Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Действие УФ-света на структуру и функции белков и липидов 12
1.1. Механизмы пероксидного окисления липидов в биологических мембранах. Фотомодификации липидного компонента биомембран 12
1.2. Влияние УФ-излучения на белки антиоксидантной системы крови 25
ГЛАВА 2. Бронхиальная астма: механизмы формирования, пути коррекции патологического состояния 33
2.1. Формирование и развитие бронхиальной астмы 33
2.2 Механизм действия глюкокортикостероидных гормонов 42
Экспериментальная часть 53
ГЛАВА 3. Объекты и методы исследования 53
3.1. Объекты исследования 53
3.2. Методы исследования 53
3.2.1. Получение лейкоцитарной массы 53
3.2.2. Выделение лимфоцитов из крови человека 53
3.2.3. Получение нейтрофилов 54
3.2.4. Определение интенсивности люминолзависимой хемилюминес ценции иммуноцитов - 55
3.2.5. Получение супернатанта лимфоцитов 58
3.2.6. Определение супероксиддисмутазной активности лимфоцитов методом люминолзависимой хемилюминес ценции 58
3.2.7. Определение активности миелопероксидазы нейтрофилов 59
3.2.8. Облучение клеток крови 61
3.2.9. Методика проведения АУФОК 61
3.2.10. Методика проведения экстракорпоральной ультрафиолетовой и фармакологической модификации лимфоцитов крови 64
3.2.11. Регистрация спектров флуоресценции зонда 1-анилинонафталин-8-сульфоната (АНС) 64
3.2.12. Получение лимфоцитарных лизатов для определения концентрации цитокинов 68
3.2.13. Определение концентрации ИЛ-ір и ИЛ-2 в лизатах лимфоцитов методом иммуноферментного анализа 68
3.2.14. Исследование синтеза супероксиддисмутазы de novo в лимфоцитах крови человека 70
3.2.15. Определение жизнеспособности лимфоцитов с помощью трипанового голубого 70
3.2.16. Статистическая обработка результатов экспериментов 71
Результаты экспериментов и их обсуждение 72
ГЛАВА 4. Исследование воздействия УФ-света и дибазола на лимфо-цитарные клетки 72
4.1. Влияние УФ-света и дибазола на лимфоциты крови доноров 72
4.2. Исследование взаимодействия дибазола с лимфоцитами крови доноров методом флуоресцентных зондов 77
4.3. Динамика показателей СОД-активности и интенсивности процессов ПОЛ лимфоцитов больных с гнойными патологиями в ходе проведения УФМЛ с дибазолом 82
ГЛАВА 5, Сочетанное воздействие УФ-света и циклоферона на лейкоцитарные клетки 94
5.1. Влияние УФ-облучения и циклоферона на показатели СОД-активности и интенсивность ПОЛ лимфоцитов донорской крови 94
5.2. Исследование продукции интерлейкина 1 {3 и интерлейкина 2 фотом одифицированными лимфоцитами 104
5.3. Действие УФ-света и циклоферона на нейтрофильные лейкоциты 108
5.4. Изучение опосредованного действия УФ-света и циклоферона на функциональную активность нейтрофилов крови доноров 118
5.5. Влияние УФМЛ с циклофероном на показатели СОД-активности и интенсивности ПОЛ лимфоцитов больных с гнойными патологиями и бронхиальной астмой 123
ГЛАВА 6. Исследование действия УФ-света и глюкокортикостероидных гормонов на лимфоцитарные клетки 131
6.1. Исследование взаимодействия дексаметазона с лимфоцитами крови доноров с помощью флуоресцентных зондов 132
6.2. Влияние фотомодифицированных и инкубированных с дексамета-зоном лимфоцитов на функциональную активность нейтрофилов доноров 137
6.3. Влияние УФ-облучения и дексаметазона на продукцию некоторых цитокинов лимфоцитами доноров 139
6.4. Динамика СОД-активности и интенсивности процессов ПОЛ лимфоцитов больных бронхиальной астмой в ходе проведения УФМЛ с глюкокортикостероидными гормонами 141
6.5. Продукция некоторых цитокинов лимфоцитами больных бронхи альной астмой на отдельных этапах проведения УФМЛ с глюкокорти костероидными гормонами 155
Заключение 164
Выводы 170
Список литературы
- Влияние УФ-излучения на белки антиоксидантной системы крови
- Механизм действия глюкокортикостероидных гормонов
- Определение интенсивности люминолзависимой хемилюминес ценции иммуноцитов
- Исследование взаимодействия дибазола с лимфоцитами крови доноров методом флуоресцентных зондов
Введение к работе
Актуальность темы. Высокая интенсивность свободнорадикальных окислительных процессов в клетке в случае недостаточной активности компенсирующих систем приводит в масштабах организма к окислительному стрессу и, вследствие этого, к многочисленным патологиям, в том числе к различным бронхо-легочным заболеваниям (S.D. Varaia et ai., 1995; S. Llesuy et aL, 1995). Повреждение активными кислородными метаболитами (АКМ) и окисленными липидами белков и нуклеиновых кислот может привести к нарушению иммунных функций, инициированию воспалительных процессов, развитию онкологических и нейрологических заболеваний (М.Р. Holsapple et al., 1996).
