Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 18
1.1. Эпидемиология туберкулеза в мировом масштабе 18
1.2. Эпидемиология туберкулеза в Архангельской области 23
1.3. Лечение туберкулеза 24
1.4. История развития и классификация лекарственной устойчивости 25
1.5. Молекулярно-генетические механизмы развития лекарственной устойчивости 30
1.6. Исторические и молекулярно-генетические аспекты распространения МВТ семейства W-Beijing 40
1.7. Лекарственная устойчивость и фитнес МВТ 48
Резюме 53
Глава II. Методология научного исследования (материалы и методы) 55
2.1. Материалы исследования 5 5
2.1.1. Штаммы МВТ 55
2.1.2. Больные туберкулезом легких 63
2.2. Методы исследования 66
2.2.1. Видовая идентификация штаммов 66
2.2.2. Определение чувствительности к противотуберкулезным препаратам 66
2.2.3. Идентификация мутаций в гроВ гене, обусловливающих устойчивость к рифампицину 70
2.2.4. Определение последовательности аминокислот в katG гене и идентификация мутаций, обусловливающих лекарственную устойчивость к изониазиду 71
2.2.5. Анализ полиморфизма длин рестрикции ДНК 71
2.2.6. Сполиготипирование 72
2.2.7. Культивирование МБТ в системе MGIT для изучения характеристик роста, как показателя фитнеса 73
2.2.8. Статистический анализ данных 75
2.2.9. Используемые определения 75
Глава III. Лекарственная устойчивость МБТ к противотуберкулезным препаратам первой линии в Архангельской области 79
Глава IV.Влияние лекарственной устойчивости МБТ на результаты лечения туберкулеза легких 102
4.1. Результаты лечения туберкулеза легких в Архангельской области 102
4.2. Результаты лечения туберкулеза легких в зависимости от чувствительности к противотуберкулезным препаратам первой линии 108
Глава V. Лекарственная устойчивость МБТ к противотуберкулезным препаратам второй линии 122
Глава VI. Молекулярная генетика МБТ, выделенных у больных туберкулезом легких в Архангельской области 132
6.1. Молекулярная генетика МБТ, изолированных от больных туберкулезом в гражданском секторе области 132
6.2. Молекулярная генетика МБТ, изолированных от больных туберкулезом в местах лишения свободы 140
6.3. Сравнительный анализ молекулярно-генетических особенностей штаммов МБТ,
циркулирующих среди гражданского населения и заключенных Архангельской области 145
6.4. Роль реинфекции в эпидемиологии туберкулеза 154
6.5. Моделирование механизмов развития туберкулеза легких 162
Глава VII. Биологическая характеристика штаммов МБТ семейства W-Beijing 166
7.1. Показатели роста, как индикатор фитнеса штаммов МБТ, принадлежащих к разным генотипам 166
7.1.1. Пилотное исследование. Разработка методологии эксперимента 168
7.1.2. Воспроизведение результатов 171
7.2. Показатели роста штаммов МБТ, не принадлежащих к семейству W-Beijing 174
7.3. Показатели роста штаммов МБТ, принадлежащих к семейству W-Beijing 178
7.4. Показатели роста парных штаммов МБТ, изолированных от одних и тех же больных в разные промежутки времени после приобретения лекарственной устойчивости к дополнительным препаратам 182
7.5. Гипотеза широкого распространения штаммов МВТ семейства W-Beijing, основанная на анализе фитнеса 185
Обсуждение результатов 191
Выводы 200
Практические рекомендации 202
Список литературы 204
- Молекулярно-генетические механизмы развития лекарственной устойчивости
- Определение чувствительности к противотуберкулезным препаратам
- Результаты лечения туберкулеза легких в зависимости от чувствительности к противотуберкулезным препаратам первой линии
- Молекулярная генетика МБТ, изолированных от больных туберкулезом в гражданском секторе области
Введение к работе
Актуальность проблемы
Проблема искоренения инфекционных заболеваний является одной из Глобальных проблем современности и угроз здоровью [23]. Здоровье населения Российской Федерации рассматривается как компонент жизненно важных интересов личности и общества. Концепция национальной безопасности [26] - главный документ Российской Федерации по безопасности, основным элементом которого является осуществление безопасности, повышение качества и уровня жизни и обеспечение здоровья населения. Среди инфекционных заболеваний туберкулез легких представляет основную причину смертности и ведущую угрозу здоровью населения страны. В сложившихся условиях остро стоит вопрос обеспечения биологической безопасности, которая должна быть предоставлена каждому гражданину согласно Федеральному закону «О безопасности» [24].
Современный этап развития туберкулеза легких характеризуется неуклонным ростом эпидемиологических показателей и изменением биологических особенностей и структуры популяции микобактерий туберкулеза (МБТ), значительную часть которой занимают микроорганизмы, устойчивые к основным противотуберкулезным препаратам, особенно микроорганизмы с множественной лекарственной устойчивостью.
