Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 9
1.1. Фосфорилирование митохондриальных белков и регуляция функций митохондрий. 9
1.1.1. Обнаружение фосфорилированных белков в митохондриях. Попытки идентификации фосфобелкое. Локализация протеинкиназ и протеинфосфатаз в митохондриях . 9
1.1.2. Регуляция НАДН-дегидрогеназ цикла Кребса системой вторичных мессенджеров. Роль Са2+ и фосфорилирования, зависимого от протеинкиназ и протеинфосфатаз. 14
1.2. Са2+-транспортирующая система и участие Са2+ в регуляции митохондриальных функций. 17
1.2.1. Са 4-транспортирующая система митохондрий. 17
1.2.2. Неселективная Саг+, CysA-чувствительная пора во внутренней мембране митохондрий . 21
1.3. Структура и функционирование FoFj-АТРазы митохондрий. 26
1.3.1. Хемиосмотический синтез АТФ. Сопряжение транспорта РҐ и синтеза АТР. Регуляция окислительного фосфорилирования с помощью дыхательного контроля. 26
1.3.2. Субъединичная структура FoFi-АТРазы, локализация субъединицeF0uF{ секторах. 27
1.3.3. Современные представления о механизме работы FJ^r АТРазы. Вращение субъединиц eF0uF/ секторах. Роль субъединиц «а», «Ь» и «с» в транспорте ионов Н 30
2. Материалы и методы исследования 38
3. Результаты и обсуждение 47
3.1. Спектр фосфобелков и относительные уровни включения 32Р. 47
3.2. Влияние ЭГТА, Са2+ и СССР на фосфорилирование 3.5 кДа пептида. 49
3.3. Очистка и идентификация 3.5 кДа фосфопептида. 51
3.3.1. Определение локализации фосфопептида в митохондриях . 51
3.3.2. Выделение и очистка 3.5 кДа фосфопептида. 53
3.3.3. Идентификация 3.5 кДа пептида как полипептида, иммунореактивиого к антителам к субъединице «с» FJ7)-АТРазы.56
3.4. Фосфорилирование ИРАСП и активность F0Fi-ATPa3bi. 57
3.4.1. Влияние ионов Са па окислительное фосфорилирование и активность FoF гАТРазы. 57
3.4.2. Влияние физиологических концентраций Са2+ на фосфорилирование/дефосфорилирование ИРАСП. 60
3.5. Фосфорилирование ИРАСП и открытие тРТР. 62
3.5.1. Дефосфорилирование ИРАСП при открытии тРТР и падении мембранного потенциала . 62
3.5.2. Влияние ИРАСП на процесс открытия неселективной митохондриальной поры. 65
3.5.3. Влияй ие ИРА СП на проводимость БЛМ. 6 8
Заключение 73
Выводы 77
Литература 79
- Обнаружение фосфорилированных белков в митохондриях. Попытки идентификации фосфобелкое. Локализация протеинкиназ и протеинфосфатаз в митохондриях
- Неселективная Саг+, CysA-чувствительная пора во внутренней мембране митохондрий
- Определение локализации фосфопептида в митохондриях
- Дефосфорилирование ИРАСП при открытии тРТР и падении мембранного потенциала
Введение к работе
Обратимое фосфорилирование белков является одной из основных посттрансляционных модификаций, ответственных за регуляцию различных видов клеточной активности системой вторичных мессенджеров. Как правило, Са2+ или сАМР как вторичные
^ мессенджеры изменяют активность протеинкиназ (ПК) или
> протеинфосфатаз (ПФ), которые в свою очередь поддерживают
фосфорилирование ферментов-мишеней на определенном уровне. Согласно данным Tomaska, каждый третий белок в эукариотических клетках подвержен обратимому фосфорилированию (Tomaska, 2000). Фосфорилирование белка-мишени ведет к конформационной перестройке молекулы и соответствующим изменениям
j ферментативной активности или взаимодействия с другими
клеточными компонентами.
