Молекулярные механизмы взаимодействия оксида азота(II) и низкоинтенсивного лазерного и светодиодного излучения с митохондриями Буравлев, Евгений Александрович

Введение к работе

Актуальность исследования.

Среди многочисленных реакций оксида азота(ІІ) наиболее важными являются реакции с кислородом, SH-группами и металлами переменной валентности, которые входят в состав гемовых и негемовых белков. На молекулярном уровне физиологические эффекты оксида азота(П) реализуются, обычно, через взаимодействие с гемовыми и негемовыми белками. Например, известно, что когда оксид азота (II) образует нитрозильный комплекс с гемом гуанилат-циклазы, то наблюдается увеличение каталитической активности фермента. В результате происходит расслабление гладкой мускулатуры сосудов и увеличивается кровоснабжение ткани. Не менее важной реакцией оксида азота(П) в клетке/организме является реакция с белками электрон-транспортной цепи митохондрий, среди которых важно упомянуть цитохром с, цитохром с оксидазу и негемовые железо-серные белки. Оксид азота(ІІ) ингибирует их каталитическую активность, снижает дыхание митохондрий и синтез АТФ.

Согласно теории о механизмах действия низкоинтенсивного лазерного излучения видимого диапазона, предложенной Ю.А. Владимировым лазерное излучение вызывает разрушение нитрозильных комплексов. В ряде патофизиологических процессов, протекающих с участием оксида азота(ІІ), нитрозильные комплексы белков могут играть важную роль. Это касается состояний, связанных с нарушениями кровообращения - ишемия, гипертензия, шок. При наличии в организме большого количества бактериальных липополисахаридов проявляется состояние известное как эндотоксический шок. В этом состоянии в организме образуется значительное количество оксида азота(ІІ), который оказывает заметное воздействие на функции белков и ферментов. Например, низкие (наномолярные) концентрации оксида азота(ІІ) способны ингибировать цитохром с оксидазу. Высокие концентрации NO ингибируют дыхательную цепь митохондрий из-за нитрозилирования тиолов и блокирования железо-серных центров в митохондриальных дыхательных комплексах. Также в результате взаимодействия с кислородом в процессе дыхания митохондрий оксид азота(ІІ) способен образовывать пероксинитрит. Пероксинитрит вызывает необратимое повреждение, как белковых комплексов дыхательной цепи, так и мембран митохондрий. Поэтому изучение роли оксида азота(ІІ) в регуляции дыхания митохондрий имеет важное значение для понимания механизмов протекания этого патологического состояния и может оказать влияние на разработку методов его диагностики и лечения. Важным свойством нитрозильных комплексов является их фоточувствительность. В работах, проведенных в нашей лаборатории (Mittermayr, 2007), было показано, что гемоглобин и цитохром с могут распадаться при действии лазерного излучения с длиной волны 442 нм.

Цель и задачи исследования

Основной целью нашей работы является исследование влияния лазерного и светодиодного излучения и оксида азота(ІІ) на функционирование митохондрий. Для достижения этой цели были поставлены следующие актуальные задачи:

1. Изучить воздействие низкоинтенсивного лазерного излучения (442 нм) и гемоглобина на нитрозильные комплексы негемового железа митохондрий.

2. Изучить влияние лазерного и светодиодного излучения на функционирование митохондрий в норме и при воздействии экзогенного NO.

3. Изучить влияние лазерного и светодиодного излучения на функционирование митохондрий в норме и при воздействии эндогенного NO, образующегося в организме на модели эндотоксического шока.

4. Изучить влияние степени восстановления митохондриальных переносчиков в норме и при воздействии эндогенного NO, образующегося в организме на модели эндотоксического шока.

5. Исследование роли эндогенных порфиринов в механизме действия низкоинтенсивного лазерного излучения видимого диапазона (632,8 нм) на свободно-радикальные процессы в крови крыс при действии на организм липополисахаридов.

Научная новизна исследования

Результаты данного исследования о действии лазерного и светодиодного излучения на митохондрии, которые были подвергнуты воздействию эндогенного и экзогенного оксида азота(ІІ), вносят вклад в фундаментальную науку. При проведении исследования было показано образование негемовых нитрозильных комплексов в митохондриях животных, подвергавшихся действию липополисахарида, в присутствии оксида азота(ІІ) и восстановителя; измерены параметры дыхания митохондрий при облучении (442, 532 и 650 нм, дозами 3-30

Дж/см ) для контрольной группы и группы с введением липополисахаридов; измерены зависимости супероксиддисмутазная активности плазмы крови крыс и функциональной активности лейкоцитов от содержания эндогенных порфиринов в плазме крови при облучении.

Практическое значение работы

Результаты данного исследования о действии лазерного и светодиодного излучения на митохондрии, подвергавшиеся воздействию эндогенного и экзогенного оксида азота(ІІ), вносят вклад в фундаментальную науку. Полученные в ходе работы результаты, при дальнейшем изучении, могу быть использованы в клинической практике для лечения и диагностики такого патологического состояния, как эндотоксический шок. Положения, выносимые на защиту

5. 1. В результате действия лазерного облучения с длиной волны 442 нм на митохондрии в присутствии NO происходит распад нитрозильных комплексов негемового железа(ІІ). Процесс транс-нитрозилирования с помощью гемоглобина можно рассматривать как альтернативный путь разрушения этих нитрозильных комплексов.