Проблема распространения лекарственно устойчивого туберкулеза является актуальной по нескольким причинам.
Инфицирование лекарственно устойчивыми МБТ представляет собой реальную угрозу здоровью населения и прямую угрозу развития неизлечимого заболевания [159].
Арсенал средств, предназначенных для лечения туберкулеза легких с множественной лекарственной устойчивостью, ограничен [9]. Проблема может быть разрешена при использовании имеющихся и разработке новых противотуберкулезных препаратов второго ряда. Известно,
препараты второго ряда являются менее эффективными, имеют выраженные побочные действия и токсические эффекты и требуют больших экономических вложений [82,120, 229].
Изменения в генетическом аппарате МБТ направлены на развитие лекарственной устойчивости и появление новых генотипов возбудителя. МБТ, принадлежащие к семейству W-Beijing, являются хорошим примером, они обладают повышенной вирулентностью и рядом других преимуществ, которые позволяют сохранить вид МБТ в условиях эффективной химиотерапии. МБТ с множественной лекарственной устойчивостью согласно классификации степени потенциальной угрозы инфекционных агентов относятся к категории С [22]. В эту категорию включены возбудители инфекционных заболеваний, обладающие высокой трансмиссией и способностью к воспроизводству. В связи с этим особую значимость приобретают вопросы биологической безопасности нации как необходимого условия устойчивого развития страны.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
Цель исследования - изучить молекулярно-генетические аспекты развития лекарственной устойчивости у штаммов МБТ, циркулирующих в Архангельской области в условиях чрезвычайной ситуации угрозы развития эпидемии лекарственно устойчивого туберкулеза легких, и разработать мероприятия, позволяющие снизить распространение данного заболевания.
Для достижения указанной цели определены следующие задачи:
Провести сравнительный анализ показателей и профилей лекарственной устойчивости МБТ к противотуберкулезным препаратам первой линии в условиях чрезвычайной ситуации угрозы развития эпидемии лекарственно устойчивого туберкулеза легких.
Выявить и проанализировать профили лекарственной устойчивости МБТ, которые обусловливают неблагоприятные исходы туберкулеза легких и способствуют дальнейшему распространению заболевания.
Изучить показатели и профили лекарственной устойчивости МБТ к противотуберкулезным препаратам второй линии и предложить противотуберкулезные препараты второй линии для лечения больных туберкулезом легких с множественной лекарственной устойчивостью.
Провести сравнительную генетическую характеристику штаммов МБТ, циркулирующих в гражданском секторе и местах лишения свободы Архангельской области, с использованием анализа полиморфизма фрагментов длин рестрикции (от англ. RFLP - restriction fragment length polymorphism analysis) дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и сполиготипирования.
Определить эпидемиологическую роль МБТ семейства W-Beijing в создании чрезвычайной ситуации угрозы развития эпидемии лекарственно устойчивого туберкулеза легких в Архангельской области.
Изучить и проанализировать биологические особенности возбудителя
туберкулеза, являющиеся причинами широкого распространения лекарственно устойчивых штаммов МБТ, принадлежащих к семейству W-Beijing.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
На протяжении последних лет в Архангельской области сохраняется чрезвычайная ситуация угрозы развития эпидемии лекарственно устойчивого туберкулеза легких. Особую биологическую угрозу представляет трансмиссия штаммов МБТ, устойчивых к противотуберкулезным препаратам первой и второй линии, что значительно затрудняет выбор адекватного режима химиотерапии и излечение данного заболевания.
Доминирование 531 TCG—>TTG мутации в гроВ гене и 315 AGC—»АСС мутации в katG гене предусматривает формирование селективных преимуществ у МБТ, обусловливающих развитие и широкое распространение туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью на территории области.
Результаты лечения туберкулеза легких в Архангельской области не достигли должного уровня в связи с большим числом случаев прерванного лечения и распространением лекарственно устойчивых МБТ. Исход заболевания не зависит от принадлежности штамма МБТ, которым инфицирован больной, к семейству W-Beijing. Исход заболевания в первую очередь зависит от чувствительности штамма МБТ к противотуберкулезным препаратам.
В Архангельской области основной причиной туберкулеза легких являются штаммы МБТ, принадлежащие к семейству W-Beijing. Принадлежность МБТ к семейству W-Beijing достоверно коррелирует с наличием устойчивости к противотуберкулезным препаратам первой линии. Появление лекарственной устойчивости МБТ к дополнительным препаратам на фоне адекватного и регулярного лечения может быть обусловлено
реинфекцией новым лекарственно устойчивым штаммом МБТ.