1 Данные о фосфорилировании митохондриальных белков и о
регуляции функций митохондрий системой вторичных мессенджеров крайне ограничены. За последние 20 лет обнаружено и детально изучено фосфорилирование нескольких дегидрогеназ цикла Кребса, локализованных в митохондриальном матриксе, и соответствующая регуляция активности дегидрогеназ ионами Са+ как вторичными мессенджерами посредством ПК-зависимого фосфорилирования (Bradford and Yeaman, 1986; Denton and McCormack, 1990; Hansford, 1994; Nichols "and Denton, 1995; Rutter et al., 1998). Однако до последнего времени отсутствовали какие-либо определенные данные и представления о возможности ПК- и ПФ- зависимой регуляции таких ключевых процессов митохондрий, как синтез АТФ, перенос электронов по дыхательной цепи и транспорт ионов непосредственно
л через внутреннюю митохондриальную мембрану. К настоящему
времени показано, что ряд белков, фосфорилируемых
протеинкиназами, тесно связан с комплексами дыхательной цепи.
Фосфобелок с молекулярной массой 18 кДа из митохондрий бычьего
сердца идентифицирован как субъединица комплекса I, а фосфобелок
17 кДа — как субъединица цитохром-«с»-оксидазы; показана также
ассоциация 42 к Да фосфобелка с комплексами I, III, IV и V
митохондрий (SardanelH et al., 1995; Papa et al., 1996; Steenaart and
Shore, 1997). Однако, остается неясным, каким образом
фосфорилирование/дефосфорилирование мембраносвязанных
митохондриальньгх белков влияет на функции митохондрий. В целом можно констатировать, что вопрос о возможности регуляции трансформации энергии во внутренней митохондриальной мембране системой вторичных мессенджеров в настоящее время остается открытым.
В связи с вышеизложенным, представляется актуальным исследование фосфор ил йрования митохондриальньгх белков с целью возможного выявления новых фосфопептидов, выяснения их локализации в митохондриях и участия в процессах синтеза АТФ и транспорта ионов кальция. Эти исследования позволят выяснить, подвержены ли системы преобразования энергии во внутренней митохондриальной мембране ПК-зависимой регуляции системой вторичных мессенджеров.
Целью данной работы являлось выявление новых мембраносвязанных фосфопептидов в митохондриях, исследование факторов, регулирующих их фосфорилирование, и выяснение возможности регуляции функций митохондрий путем фосфорилирования/дефосфорилирования этих пептидов.
Мы планировали обнаружить и исследовать новые фосфорилированные пептиды в митохондриях, однако из трех
7 найденных фосфопептид о в только один представлял интерес для исследования и изучался нами детально.
В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:
Обнаружение новых фосфорилированных полипептидов (одного или нескольких) в митохондриальной мембране и выявление оптимальных условий для их фосфорилирования.
Идентификация вновь обнаруженного фосфорилированного полипептида и выявление его принадлежности к функциональным системам митохондрий.
Демонстрация возможности регуляции фосфорилирования/ дефосфорилирования полипептида ионами Са2+ как вторичными мессенджерами.
Выявление вида протеинкиназ/протеинфосфатаз, осуществляющих фосфорилирование/дефосфорилирование обнаруженного полипептида.
Изучение корреляции уровня фосфорилирования найденного полипептида с функциональными параметрами митохондрий: скоростью окислительного фосфорилирования, транспортом Са , мембранным потенциалом и проницаемостью митохондриальных мембран.
Научная новизна.