Внутриклеточный процесс детоксикации реактивных кислородных метаболитов включает энзиматические системы супероксиддисмутазы (СОД), каталазы, глутатионтрансферазы и глутатионпероксидазы, а также молекулы-ловушки свободных радикалов — витамины С, Е, каротиноиды и др. (Н.К. Зенков с соавт., 2001). К антиоксидантам первого уровня защиты клетки от токсического действия активных форм кислорода (АФК) относят СОД, дис-мутирующую супероксидные анион-радикалы до пероксида водорода иі молекулярного кислорода.
Кроме того, важную роль в регуляции окислительно-восстановительного гомеостаза крови играют полиморфноядерные лейкоциты (ПМЯЛ), способные в определенных условиях генерировать АФК. Так, при активации лимфоциты способны к развитию явления, похожего на дыхательный «взрыв» с генерацией АКМ (Н.К. Зенков с соавт., 2001). Активация иммуноцитов и интенсификация пероксидного окисления липидов (ПОЛ) — процессы взаимосвязанные: активация фагоцитоза, сопровождающаяся увеличением образования АФК, приводит к усилению ПОЛ, и, наоборот, продукты ПОЛ способны сенсибилизировать нейтрофилы (Г.И. Клебанов с соавт., 1990). Активность ферментов антиоксидантной системы (АОС) зависит как от уровня АФК, так и от содержания в крови продуктов ПОЛ (Н.Б. Побе- резкина, Л.Ф. Осинская, 1989).
Помимо этого, АФК участвуют в пролиферации лимфоцитарных клеток. Так, увеличение уровня супероксидного анион-радикала стимулирует пролиферацию лимфоцитов, а накопление пероксида водорода, наоборот, является сигналом к ингибированию этого процесса. В то же время, данные клетки, будучи мигрирующими, отражают изменения, происходящие в организме (М.В. Робинсон с соавт., 1986). Следовательно, лимфоциты можно рассматривать как «ферментное зеркало» организма, отражение его метаболических процессов.
Одним из возможных регуляторов окислительно-восстановительного равновесия в клетках иммунной системы является УФ-свет. Рядом авторов показано, что клеточные и гуморальные компоненты крови, подвергнутые УФ-облучению в физиологических дозах, могут оказывать регулирующее действие на окислительный гомеостаз (Л.В. Шабуневич с соавт., 1986; В.Г. Артюхов с соавт., 2003) и иммунную систему организма в целом (Е.Б. Жи-бурт с соавт., 1995; K.D. Obolenskaya et al., 1991).
Несмотря на большое количество экспериментальных данных, молеку-лярно-клеточные механизмы регуляторного действия УФ-света на окислительно-восстановительный гомеостаз изучены недостаточно. Знания об общих закономерностях и механизмах действия УФ-излучения на про- и анти-оксидантное равновесие позволяют подвести научно-обоснованный теоретический фундамент практического использования УФ-света в медицине.
В настоящее время при лечении патологий, сопровождающихся значительной интоксикацией организма и иммунодефицитными состояниями, активно используется сочетанное воздействие УФ-облучения и фармакологических препаратов на иммунокомпетентные клетки (В.М. Земсков с соавт., 1993). В связи с вышесказанным представляется актуальным изучение возможности регулирования окислительно-восстановительного равновесия в клетках иммунной системы путем сочетанного воздействия на них модуляторов физической и химической природы (УФ-света, иммуностимуляторов — дибазола, циклоферона — и иммунодепрессанта дексаметазона). Изучение механизмов, лежащих в основе действия УФ-света и иммуномодуляторов на лейкоцитарные клетки, позволит в дальнейшем модифицировать их функциональные свойства для достижения прогнозируемых эффектов коррекции иммунных расстройств. Решение указанной проблемы является теоретической основой применения экстракорпоральной УФ- и фармакологической модификации лимфоцитов (УФМЛ) в терапии ряда заболеваний и, таким образом, имеет большое значение для медицины.