Рост штаммов МБТ в условиях in vitro характеризуется фенотипическим и генотипическим полиморфизмом. У лекарственно устойчивых штаммов МБТ обычных генотипов происходит замедление роста по сравнению с лекарственно чувствительными штаммами МБТ. Часть лекарственно устойчивых штаммов МБТ семейства W-Beijing характеризуется замедлением роста, у другой части МБТ данного генотипа не отмечено изменения роста после приобретения лекарственной устойчивости. Селективные преимущества МБТ семейства W-Beijing обусловлены особенностями их роста и доминированием 531 TCG—>TTG мутации в гроВ гене.
КОНЦЕПЦИЯ РАБОТЫ
Сохранение здоровья населения является приоритетом обеспечения биологической безопасности страны. Среди инфекционных заболеваний туберкулез легких представляет реальную угрозу здоровью населения и занимает ведущее положение в структуре их смертности.
Основное направление работы связано с определением молекулярно-генетических механизмов развития и распространения лекарственно устойчивого туберкулеза легких в зависимости от биологических особенностей возбудителя в условиях чрезвычайной ситуации природного характера.
Ежегодный рост показателей лекарственной устойчивости, распространение МБТ, принадлежащих к семейству W-Beijing, в структуре популяции возбудителя туберкулеза создают условия для трансмиссии лекарственно устойчивых штаммов МБТ, инфицирования восприимчивого населения и развития у него заболевания, излечение которого является сложной задачей. Множественная лекарственная устойчивость, низкая эффективность химиотерапии и широкое распространение резистентности к
противотуберкулезным препаратам второго ряда делают туберкулез легких неизлечимым заболеванием.
Для устранения бактериологической угрозы, отрицательного воздействия на жизнедеятельность и здоровье населения необходимо своевременное выявление, прогнозирование развития лекарственной устойчивости и проведение комплекса лечебно-профилактических мероприятий с соблюдением законодательства по национальной безопасности. Основным методом устранения биологической опасности в создавшихся условиях является своевременная и качественная диагностика туберкулеза с применением молекулярно-генетических методов и лечение больных в соответствии с индивидуальными профилями лекарственной чувствительности к противотуберкулезным препаратам.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ
Проведен мониторинг показателей лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам первой линии в течение 1995-2002 годов и сделан сравнительный анализ индивидуальных профилей лекарственной чувствительности МБТ, выделенных от больных туберкулезом легких в Архангельской области.
Подтверждена роль мутаций в гроВ гене при развитии лекарственной устойчивости к рифампицину, которые служат маркером множественной лекарственной устойчивости. Впервые идентифицированы мутации в katG гене, обусловливающие развитие лекарственной устойчивости МБТ к изониазиду при туберкулезе легких в Архангельской области, которые могут служить дополнительным маркером множественной лекарственной устойчивости.
Впервые представлены и проанализированы результаты лечения туберкулеза легких в зависимости от профиля лекарственной устойчивости и принадлежности к семейству W-Beijing.
Впервые изучена лекарственная устойчивость к противотуберкулезным препаратам второй линии и предложены препараты, которые возможно использовать для химиотерапии больных туберкулезом легких с множественной лекарственной устойчивостью.
Проведена сравнительная генетическая характеристика штаммов МБТ, вызывающих туберкулез легких в Архангельской области. Впервые идентифицировано распространение МБТ, принадлежащих к семействам Т, Haarlem и LAM, и установлена эпидемиологическая роль МБТ семейства W-Beijing в развитии чрезвычайной ситуации угрозы эпидемии лекарственно устойчивого туберкулеза легких на территории Архангельской области. Доказано, что высокий показатель кластерности МБТ семейства W-Beijing является косвенным показателем повышения фитнеса МБТ данного генотипа и обусловливает селективные преимущества при распространении лекарственно устойчивого туберкулеза легких.
Впервые определена роль реинфекции новым лекарственно устойчивым штаммом МБТ на фоне проводимого лечения, которая может объяснить появление лекарственной устойчивости к дополнительным противотуберкулезным препаратам на фоне адекватной и регулярной химиотерапии.
Впервые изучены биологические особенности и фитнес штаммов МБТ, обладающих разными профилями лекарственной устойчивости и принадлежащих к разным генотипам. В частности, установлены профили лекарственной устойчивости и виды мутаций в гроВ гене, обусловливающие селективные превосходства МБТ семейства W-Beijing по сравнению с МБТ других генотипов и способствующие широкому распространению и диссеминации МБТ с множественной лекарственной устойчивостью у новых случаев.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В ПРАКТИКУ
Изучены распространение лекарственно устойчивого туберкулеза легких в Архангельской области и исходы заболевания в зависимости от индивидуального профиля лекарственной чувствительности штамма МБТ и его принадлежности к определенному генотипу. Установлены индивидуальные профили лекарственной устойчивости, затрудняющие лечение туберкулеза легких и приводящие к неблагоприятным исходам (летальный исход и безуспешное лечение).