Впервые во внутренней мембране митохондрий обнаружен
низкомолекулярный фосфопептид, молекулярная масса которого была
определена равной 3.5 кДа согласно его электрофоретической
подвижности в полиакриламидном геле. Методом
иммунопреципитации и Вестерн-блоттинга полипептид был идентифицирован как неизвестная ранее фосфорилированная форма субъединицы «с» FoFrATPa3bi митохондрий и был назван как
8 иммунореактивный к антителам к субъединице «с» полипептид (ИРАСП). Установлено, что фосфорилирование/дефосфорилирование ИРАСП модулируется Са2+ в пределах физиологических концентраций, и этот процесс коррелирует с изменением синтеза/гидролиза АТФ FoFj-АТРазой митохондрий. Таким образом, в настоящей работе впервые получены данные, свидетельствующие о возможности регуляции процессов преобразования энергии во внутренней мембране митохондрий системой вторичных мессенджеров путем обратимого фосфорилирования ИРАСП. Показано, что фосфорилирование ИРАСП активируется бутирил-сАМР, что свидетельствует о том, что фосфорилирование ИРАСП осуществляется сАМР-зависимой ПК А. Установлена взаимосвязь дефосфорилирования ИРАСП с открытием неселективной Са2+-индуцируемой, циклоспорин А-чувствительной поры во внутренней мембране митохондрий (тРТР). Найдено, что ИРАСП в дефосфорилированной форме стимулирует открытие тРТР и вызывает увеличение проводимости бислойных липидных мембран (БЛМ) путем формирования в них одиночных каналов проводимости. Научно-практическая ценность.
Обнаружение фосфорилированной формы субъединицы «с» FoFi-АТРазы открывает возможность регуляции энергопродукции в клетках и митохондриях внешними стимулами (гормонами и др.) путем передачи сигнала с плазматической мембраны клетки посредством каскада вторичных мессенджеров непосредственно на FoFi-АТРазу. Кроме того, участие ИРАСП в регуляции или формировании неселективной митохондриальной поры расширяет представления о строении и функционировании тРТР, открытие которой считается одной из основных стадий развития апоптоза и некроза - явлений, контролирующих морфогенез и регенерацию, а также возникновение различных заболеваний и патологий.
Обнаружение фосфорилированных белков в митохондриях. Попытки идентификации фосфобелкое. Локализация протеинкиназ и протеинфосфатаз в митохондриях
Исследования возможности фосфорилирования белков в митохондриях начались в 50х - начале 60х годов XX века. Было показано, что такие белки как казеин (Burnett and Kennedy, 1954), фосвитин (Rose and Heald, 1961) и некоторые другие цитоплазматические белки (Ливанова, 1962) фосфорилируются при инкубации их с митохондриями печени крыс в присутствии 32Р. Было сделано предположение о том, что данные экзогенные протеины являются модельным субстратом для митохондриальных протеинкиназ (ПК), способных присоединять Р по серииовым остаткам.
Позже в митохондриях клеток млекопитающих были обнаружены и идентифицированы различные сАМР-зависимые и независимые протеинкиназы, в том числе и особое семейство ПК, подобных гистидиновым ПК прокариот (Vardanis, 1977; Henrikson and Jergil, 1979; Kitagawa and Racker, 1982; Burgess and Yamada, 1987; Schwoch et al., 1990; Sarrouilhe and Baudry, 1996). Протеинкиназы были найдены в межмембранном пространстве (Henrikson and Jergil, 1979; Sarrouilhe and Baudry, 1996), во внутренней мембране и матриксе митохондрий (Vardanis, 1977; Henrikson and Jergil, 1979; Kitagawa and Racker, 1982; Schwoch et al., 1990). Было установлено, в частности, что протеинкиназа А (ПК А) и ее специфические изоформы локализованы в разных частях митохондрий, включая внутреннюю мембрану. Особые якорные белки связывают цитоплазматическую ПК А и доставляют ее в различные мембранные компартменты, таким образом достигается и локализация ПК А во внешней митохондриальной мембране (Huang et ah, 1999). Следует отметить накапливающиеся данные о существовании таких якорных белков (АКАР) и в самих митохондриях. Кроме того, из митохондрий почек быка была выделена казеинкиназа II (СКП), которая локализуется в основном в межмембранном пространстве (Damuni and Reed, 1988). Также обнаружена сперминзависимая транслокация казеинкиназы II из межмембранного пространства во внутреннюю мембрану митохондрий (Sarroirilhe and Baudry, 1996). Было обнаружено, что эндогенные проте инкиназы митохондрий могут фосфорилировать как мембраносвязанные белки, так и «растворимые» белки, локализованные в матриксе митохондрий (Henrikson and Jergil, 1979; Kitagawa and Racker, 1982, Backer et al., 1986; Ferrari et alM 1990, Kitagawa et al., 1997). Показано, что фосфорилирование белков митохондрий могут осуществлять экзогенные протеинкиназы, в частности, каталитическая субъединица цитозольной ПК А (Technikova-Dobrova et al., 1994; Bera et al., 1995) и Са-фосфолипид-зависимая ПК С (Hashimoto and Yamamura, 1990).