Цель и задачи диссертационной работы. Целью настоящей работы явилось изучение биофизических и биохимических механизмов действия УФ-света и иммуномодуляторов (дибазола, циклоферона, дексаметазона) на поддержание окислительно-восстановительного гомеостаза иммуноцитами (лимфоциты, нейтрофилы) в норме и при патологии.
В связи с этим перед нами стояли следующие задачи:
Изучить влияние УФ-света (240-390 нм, 151 Дж/м2) и иммуностимулятора дибазола в терапевтической концентрации на состояние про- и антиоксидантного статуса лимфоцитов доноров.
Оценить уровень ПОЛ и состояние АОС иммуноцитов доноров в условиях сочетанного воздействия УФ-света и иммуностимулятора циклоферона.
Изучить сочетанное действие УФ-света и иммунодепрессанта дексаметазона на структурно-функциональные свойства и окислительно-восстановительный гомеостаз иммуноцитов доноров.
Оценить вклад сочетанного применения УФ-излучения и иммуномодуляторов (дибазол, циклоферон, дексаметазон) в поддержание окислительно-восстановительного равновесия в лимфоцитах больных бронхиальной астмой и пациентов с гнойными патологиями.
Научная новизна. Работа является комплексным исследованием, посвященным изучению механизмов окислительно-восстановительного гомеостаза лимфоцитов и нейтрофилов крови в условиях УФ-облучения и в присутствии химических модификаторов (дибазол, циклоферон, дексаметазон).
Показано, что повышение СОД-активности лимфоцитов при их УФ-облучении в терапевтической дозе 151 Дж/м2 обусловлено синтезом этого фермента клетками de novo. Обнаружено увеличение функциональной активности нейтрофшюв при их инкубации с фотомодифицированными лимфоцитами и установлено, что данный эффект обусловлен активацией синтеза интерлейкинов ір (ИЛ-ір) и ИЛ-2 УФ-облученными клетками. На основании полученных экспериментальных и литературных данных предложена схема действия УФ-света на иммуноциты.
Выявлено, что при сочетанном действии УФ-света и иммуностимуляторов (дибазола, циклоферона) на лимфоциты крови доноров происходит увеличение СОД-активности, адекватное повышению интенсивности перок-сидного фотоокисления липидов (ПФОЛ) в клетках.
Разработаны схемы событий молекулярного механизма совместного действия УФ-света и циклоферона, а также влияния дексаметазона на фото-модифицированные лейкоциты крови доноров.
Впервые изучено сочетанное действие УФ-излучения и иммуномоду-ляторов в терапевтической дозе на показатели про- и антиоксидантного статуса иммуноцитов крови доноров и больных бронхиальной астмой и гнойными патологиями. При проведении УФМЛ с дибазолом (пациенты с гнойно-септической патологией), с циклофероном и дексаметазоном (больные бронхиальной астмой) отмечены изменения в состоянии окислительно-восстановительного равновесия в сторону нормализации.
Практическая значимость. Научные положения диссертационной работы расширяют и углубляют современные представления о молекулярно-клеточных механизмах регуляторного действия УФ-света и иммуномодули-рующих веществ на отдельные звенья про- и антиоксидантной систем организма.
Фотоиндуцированные изменения в функциональном статусе нейтро-филов, уровне ПОЛ и активности СОД в лимфоцитах доноров и больных бронхиальной астмой и гнойными патологиями необходимо учитывать при обсуждении вопросов, касающихся выяснения механизмов действия УФ-света на молекулярно-клеточном уровне. Полученные экспериментальные данные позволяют выявить общие закономерности регуляторного действия УФ-света в поддержании окислительно-восстановительного равновесия в клетках организма.
Результаты экспериментов по сочетанному действию УФ-света и им-муномодуляторов на иммуноциты (нейтрофилы и лимфоциты) позволяют расширить и обосновать новые подходы к иммунокоррекции патологических состояний организма и определить возможности применения метода УФМЛ при различной тяжести воспалительного процесса с целью повышения эффективности его использования.