Установлены точечные мутации в katG и гроВ генах МБТ, позволяющие разработать и внедрить экспресс методы определения множественной лекарственной устойчивости, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Выявление активной трансмиссии штаммов МБТ семейства W-Beijing и роли реинфекции новым штаммом МБТ на фоне проводимого адекватного регулярного лечения позволяет предложить и внедрить эпидемиологические мероприятия в противотуберкулезных медицинских учреждениях, а именно разграничение потоков инфекционно опасных больных и изоляцию больных, выделяющих штаммы МБТ с множественной лекарственной устойчивостью.
Изучение особенностей показателей роста лекарственно устойчивых штаммов МБТ семейства W-Beijing, как характеристики фитнеса, позволило расширить знания в области биологических особенностей возбудителя и сформулировать гипотезу широкого распространения штаммов МБТ семейства W-Beijing.
Основные положения диссертации и вытекающие из них рекомендации в настоящее время используются в педагогической работе на кафедре фтизиопульмонологии Северного государственного медицинского университета (акт внедрения 2004 год), в практической работе Архангельского областного противотуберкулезного диспансера (АОПД) (акт
внедрения 2001 год, 2004 год) и Мурманского областного противотуберкулезного диспансера (акт внедрения 2004 год). Бактериологический мониторинг лекарственной устойчивости при туберкулезе легких проводится с 1995 года, за эти годы созданы коллекция штаммов МБТ и компьютерная база данных, состоящая из профилей чувствительности к противотуберкулезным препаратам и индивидуальных рисунков хромосомной ДНК МБТ, циркулирующих в Архангельской области. Созданная база данных используется для проведения научных исследований в рамках молекулярной эпидемиологии и молекулярной генетики, а также для анализа качества практической работы бактериологической службы Архангельской области.
Ежегодно проводится определение лекарственной чувствительности к противотуберкулезным препаратам первого ряда радиометрическим методом ВАСТЕС и определение вида мутаций в гроВ гене методом INNO-LiPa Rif. ТВ у больных с новыми случаями заболевания. При выявлении множественной лекарственной устойчивости проводится исследование на чувствительность к противотуберкулезным препаратам второго ряда, результаты которого учитываются при выборе противотуберкулезных препаратов и назначении режима химиотерапии. Диссертационное исследование выполнено в рамках региональной научно-технической программы «Здоровье населения Европейского Севера», имеет номер гос. регистрации ГР 01200316208.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ
Материалы диссертации доложены и обсуждены: на Осенней конференции микробиологов, г. Осло, Норвегия, 13-14 сентября 2001 г.; третьей международной встрече Борьба с инфекционными заболеваниями в странах Балтийского моря и Баренцевом регионе, г. Архангельск, Россия, 24-27 сентября 2001 г.; 32 Всемирном конгрессе Международного союза по
борьбе с туберкулезом и заболеваниями легких, г. Париж, Франция, 1-4 ноября 2001 г.; Форуме инфекционистов, г. Осло, Норвегия, 16-17 ноября
2001 г.; Первой международной научной конференции института
международного здоровья, университета Осло, г. Осло, Норвегия, 2-3 мая
2002 г.; Дневном семинаре института общей врачебной практики, г. Осло,
Норвегия, 23 октября 2002 г.; Ежегодной научной конференции Норвежского
института общественного здоровья, г. Осло, Норвегия, 5-6 декабря 2002 г.;
Научной конференции по туберкулезу, Норвежского института
общественного здоровья, г. Осло, Норвегия, 12-13 декабря 2002 г.; Второй
международной научной конференции института международного здоровья,
университет Осло, г. Осло, Норвегия, 15-16 мая 2003 г.; Российском съезде
фтизиатров, г. Москва, 3-5 июня 2003 г.; XVII Всемирном конгрессе по астме
и V съезде иммунологов и аллергологов СНГ, г. Санкт-Петербург, 5-11 июля
2003 г.; Скандинавской встрече по туберкулезу, г. Осло, Норвегия, 10
октября 2003 г.; 20 съезде Скандинавского общества антимикробной терапии,
г. Оденса, Дания, 24-26 октября 2003 г.; Ежегодной научной конференции
Норвежского института общественного здоровья, г. Осло, Норвегия, 4-5
декабря 2003 г.
ПУБЛИКАЦИИ
Результаты и основные положения диссертации опубликованы в 23 печатных работах.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ
Диссертационная работа изложена на 229 енстраницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, содержит материалы и методы собственных исследований, их результаты и обсуждение, выводы, практические рекомендации и список литературы. Текст диссертационной работы иллюстрирован 15 рисунками и 40 таблицами. Указатель литературы
содержит 34 работы отечественных авторов, опубликованные на русском языке, 16 работ отечественных авторов, опубликованных на английском языке, и 184 работы зарубежных авторов. Библиографические записи литературы составлены в соответствии с ГОСТом 7.80-2000.