В одной из первых работ, посвященных фосфорилированию белков митохондрий эндогенными ПК (Linn et al., 1969а; Linn et al., 1969b) было показано включение радиоактивного фосфора в «растворимый» белок, который был идентифицирован как а-субъединица пируватдегидрогеназы (ПДГ). Фосфорилирование а-субъединицы ПДГ было затем подтверждено в лаборатории Дентона (Denton et al., 1972; Hughes and Denton, 1976). Также было продемонстрировано фосфорилирование дегидрогеназы 2-оксикислот с разветвленной цепью (Odessey, 1980). В дальнейшем Хенрикссон и Джергил (Henriksson and Jergil, 1979) обнаружили включение 32Р в белок с молекулярной массой 47.5 кДа, локализованный в митопластах митохондрий печени крыс, и в относительно низкомолекулярный материал, представляющий собой, по-видимому, гетерогенную фракцию, из наружной мембраны митохондрий. В митохондриях мозга крыс были обнаружены два белка с молекулярными массами 32 кДа и 42_кДа, фосфорилирующиеся при инкубации митохондрий в присутствии [у-32Р]АТР, причем 32 кДа фосфопротеин был предположительно идентифицирован как автофосфорилирующаяся субъединица сукцинил-КоА-синтетазы (Steiner and Smith, 1981). Большое количество фосфопротеинов (Мг 66, 57,48, 40-41,38.5, 29, 23-22, 17.5, 16, 13, 12.5 кДа) было обнаружено в различных фракциях митохондрий (наружная, внутренняя мембраны, митохондриальныи матрикс) дрожжей (Saccharomyces cerevisae) при инкубации с [ P]Pj как целых клеток, так и изолированных митохондрий (Muller and Bandlow, 1987; da Silva et al., 1991). Однако, природа данных фосфопептидов, за исключением 41 кДа белка, являющегося субъединицей пируватдегидрогеназного комплекса, осталась не ясна. Бэкер с соавторами (Backer et al., 1986) показали преимущественное фосфорилирование 47 и 36 кДа полипептидов из митохондрий печени крыс, и очень слабое фосфорилирование белков с молекулярной массой 107, 70, 53 и 17 кДа, а в присутствии Са2+-фосфолипид-зависимой протеинкиназы С (ПК С) наблюдали дополнительное фосфорилирование белков с Мг 69, 37 и 17кДа. Авторы определили 47 к Да белок, как а-субъединицу пируватдегидрогеназы, исходя из сходства молекулярных масс и внутримитохондриальной локализации данного белка, остальные фосфопротеины остались неидентифицированными.
Более подробное исследование фосфорилирования митохондриальных белков было проведено Феррари и сотр. (Ferrari et al, 1990). Авторы наблюдали фосфорилирование четырех митохондриальных белков (Мг 50, 47, 44 и ЗбкДа) при инкубации интактных митохондрий печени крыс в присутствии [ P]Pj или [у- Р]АТР. Белок с молекулярной массой 36 кДа фосфорилировался быстрее остальных и его фосфорилирование проходило в условиях ингибирования синтеза АТР карбоксиатрактилозидом. Этот белок авторы предлагают считать одной из субъединиц сукцинил-КоА-синтетазы ввиду сходности молекулярной массы данного белка с Мг одной из субъединиц сукцинил-КоА-синтетазы, (32, 38.5 кДа, в зависимости от ткани) и неустойчивости включения 32Р в данный белок при низких значениях рН, подобно соединению Р-фермент, которое образуется как промежуточное соединение в результате реакции: сукцинил-КоА + ГДФ + Фн - сукцинат + ГТФ + КоА.
Белок с молекулярной массой 44 кДа, по мнению авторов, соответствует а-субъединице пируватдегидрогеназного комплекса, 47 кДа полипетид, возможно, является а-субъединицей дегидрогеназы 2-оксикислот с разветвленной цепью, а 50 кДа — цитохромом Р-450.