Предложенные схемы событий, возникающих как при воздействии УФ-света в отдельности, так и в сочетании его с иммуномодулирующими препаратами (циклоферон и дексаметазон), могут быть полезны для понимания молекулярно-клеточных аспектов терапевтического действия методов УФМЛ и АУФОК.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на III Съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001); I Объединенном конгрессе «Актуальные проблемы экстракорпорального очищения крови, нефрологии и гемафереза» (Москва, 2002); VII Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2003); III Международном конгрессе «Сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (СПб., 2003); XIII Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (СПб., 2003); VIII Международной научно-экологической конференции «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» (Белгород, 2004); III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); XIX Съезде физиологов России (Екатеринбург, 2004); III Международной конференции «Электромагнитные излучения в биологии» (Калуга, 2005); IV съезде фотобиологов России (Саратов, 2005); Научной сессии сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2003; 2005). По материалам диссертации полу- чено 3 удостоверения на рационализаторское предложение.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 статьи и 11 тезисов. На защиту выносятся следующие положения:
УФ-облучение лимфоцитов доноров в терапевтической дозе (240-390 им, 151 Дж/м2) стимулирует синтез некоторых белков, в частности, провос-палительных цитокинов — интерлейкина фи интерлейкина 2-й суперок-сиддисмутазы.
Сочетанное действие УФ-света и иммуностимуляторов (дибазола и циклоферона) в терапевтических дозах на лимфоциты доноров направлено на поддержание окислительно-восстановительного равновесия в клетках крови.
УФ-облучение лимфоцитов (151 Дж/м2) индуцирует повышение чувствительности фотомодифицированных клеток к некоторым лекарственным препаратам (дибазол и дексаметазон) за счет усиления вклада в комплекси-рование иммуномодуляторов с облученной мембраной клетки гидрофобных связей.
Схемы процессов, протекающих при сочетанном действии УФ-света и дексаметазона на функциональное состояние нейтрофилов; а также механизмов совместного действия УФ-света и циклоферона на лейкоциты крови доноров.
Структура диссертации. Диссертационная работа включает 202 страницы машинописного текста, 4 таблицы, 48 рисунков. Состоит из «Введения», 6 глав, «Заключения» и «Выводов». Список литературы содержит 321 источник, из них 160 - отечественных и 161 - зарубежных.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Влияние УФ-излучения на белки антиоксидантной системы крови
Изучение молекулярных механизмов действия УФ-излучения на биополимеры, их надмолекулярные комплексы и биомембраны представляет собой одну из актуальных проблем биофизики, биохимии и мембранологии.
Генерация активных кислородных метаболитов (АКМ), известных как прооксиданты, является обязательным атрибутом нормальной аэробной жизни. Функционирование и развитие клеток в кислородсодержащем окружении не могло бы быть возможным без существования защитных систем, к которым относятся специализированные ферментативные и неферментативные антиоксиданты. Постоянное образование прооксидантов в живых организмах уравновешено их дезактивацией антиоксидантами, поэтому для поддержания гомеостаза необходима непрерывная регенерация антиоксидантной способности. Отсутствие или сбои этой непрерывности сопровождаются накоплением окислительных повреждений и приводят к возникновению окислительного стресса, который является составным элементом целого ряда физиологических и патофизиологических феноменов и процессов, таких как воспаление, реперфузионное поражение тканей, бронхолегочные заболевания, старение, канцерогенез и др. (Н. Sies, 1991; Е.Б. Меньшикова, Н.К. Зенков, 1997).
В процессе эволюции в клетках для защиты от АКМ выработались специализированные системы ферментативных антиоксидантов, к которым относятся супероксиддисмутаза, каталаза, глутатион-зависимые пероксидазы и трансферазы, глутатионредуктазы (A. Wendel, 1988). Ферментативные антиоксиданти характеризуются высокой избирательностью действия, направленного против определенных форм АКМ; специфичностью клеточной и органной локализации; большинство из них в активном центре содержит такие металлы, как медь, цинк, марганец, железо (гемовое) и селен (A. Wendel, 1988; Н. Sies, 1991).
При интенсификации свободнорадикальных окислительных процессов в результате УФ-облучения клеток и их компонентов особую значимость приобретают фотомодификации белков антиоксидантной системы крови, играющих ведущую роль в регулировании уровня активных кислородных метаболитов и продуктов ПОЛ.
Любой фотобиологический процесс можно представить в виде ряда последовательных стадий: поглощение света в биоструктурах; миграция энергии; возбуждение фотоактивного хромофорного комплекса; первичный фотофизический акт трансформации электронной энергии; образование первичных фотохимических продуктов; развитие вызванных ими фотобиологических эффектов. Молекулярные механизмы начальных этапов всех фотобиологических процессов тоже основаны на общих принципах. За счет энергии электронного возбуждения фотоактивный хромофор изменяет состояние своего ближайшего микроокружения в биоструктурах, и это дает начало дальнейшим структурно-функциональным перестройкам, индуцирующим биохимические процессы, которые приводят в итоге к конечному биологическому эффекту (В.Г. Артюхов с соавт., 1994).