Молекулярно-генетические механизмы развития лекарственной устойчивости
Исследования МБТ на молекулярном уровне позволили раскрыть некоторые генетические механизмы развития лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам. По своей природе резистентность обусловлена хромосомными мутациями. Лекарственная устойчивость развивается в результате одной или нескольких спонтанных мутаций в независимых генах МТБ [68]. Мутации, как правило, происходят под воздействием неадекватной терапии, монотерапии, неаргументированной смены режима химиотерапии, добавления одного препарата к неэффективному режиму и несоблюдения больным режима терапии [201].
Мутации в хромосомах, вызывающие развитие лекарственной устойчивости, могут встречаться и у природных штаммов МТБ, которые никогда не контактировали с противотуберкулезными препаратами. Природные штаммы МВТ, имеющие мутации в хромосомах, равномерно распределены по земному шару [93]. У больного с новым случаем туберкулеза при массивном бактериовыделении могут быть выделены как чувствительные популяции МБТ, так и незначительное количество устойчивых МБТ, имеющие спонтанные мутации [95]. Данное явление было изучено вскоре после внедрения противотуберкулезной терапии и начала изучения природы лекарственной устойчивости. Развитие лекарственной устойчивости к стрептомицину в результате спонтанных мутаций было описано как у лабораторных штаммов МБТ H37Rv [220], так и у штаммов, изолированных от больных туберкулезом легких [132].
Спонтанные мутации у природных штаммов МБТ, влекущие за собой лекарственную устойчивость к противотуберкулезным препаратам, возникают очень редко. Так, вероятность спонтанных мутаций, вызывающих устойчивость к изониазиду и стрептомицину, составляет 10"6. Вероятность возникновения спонтанных мутаций, обусловливающих лекарственную устойчивость к рифампицину и этамбутолу, составляет 1(Г и 1(Г, соответственно. У природных штаммов МБТ могут развиваться мутации в разных генах одновременно, что влечет за собой лекарственную устойчивость к нескольким противотуберкулезным препаратам одновременно. Вероятность мутаций, обусловливающих лекарственную устойчивость к изониазиду и рифампицину, составляет 2,56x10 [48].
Мутации могут вызвать развитие лекарственной устойчивости к любому из противотуберкулезных препаратов. Вероятность развития лекарственной устойчивости обратно пропорциональна эффективности того или иного противотуберкулезного препарата [93]. Например, очень высока вероятность развития лекарственной устойчивости к малоэффективным препаратам: тиацетазону, этионамиду, капреомицину, циклосерину и виомицину. Менее вероятно развитие лекарственной устойчивости к изониазиду, стрептомицину, этамбутолу, канамицину и парааминосалициловой кислоте (ПАСК). Самая низкая вероятность развития лекарственной устойчивости наблюдается к рифампицину, препарату, обладающему высокой противотуберкулезной эффективностью. Устойчивость к тому или иному препарату не представляет каких-либо селективных преимуществ для МВТ, до тех пор, пока данный микроорганизм не будет подвержен воздействию данного препарата [143].
В туберкулезной каверне содержится до 10-10 МВТ, при этом у нескольких тысяч бацилл может наблюдаться устойчивость к одному из противотуберкулезных препаратов за счет спонтанных мутаций. Клиника лекарственно устойчивого туберкулеза у больного проявляется тогда, когда размер популяции лекарственно устойчивых МВТ значительно превосходит популяцию бацилл, чувствительных к противотуберкулезным препаратам.
Селекция лекарственно устойчивых мутантов происходит при неадекватной терапии и монотерапии [180]. При лечении туберкулезного очага одним эффективным препаратом быстро уничтожаются МВТ, чувствительные к данному препарату. В то же самое время отдельные МВТ, устойчивые к данному препарату, продолжают делиться, и их популяция увеличивается в размере. Через несколько недель подобного лечения, у больного разовьется клиническая картина лекарственно устойчивого туберкулеза. Смена препарата, добавление препарата к неэффективному химиотерапевтическому режиму вызовет селекцию бацилл, устойчивых как к первому, так и ко второму препарату [133].
Отдельные штаммы МБТ не могут взаимодействовать и передавать друг другу генетическую информацию [95]. Многие бактерии способны передавать устойчивость к антибактериальным препаратам при помощи генетических элементов, в частности транспосонов, интегронов и плазмид. Данное явление не характерно для МБТ, поскольку перечисленные элементы не участвуют в формировании устойчивости к противотуберкулезным препаратам у МБТ. Таким образом, развитие лекарственной устойчивости у МБТ обусловлено хромосомными мутациями в независимых генах [95].
Проведенные исследования о молекулярных основах лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам позволили углубить знания о природе множественной лекарственной устойчивости и идентифицировать гены, кодирующие мишени МБТ, повреждение которых ведет к развитию лекарственной устойчивости к индивидуальным препаратам (табл. 1).