Таким образом, к началу 90х годов с достаточной степенью достоверности усилиями многих исследователей было определено, что ПК зависимому фосфорилированию подвержены три митохондриальных белка: 32-36 кДа субъединица сукцинил-КоА-синтетазы, 42 кДа субъединица пируватдегидрогеназы и 48 кДа субъединица дегидрогеназы оксикислот с разветвленной цепью.
Неселективная Саг+, CysA-чувствительная пора во внутренней мембране митохондрий
Ионы Са2+ являются селективными индукторами РТР. Основным классическим синергистом Са2+ считается неорганический фосфат (Фн). Одни авторы (Petronilli et al., 1993) считают, что Фн должен войти в матрикс для проявления своего действия, возможно, за счет своей способности забуферивать рН матрикса. По другой гипотезе (Hutson et al., 1989) Фн может действовать, вызывая уменьшение концентрации АДФ в матриксе. Поскольку АДФ является более эффективным ингибитором РТР, нежели АТФ, снижение концентрации АДФ в результате ее превращения в АТФ может способствовать открыванию РТР.
Кроме этого, существует более десятка других индукторов. Среди них есть редокс-агенты (ацетоацетат, органические перекиси, менадион, аллоксан, аскорбат), SH-реагенты, АНТ-лиганды (атрактилозид, карбоксиатрактилозид) и агенты, уменьшающие мембранный потенциал (Zoratti and Szabo, 1995). Механизмы действия этих соединений недостаточно ясны. Есть основания думать, что эффекты различных окислителей являются результатом превращения SH-групп в дисульфидные мостики, что приводит к открыванию РТР в присутствии Са2+.
Бернарди и соавторы недавно предположили, что эффекты многих индукторов могут заключаться в модуляции "чувствительности" поры к дЧ м (Petronilli et al., 1993). Так как открытие РТР является д м-зависимым процессом, то, соответственно, любой агент, вызывающий деполяризацию внутренней мембраны, будет способствовать переходу внутренней митохондриальной мембраны в состояние высокой проницаемости.
В конце 80-х годов группы Кромптона (Crompton et al., 1988) и Пфайффера (Broekemeier et al., 1989) обнаружили, что циклоспорин А (CysA), используемый как иммуноподавляющий агент, сильно тормозит открытие РТР в субмикромолярных концентрациях. Непосредственной мишенью его действия считают циклофилины -белки с пептид ил-пролил-цис-транс-изомеразной активностью. Сегодня ингибирование РТР циклоспорином А рассматривается как селективная характеристика состояния высокой неспецифической проницаемости мембраны митохондрий.
Исследования механизма возникновения Са -индуцированного изменения проницаемости внутренней мембраны митохондрий привели к заключению, что в митохондриальной мембране существуют неселективные поры, ответственные за Са -индуцированное изменение проницаемости. Размер этих пор был вычислен из измерений коэффициента отражения Стеивермана (Massari and Azzone, 1972) и оказался равным 2-3 нм.
Согласно современным представлениям РТР — это белковый комплекс, формирующийся в контактных участках митохондрий ассоциацией потенциал-зависимого анионного канала (VDAC) внешней мембраны и адениннуклеотид-транслоказой (АНТ) внутренней мембраны митохондрий, циклофилина, локализованного в матриксе и, возможно, другими белками. Участие АНТ в формировании РТР было предположено из наблюдений, что высокоаффинные и специфические лиганды АНТ, а именно, атрактилозид и карбоксиатрактилозид, бонгкрековая кислота, а также АДФ, ацил-СоА, пиридоксаль-5 -фосфат, связывающиеся с АНТ, влияют на РТР. Ле Кок и Ле Кок (Le Quoc and Le Quoc, 1988) проанализировали влияние этих ингибиторов и пришли к заключению, что для определения того, будет ли иметь место РТ или нет, важна конформация АНТ. Конформация "С" — фиксирующая АНТ на стороне мембраны, обращенной в цитозоль, предопределяет открытое состояние поры, а "М", фиксирующее АНТ на стороне матрикса митохондрий, - ингибирование ее. Новгородов с сотрудниками (Novgorodov et. Al., 1994) подвергли сомнению факт непосредственного участия АНТ в формировании поры и предложили модель, в которой изменение конформации транслоказы влияет на неизвестную белковую пору. Взаимодействие между этими структурами может иметь место в результате физической ассоциации, или же АНТ действует на пору посредством изменения потенциала на внутренней мембране митохондрий.
