научным направлениям программы «Фундаментальные науки - медицине» (Москва, 2010).
Личный вклад соискателя. Все изложенные в диссертации новые результаты получены автором самостоятельно или при его непосредственном участии. Постановка задач, интерпретация полученных результатов и формулировка выводов исследования осуществлялись совместно с научным руководителем и другими соавторами публикаций.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 135 страницах, состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение результатов), выводов и списка литературы, включающего 124 источников. Диссертация иллюстрирована 42. рисунками и 5 таблицами.
![Цилиарное тело глаза человека в онтогенезе [Электронный ресурс]](/i/i/4606/206977.png "Цилиарное тело глаза человека в онтогенезе [Электронный ресурс] Николаенко Галина Анатольевна")
![Гистофизиология стекловидного тела глаза человека в норме и при патологии [Электронный ресурс]](/i/i/5434/191951.png "Гистофизиология стекловидного тела глаза человека в норме и при патологии [Электронный ресурс] Бабич Максим Евгеньевич")