Определение чувствительности к противотуберкулезным препаратам
Чувствительность МБТ к противотуберкулезным препаратам можно определять при помощи общепринятого метода абсолютных концентраций и радиометрического метода. В настоящем исследовании использованы результаты тестирования штаммов МБТ к противотуберкулезным препаратам радиометрическим методом ВАСТЕС (ВАСТЕС, Becton Dickinson Diagnostic Systems, Sparks, Mariland) [69, 127, 161], который является золотым стандартом. Бактериологическая лаборатория АОПД использует метод абсолютных концентраций для определения устойчивости к противотуберкулезным препаратам. При сравнении результатов, полученных в АОПД и НИОЗ в 1999 году, выявлен большой процент расхождения в определении лекарственной устойчивости (табл. 4). Лаборатория АОПД не в состоянии была определить лекарственную устойчивость у штаммов МБТ, устойчивость которых установлена в НИОЗ. Значительные расхождения в результатах отмечены для этамбутола и изониазида. Лаборатория АОПД недооценивает устойчивость к данным препаратам в 23,7% и 18,4% случаях соответственно. ВАСТЕС метод представляет собой модификацию общепринятого метода абсолютных концентраций для определения чувствительности к противотуберкулезным препаратам. Отличительной особенностью метода является использование среды Middlebrook 7Н12 с включением в нее субстрата жирных кислот и радиоактивно помеченного атома 14С. Рост МБТ на среде и поглощение кислорода вызывает образование 14СОг, содержание которого регистрируется аппаратом ВАСТЕС. Степень прорастания МБТ определяется с помощью индекса роста (AGI) в среде с известной концентрацией противотуберкулезного препарата. Если рост МБТ наблюдается в среде с угнетающим индексом роста, то такой штамм МБТ считается устойчивым к данному противотуберкулезному препарату [101, 107,161].
Для данного метода использовали чистую культуру МБТ, выращенную на плотной питательной среде Левенштейна-Иенсена за три недели, из которой готовят суспензию следующим образом [34]: 1. Стеклянные пробирки, заполненные на 1 см от дна стеклянными шариками, маркируют, пользуясь восковым карандашом или маркером, чтобы в процессе работы этот номер сохранился. 2. В пробирки добавляют стерильный изотонический раствор хлорида натрия (NaCl) так, чтобы он полностью покрывал стеклянные шарики. 3. Бактериологической петлей переносят колонии МБТ в пробирку со стеклянными шариками, перемешивают содержимое на электрической мешалке в течение 20 секунд. После чего в пробирку добавляют по 2 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия и оставляют на 30 минут в кабинете защиты для отстаивания. 4. На каждую тестируемую культуру берут две (одна контрольная, вторая для тестирования) новые стеклянные пробирки, которые маркируют соответствующим образом. В пробирку для тестирования стерильной пипеткой переносят надосадочную жидкость, плотность которой проверяют светофотометром. Надосадочная жидкость должна иметь следующие свето-фотометрические показатели: 0,05. Для получения вышеуказанных показателей надосадочную жидкость можно развести изотоническим раствором хлорида натрия. 5. В контрольную пробирку вносят 9,8 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия и 0,2 мл приготовленной суспензии. На каждую тестируемую культуру заранее готовят флаконы с жидкой питательной средой Middlebrook 7Н12, которые маркируют соответствующим образом. Один флакон предназначен для контроля роста МБТ. В настоящем исследовании использованы следующие концентрации противотуберкулезных препаратов первой линии: изониазид 0,2 мг/мл; рифампицин 2,0 мг/мл; этамбутол 7,5 мг/мл; и стрептомицин 6,0 мг/мл. Для определения чувствительности к противотуберкулезным препаратам второй линии использованы следующие концентрации: капреомицин 1,25 мг/мл; этионамид 1,25 мг/мл; канамицин 5,0 мг/мл; и офлоксацин 2,0 мг/мл [139].
Мы использовали более высокие концентрации для определения чувствительности к этамбутолу и стрептомицину, чем рекомендуются производителем [148], но в соответствии с последними рекомендациями [51]. Кроме того, с 1998 года НИОЗ участвует в международном проекте определения контроля качества при определении устойчивости к противотуберкулезным препаратам, данный проект был организован ВОЗ и МСБТЗЛ [7, 152]. При проведении внешнего контроля качества в 1998-2001 годах установлено, что процент правильных результатов, полученных НИОЗ, составляет 97% для рифампицина, 100% для изониазида, 97% для этамбутола и 90% для стрептомицина. Таким образом, результаты определения чувствительности к рифампицину, изониазиду и этамбутолу можно считать отличными, а результаты определения чувствительности к стрептомицину -хорошими.