Основное подтверждение причастности АНТ к формированию РТР комплекса было получено в экспериментах Брустовецкого и сотр. (Brustovetsky and Klingenberg, 1996; Brustovetsky et al., 2002 ). Ими было продемонстрировано, что высокоочищенный препарат АНТ, изолированнный из митохондрий, формирует в липосомах каналы, открытие которых индуцируется Са . Удаление Са из среды измерения приводило к закрытию канала, бонгкрековая кислота частично ингибировала активность канала, а при комплексном воздействии бонгкрековой кислоты и АДФ наблюдалось полное ингибирование активности, в то время как карбоксиатрактилозид не влиял на проводимость канала.
Ле Кок и Ле Кок (Le Quoc and Le Quoc, 1985) на основании экспериментов, проводившихся на митопластах, предположили, что при использованных специфических условиях, увеличение проницаемости мембраны могло происходить из-за вовлечения молекул порина из внешней мембраны во внутреннюю, возможно, через участки контактов мембран.
С другой стороны, известно, что и с VDAC, и с АНТ образует комплекс переферический бензодиазепиновый рецептор (PBR), который, как считается, локализуется во внешней мембране митохондрий или в местах контактов внешней и внутренней мембраны (McEnery et al., 1992; Kinnally et al., 1993; Зоров, 1996; Galiegue et al., 2003). По этой причине рассматривается участие PBR в формировании комплекса РТР. Поскольку РТР селективно блокируется CysA, то циклофилин — CysA-связывающий иммунофилин - также считается причастным к РТР, но он рассматривается скорее как регулятор поры, чем как ее структурный компонент (Halestrap and Davidson, 1990).
Определение локализации фосфопептида в митохондриях
Как показано на рис. 3 (А), добавление небольшого количества Са (20 нмоль на 1 мг митохондриального белка), не вызывающего открытие неселективных пор во внутренней митохондриальной мембране, приводит к увеличению включения Р в 3.5 кДа полипептид. И, наоборот, связывание следов Са при добавлении ЭГТА значительно уменьшает включение Р. Также сильное подавление включения 32Р наблюдается при диссипации мембранного потенциала в результате добавления СССР. Добавление к суспензии митохондрий блокатора АТФ/АДФ-транслоказы — карбоксиатрактилозида - приводит к заметному снижению включения 32Р в 3.5 кДа полипептид. Это свидетельствует о том, что по меньшей мере частично фосфорилирование 3.5 кДа полипептида происходит со стороны матрикса. Существенное увеличение включения 32Р в 3.5 кДа происходит в присутствии бутирил-сАМР, что говорит о фосфорилировании данного полипептида с помощью сАМР-зависимой ПК.
В связи с тем, что уровень фосфорилирования белков зависит от активности ПК и ПФ, было изучено влияние условий инкубации митохондрий на дефосфорилирование 3.5 кДа полипептида. Интактные митохондрии инкубировали с [у-32Р]АТР, а затем отделяли от меченой АТР центрифугированием, после чего митохондрии инкубировали в отсутствие меченой АТФ в различных условиях в течение 5 минут, когда и происходило дефосфорилирование. На рис. 3 (Б) показано, что в присутствии Са содержание Р в 3.5 кДа пептиде несколько снижается, а при связывании примесного Са2+ в среде инкубации посредством ЭГТА, наоборот, увеличивается, т.е. ионы Са2+ необходимы для дефосфорилирования 3.5 кДа полипептида. Снижение мембранного потенциала в результате добавления СССР практически не влияет на содержание Р в 3.5 кДа пептиде при инкубации митохондрий в отсутствие [у- Р]АТР, что говорит о том, что мембранный потенциал оказывает влияние на фосфорилирование 3.5 кДа полипептида протеинкиназами.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что фосфорилирование 3.5 кДа полипептида снижается при падении мембранного потенциала, что может быть связано с потенциал зависимым изменением состояния полипептида либо с внутримитохондриальным перераспределением протеинкиназ (Sarrouilhe and Baudry, 1996). Умеренная нагрузка Са2+ увеличивает как фосфорилирование, так и дефосфорилирование 3.5 кДа полипептида, а хелатирование ионов Са2+ в среде инкубации посредством ЭГТА подавляет его фосфорилирование, что указывает на возможную активацию ионами Са как прогеинкиназы, так и протеинфосфатазы 3.5 кДа полипептида.