   2. Облучение митохондрий лазерным и светодиодным светом (442, 532 и 650 нм) вызывает снижение дыхательного контроля. При облучении митохондрий лазером с

   длиной волны 442 нм дозами 3-12 Дж/см наблюдется увеличение скорости дыхания в состоянии V₃. При облучении синим светом митохондрий, ингибированных оксидом азота(ІІ), происходит частичное восстановление скорости дыхания V₃ и дыхательного контроля. Эти данные свидетельствуют о том, что лазерное излучение 442 нм вызывает разрушение нитрозильных комплексов дыхательной цепи митохондрий (образуемых экзогенным или эндогенным NO). В случае с красным излучением наблюдается снижение скорости дыхание митохондрий в состоянии V₃, что может быть связано с фотодинамическим повреждением митохондрий.

   5. 3. Облучение митохондрий животных, подвергавшихся действию ЛПС, лазерным и светодиодным светом (442, 532 и 650 нм) вызывает снижение

      дыхательного контроля. При этом при облучении синим светом в дозе 6 Дж/см увеличивается скорость дыхания митохондрий в состоянии V₃. В необлученных митохондриях коэффициент дыхательного контроля ниже, чем в контрольной группе. Это, возможно, связано с увеличением скорости дыхания митохондрий в состоянии V₃ по сравнению с контрольной группой.

      5. 4. Методом ЭПР показано образование нитрозильных комплексов негемового железа в митохондриях от животных, подвергавшихся действию ЛПС, в присутствии NO и восстановителя, который восстанавливает железо(ІІІ) до железа(ІІ) в железо-сернистых центрах дыхательной цепи митохондрий.

         5. Показано, что изменение супероксиддисмутазной активности плазмы крови и продукции радикалов полиморфноядерными лейкоцитами являются наиболее чувствительными показателями при изучении эффектов низкоинтенсивного лазерного излучения красного диапазона(632,8 нм) в норме и в условиях экспериментального эндотоксического шока от концентрации эндогенных порфиринов в плазме крови.

         Внедрение результатов

         Результаты исследования вошли в программу обучения студентов медико- биологического факультета РНИМУ им Н.И. Пирогова и факультета фундаментальной медицины МГУ им М.В. Ломоносова.

         Публикации

         По теме диссертации опубликовано 10 печатных научных работ, в том числе 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

         Личное участие автора

         Автор проделал значительный экспериментальны и аналитический объем работы. Также им были освоены методы выделения митохондрий и клеток крови, измерение биохимического потребления кислорода и мембранного потенциала митохондрий, измерения ЭПР-спектров, а так же хемолюминесцентные, флуоресцентные и спектрофотометрические методы анализа. Лично автором проведена обработка и статистический анализ результатов.

         Апробация работы

         Материалы работы были представлены на: национальной научно-практической конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2011); международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2011 и 2012); международной научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, Беларусь, 2012); ежегодной конференции НИИ Физико-химической медицины (Москва, 2010), международном конгрессе «Лазер Хельсинки» (Хельсинки, Финляндия, 2012), IV-м съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012). Диссертационная работа апробирована 31 августа 2012 г. на совместно заседании кафедры общей и медицинской биофизики МБФ ГБОУ ВПО РНИМУ им Н.И. Пирогова Миздравсоцразвития России и отдела медицинской биофизики НИИ ФПБИ.

         Структура и объем работы

         Диссертация изложена на 126 страницах, содержит 32 рисунка, 3 таблицы и 9 схем; состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов» и выводов. Список литературы включает 124 наименования.

         Похожие диссертации на Молекулярные механизмы взаимодействия оксида азота(II) и низкоинтенсивного лазерного и светодиодного излучения с митохондриями

         Взаимодействие сигнальной системы оксида азота со сфингомиелиновым циклом и пероксидным окислением при проведении токсического сигнала фактора некроза опухоли альфа в условиях ишемии-реперфузии печениШупик, Мария Александровна

         

         Структурно-функциональные модификации гемоглобина, индуцированные оксидом азота (II)Рубан, Михаил Константинович

         

         Гипотензивное и кардиопротекторное действие динитрозильных комплексов железа как физиологических доноров оксида азотаДроботова, Диана Юрьевна

         

         Метаболиты оксида азота и их модуляция при развитии гепатомы ЗайделяНаумов, Андрей Анатольевич

         Изучение новой сигнальной функции оксида азота - регуляции экспрессии гена aidB Ada-регулона Escherichia coliСтрельцова, Дарья Александровна

         

         Исследование механизмов взаимодействия оптических волн в плазмоподобных структурах с пространственно-временной дисперсиейВозианова Анна Викторовна

         

         Механизмы взаимодействия СВЧ-излучения с наноструктурированными углеродосодержащими материаламиРодионов Владимир Викторович

         

         Механизмы взаимодействия паров воды с поверхностью корундаГанжа, Владимир Владимирович

         Механизмы взаимодействия световых потоков различных интенсивностей с гетероэпитаксиальными структурами соединений A2 B6 , выращенных газотранспортными методамиАтаев, Бадави Магомедович

         

         Механизмы многоволновых взаимодействий в ограниченных средах при световом и магнитном воздействияхЖуков Евгений Александрович