Для определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) к капреомицину и этионамиду десять лекарственно чувствительных штаммов МБТ и девять штаммов МБТ с множественной лекарственной устойчивостью протестированы на чувствительность к данным препаратам с использованием разных концентраций. Использованы следующие концентрации препаратов: капреомицин 0,125 мг/мл; 0,25 мг/мл; 0,75 мг/мл; 1,25 мг/мл; 2,5 мг/мл; 5,0 мг/мл; 10,0 мг/мл; 20,0 мг/мл; этионамид 0,125 мг/мл; 0,25 мг/мл; 0,75 мг/мл; 1,25 мг/мл; 2,5 мг/мл; 5,0 мг/мл; 10,0 мг/мл.
Результаты лечения туберкулеза легких в зависимости от чувствительности к противотуберкулезным препаратам первой линии
Благоприятные результаты лечения туберкулеза у больных новыми случаями заболевания в Архангельской области ниже, чем в Ивановской (75%) и Орловской (88%) областях [53, 200]. Внедрение противотуберкулезных мероприятий по стратегии DOTS в Иваново [56] и Орле [53] началось в 1995 и 1998 годах соответственно, а в Архангельске - во второй половине 1998 года. Небольшой интервал между началом внедрения программы и настоящим исследованием не позволил достичь цели ВОЗ: излечить 85% новых инфекционно опасных случаев туберкулеза. Первоочередной задачей программы борьбы с туберкулезом является выявление 75% больных с инфекционно опасными формами, т.е. больных туберкулезом легких с бактериовыделением, и излечение 85% диагностированных больных [1, 13, 216].
В настоящее время результаты лечения туберкулеза легких в Архангельской области не достигли должного уровня в связи с большим числом случаев прерванного лечения. Учитывая полученные данные, необходимо улучшить мероприятия по организации контролируемого лечения и уменьшить число случаев прерванного лечения.
Для изучения влияния устойчивости к противотуберкулезным препаратам первой линии на исход туберкулезного процесса проанализировано 257 случаев туберкулеза легких (143 из гражданского сектора и 114 из системы заключения), чьи штаммы МБТ были изучены в НИОЗ на наличие лекарственной устойчивости методом ВАСТЕС. Результаты лечения таких больных, представленные в табл. 24, сходны с результатами в табл. 23, что позволяет судить о репрезентативности изученной выборочной совокупности.
У 257 больных, чьи штаммы МБТ протестированы на наличие лекарственной устойчивость радиометрическим методом ВАСТЕС, наблюдаются разные результаты лечения в зависимости от профиля чувствительности штамма МБТ к противотуберкулезным препаратам (табл. 25).
В гражданском секторе области при сохранении МБТ чувствительности к протестированным препаратам излечение зарегистрировано у 57,8% и 50,0% новых и ранее пролеченных случаев, соответственно (табл. 25). Следует отметить, что у новых случаев высокие проценты летальных исходов (53,8%) и безуспешного лечения (29,4%) происходят при инфицировании больного лекарственно чувствительным штаммом МБТ. При назначении стандартного режима химиотерапии больному, инфицированному чувствительным штаммом МБТ, и при регулярном приеме больным противотуберкулезных препаратов под непосредственным контролем со стороны медицинского персонала существуют все условия для благоприятного исхода заболевания. Большое количество неблагоприятных исходов (летальный исход и безуспешное лечение) у новых случаев в гражданском секторе свидетельствует о возможных недостатках во время лечения: не всегда обеспечен регулярный прием противотуберкулезных препаратов, который недостаточно контролируется. Кроме того, нельзя исключать возможность реинфицирования таких больных новыми штаммами МБТ, которые заведомо устойчивы к противотуберкулезным препаратам и предопределяют неблагоприятный исход туберкулеза.
В системе заключения организована строгая система контроля над лечением, где исключен нерегулярный прием противотуберкулезных препаратов. Поэтому у категории ранее пролеченных больных, инфицированных чувствительными штаммами МБТ, нет неблагоприятных исходов, а их процент у новых случаев значительно ниже (9,1%) по сравнению с гражданским сектором области.
При наличии у штамма МБТ устойчивости к одному и более препаратов отмечается снижение процента излечения и увеличение числа неблагоприятных исходов. Особую угрозу представляют собой штаммы МБТ, устойчивые ко всем препаратам первой линии. В гражданском секторе области и в системе заключения штаммы МБТ с множественной лекарственной устойчивостью обусловливают развитие летального исхода и безуспешного лечения у больных.
Молекулярная генетика МБТ, изолированных от больных туберкулезом в гражданском секторе области
Изучение молекулярной генетики МБТ в Архангельской области позволило раскрыть причины роста заболеваемости туберкулезом легких и широкого распространения устойчивости к противотуберкулезным препаратам. В настоящем исследовании проанализированы штаммы МБТ, изолированные от гражданского населения в 1998-1999 годах и от заключенных в 2001 году.