Известно, что замораживание/размораживание митохондрий приводит к разрушению митохондриальных мембран, а последующее центрифугирование суспензии митохондрий позволяет отделить «растворимые» белки, локализованные в матриксе и в межмембранном пространстве, отмембраносвязанных белков.
В связи с этим интактные митохондрии инкубировали в присутствии [у- Р]АТР, затем быстро охлаждали до +4С и отделяли от [у- Р]АТР центрифугированием. Ресуспендированные митохондрии дважды замораживали/размораживали и затем фракционировали согласно схеме, представленной на рис. 4 (А).Аликвоты каждой фракции подвергали электрофорезу в ПААГ, и уровень включения Р в 3.5 кДа фосфопептид оценивали, как описано в Методах. Как показано на рисунке 4 (Б), после отделения митохондрий от [у-32Р]АТР наблюдается незначительное повышение включения Р в 3.5 кДа фосфопептид. Это может быть результатом фосфорилирования в процессе центрифугирования и ресуспендирования митохондрий. Замораживание/размораживание митохондрий практически не влияет на содержание 32Р в фосфопептиде. После центрифугирования замороженной/ размороженной суспензии митохондрий более 90% 3.5 кДа пептида обнаруживается в осадке, содержащем мембраны митохондрий, и лишь весьма незначительное количество - в супер натайте. Таким образом, можно утверждать, что 3.5 кДа фосфопептид прочно связан с мембранами митохондрі» " . Следует отметить, что в отдельных экспериментах 3.5 кДа пептид Зыл обнаружен нами в частично очищенных препаратах олигомицин-чувствительной АТРазы, изолированной из митохондрий печени крыс согласно методу, описанному Евтодиенко (Евтодиенко, 1979). Ранее не сообщалось о существовании в митохондриальной мембране подобного фосфорилируемого полипептида. Однако, в митохондриях были обнаружены низкомолекулярные, гидрофобные, локализованные во фракции внутренних митохондриальных мембран, пептиды, такие как Са -транспортирующий пептид (3.0 кДа), выделенный Иенг и Шамо (Jeng and Shamoo, 1980), и субъединица «с» F0FrАТРазы, молекулярная масса которой в результате аномального поведения при электрофорезе была оценена равной 3.5 кДа (Fearnley et al., 1990). В связи с этим была предпринята попытка выделения 3.5 кДа фосфопептида из митохондрий в условиях, которые характерны для выделения гидрофобных мембраносвязанных пептидов, в частности субъединицы «с» F„Fi-АТРазы. Для получения 3.5 кДа фосфопептида митохондрии, фосфорилированные в присутствии [у- Р]АТР, экстрагировали смесью хлороформ/метанол (хл/м). после чего различные фракции экстракта высушивали, ресуспеидировали в солюбилизирущем растворе и подвергали электрофорезу в ПААГ и последующей радиоавтографии.
Дефосфорилирование ИРАСП при открытии тРТР и падении мембранного потенциала
Следует отметить, что CysA в комплексе с цикл оф ил ином является специфическим ингибитором протеинфосфатазы РР2В (кальцинейрина) (Swanson et al., 1992). Из вышеприведенных результатов следует, что дефосфорилирование (т.е. протеинфосфатазная активность) стимулируется ионами Са . Кроме того, единственной фосфатазой, которая непосредственно активируется Са , является Са-калмодулин-активируемая серин-треониновая фосфатаза РР2В (кальцинейрин). Таким образом, можно предположить, что наблюдаемое снижение уровня фосфорилирования ИРАСП при открытии тРТР является результатом повышения уровня дефосфорилирования данного полипептида, и CysA может ингибировать этот процесс. Известно, что CysA блокирует открытие тРТР вследствие устойчивого связывания с митохондриальным белком - циклофилином (Nicolli et.al., 1996), а формирующийся комплекс является в свою очередь ингибитором фосфатазной активности кальцинейрина (Rusnak and Mertz, 2000). Данные о наличии кальцинейрина в митохондриях очень немногочисленны, однако показано, что кальцинейрин связывается с митохондриальной мембраной в присутствии белков семейства Bcl-2 (Hemenway and Heitman, 1999; Wang et al., 1999), а в митохондриях найдено несколько калмодулин-связывающих белков (Gazotti et al., 1984). Недавно сотрудниками нашей лаборатории продемонстрировано с помощью иммунохимического анализа, что кальцинейрин присутствует в митохондриях мозга (Krestinina et al., 2003). На основании полученных результатов, показывающих, что Са +-индуцированное и CysA-чувствительное дефосфорилирование ИРАСП происходит при открытии тРТР, мы сделали заключение, что этот процесс может быть связан с циклофилином и, возможно, ингибируется кальцинейрином. ИРАСП в митохондриальной мембране. Как видно из рис. 12 (А), в контрольном эксперименте тРТР открывалась после двух добавок Са (критическая нагрузка около 150 цМ). После преинкубации митохондриальной суспензии с 10 ил ИРАСП (10 цл ИРАСП соответствовали препарату, полученному из 16 \хт митохондриального белка) для индукции тРТР было достаточно 30 цМ Са2+. Также в этих условиях наблюдали сильное снижение фосфорилирования ИРАСП в митохондриальной мембране (рис. 12, А). Инкубация митохондрий с антителами к субъединице «с», которые, предположительно, могут связывать эндогенную субъединицу «с», приводила к увеличению критической нагрузки Са2+ и практически не оказывала влияния на фосфорилирование полипептида. Следует заметить, что в описанном эксперименте использовали дефосфор илиро ванную форму ИРАСП, которую выделяли из митохондрий с открытой тРТР; фосфорилированную форму также тестировали, и ее действие на проницаемость митохондриальной мембраны было существенно меньшим.
Полученные данные позволяют предположить, что способность Mg-ATP закрывать неселективную митохондриальную пору, показанная ранее в нашей лаборатории (Evtodienko, 2000), может быть объяснена фосфорилированием субъединицы «с» митохондриальной АТРазы.
Хорошо известно, что открытие тРТР сопровождается набуханием митохондрий. Нами было показано, что добавление ИРАСП к суспензии митохондрий вызывает их набухание, зависимое от концентрации добавленного пептида. Как показано на рис. 13 (А), увеличение концентрации ИРАСП от 2.5 мкл до 10 мкл вызывает снижение оптической плотности в 2 раза и сильное набухание митохондрий. Кроме того, обнаружено, что индукция набухания ИРАСП увеличивается в присутствии Са2+ (рис. 13, Б).
Таким образом, обнаруженное нами почти полное дефосфорилирование ИРАСП при открытии тРТР может играть существенную роль в формировании пассивных неселективных или РҐ-специфических ионных каналов во внутренней митохондриальной мембране. Это может происходить как в результате прямой модификации ЬҐ-каналов FoFi-АТРазы, в которой принимает участие субъединица «с», так и в результате изменения взаимодействия субъединицы «с» с другими субъединицами секторов Fo и F].
Мы предполагаем, что фосфорилированная форма субъединицы «с» принимает участие в «активном» или «сопряженном» транспорте ионов FT1" через FoFpATP-синтетазу, что приводит к синтезу АТФ, а дефосфорилированная форма субъединицы «с» участвует в «пассивном» («бесполезном») транспорте ионов, при котором происходит разобщение Fo и \ секторов АТР-синтетазы.