Степень трансмиссии штаммов МБТ, принадлежащих к разным генотипам, неодинакова на территории Архангельской области. Так, мы наблюдали доминирование трансмиссии штаммов МБТ семейства W-Beijing над трансмиссией штаммов МБТ других генотипов. В гражданском секторе соотношение показателей кластерности составило 92,5%/33,3%, а в местах лишения свободы соотношение показателей кластерности составило 96,6%/25,9%. Это доказывает, что степень трансмиссии у W-Beijing МБТ выше, чем у МБТ других генотипов.
Продолжительность изучения молекулярной генетики МБТ в Архангельской области не превышает трех лет, следовательно, его результаты могут быть использованы для интерпретации степени трансмиссии туберкулеза в популяции [218]. В частности, расчет показателя кластерности позволяет судить об уровне трансмиссии данного заболевания. В нашем исследовании показатели кластерности в гражданском секторе и в системе заключения составили 59,7% и 79,8% соответственно. Это свидетельствует об активной трансмиссии туберкулеза легких на территории Архангельской области.
Самый большой кластер в нашем исследовании представлен 55 больными (12 больных из гражданского сектора и 43 больных из мест лишения свободы). Исследования, проведенные в России с использованием RFLP анализа, выявили, что размер большинства кластеров не превышает 2-4 [6, 38]. Максимальный размер кластера в исследовании, проведенном в Северно-Западной части России, составил 10 больных [18]. В странах Азии при исследовании МБТ семейства W-Beijing кластеры состояли из 2, 3, 5 и 8 штаммов [179, 219]. Количество штаммов МБТ, изученных в выше перечисленных работах, в несколько раз превышало количество штаммов МБТ, исследованных нами. Большой размер кластеров еще раз доказывает активную трансмиссию МБТ семейства W-Beijing в Архангельской области.
Сравнение индивидуальных рисунков ДНК штаммов МБТ, изолированных от больных туберкулезом в системе заключения и в гражданском секторе области, выявило наличие одинаковых индивидуальных рисунков ДНК МБТ в этих двух системах. В обеих системах самые большие кластеры обладали идентичными генотипами, что указывает на наличие трансмиссии туберкулеза между заключенными и гражданским населением области. Больные, совершившие преступление, и заключенные, выпущенные на свободу до окончания лечения по поводу туберкулеза, могут играть негативную роль в распространении туберкулеза легких. Поэтому особое значение приобретает скоординированная работа противотуберкулезных служб области и системы заключения.
В качестве дополнительного молекулярно-генетического метода для изучения полиморфизма МБТ использовано сполиготипирование. Все штаммы МБТ обладали более чем 5 копиями вставочного элемента 1S6110, поэтому метод сполиготипирования не позволил провести большую дифференциацию штаммов МБТ. В большинстве случаев МБТ с идентичными рисунками ДНК согласно RFLP анализу имели одинаковые сполиготипы. Штаммы МБТ, изолированные от больных туберкулезом из гражданского сектора области, обладали большим полиморфизмом сполиготипов, чем штаммы МБТ, изолированные от больных туберкулезом в системе заключения, что еще раз подтверждает высокую степень трансмиссии туберкулеза в системе заключения.
Причины широкого распространения и доминирования МБТ семейства W-Beijing полностью не изучены. Преобладание W-Beijing МБТ предполагает наличие у них селективных преимуществ по сравнению с МБТ других генотипов. Одним из преимуществ является повышенная способность к накоплению мутаций в хромосомном материале, обусловливающих развитие лекарственной устойчивости.
При исследовании штаммов разных генотипов на устойчивость к противотуберкулезным препаратам установлено, что в гражданском секторе Архангельской области W-Beijing МБТ наиболее часто устойчивы к стрептомицину (73,6%) и изониазиду (62,3%), а множественная лекарственная устойчивость W-Beijing МБТ составляет 43,4%.
Штаммы МБТ других генотипов устойчивы к противотуберкулезным препаратам в меньшей степени, а именно множественная лекарственная устойчивость составляет всего 10,6%. При анализе лекарственной устойчивости МБТ, принадлежащих к семейству Т, установлено, что большинство штаммов МБТ (60,0%) были чувствительны ко всем протестированным препаратам, 3 штамма МБТ были устойчивы только к одному препарату (к изониазиду или этамбутолу), и один штамм МБТ обладал устойчивостью к двум выше перечисленным препаратам. Единственный штамм МБТ, представляющий семейство Haarlem в гражданском секторе области, был чувствителен ко всем препаратам. Штаммы МБТ, принадлежащие к семейству LAM, были чувствительны (33,3%), одновременно устойчивы к двум препаратам (50,0%) (изониазид и этамбутолу или изониазиду и стрептомицину) и к трем препаратам одновременно (16,7%) (изониазиду, рифампицину и стрептомицину).