В большинстве случаев конечным результатом действия УФ-света на белки является их инактивация, т.е. потеря ферментативной, регуляторной, транспортной, гормональной, иммунологической и других видов активности (В.Е. Холмогоров с соавт., 1988; В.Г. Артюхов с соавт., 1994; Д.И. Рошупкин, В.Г. Артюхов, 1997; Ю.А. Владимиров, 1998; С.Н. Корольков с соавт., 1999). Явление фотоактивации при действии УФ-света на ферменты наблюдается относительно редко (Г.Я. Фрайкин с соавт., 1989; О.В. Башарина, 1995; Д.И. Рощупкин, В.Г. Артюхов, 1997; В.Г. Артюхов, М.А. Наквасина, 2000). Все известные эффекты стимулирующего действия можно подразделить на 2 типа: 1) обратимая активация каталитической реакции; 2) необратимая активация фермента, связанная с фотохимическим разрывом (или образованием) связей, поддерживающих конформацию белковой глобулы (СВ. Конев, И.Д. Волотовский, 1974). Непосредственной причиной изменения биологической активности белка является конформационная перестройка белковой макромолекулы (СВ. Конев, И.Д. Волотовский, 1979). На степень фотомодификации мембранных белков могут влиять продукты пероксидного окисления ли-пидов (СВ. Конев, И.Д. Волотовский, 1979). Это выражается в увеличении чувствительности к УФ-облучению ферментов в составе мембраны по сравнению с изолированными белками. Однако в данном случае вклад в изменение степени фотоинактивации мембранных ферментов вносит не только пе-роксидное фотоокисление липидов, но и индуцированная УФ-облучением структурная перестройка мембранной матрицы (А.Б. Рубин, Г.Я. Фрайкин, 1987).
К основным компонентам ферментативного звена антиоксиданти ой системы относят супероксиддисмутазу (СОД), которая является ключевым звеном в регуляции скорости превращения супероксидного аниона в другие активные формы кислорода (АФК) и тем самым контролирует скорость ПОЛ (Г.Г. Жданов, М.Л. Нодель, 1995).
Супероксиддисмутаза (КФ. 1.15.1.1) катализирует реакцию дисмутации анион-радикалов кислорода с образованием пероксида водорода и кислорода (J.M. McCord, I. Fridovich, 1969; G.G. Duthie etal., 1990): 20j+2H+- H202 + 02.
Воздействие определенных доз УФ-света (240-390 им) на растворы СОД индуцирует повышение ее функциональной активности (О-В. Башарина, 1991; В.Г. Артюхов с соавт., 1992). В работе О.В. Башариной (О.В. Башарина, 1995) было доказано, что активация СОД УФ-светом носит необрати мый характер и определяется конформационными изменениями молекулы белка. Установлено также, что эффект фотоактивации энзима наиболее выражен при экстремальных для проявления его ферментативной активности значениях рН.
HJ. Forman et al. (1973), исследуя влияние УФ-света на СОД, показали, что голофермент устойчив к воздействию данного фактора; облучение апо-фермента сопровождалось его инактивацией, причем белок терял способность связывать Си2+ параллельно с окислением гистидиновых остатков в молекуле; Си и Zn в равной степени способны защищать молекулу СОД от влияния УФ-излучения.
Л.В. Шабуневич и соавт. (1986) было проведено исследование влияния АУФОК на СОД-активность крови. Установлено, что СОД-активность в эритроцитах и плазме цельной донорской крови возрастала после фотомодификации. Облучение частично очищенного фермента из эритроцитов показало резистентность СОД к действию УФ-лучей. Это объясняется сравнительно слабым поглощением энзима в УФ-области спектра, что обусловлено низким содержанием в его молекуле триптофана и тирозина по сравнению с другими белками (J.M. McCord, I. Fridovich, 1969).
Механизм действия глюкокортикостероидных гормонов
В настоящее время общеизвестно, что бронхиальная астма является первично воспалительным процессом, локализованном в бронхиальном дереве (J.W. Paterson et al., 1995). Патологические изменения морфологического и биохимического порядка, составляющие основу гиперреактивности дыхательных путей, развиваются вследствие сложного взаимодействия как между различными воспалительными клетками, так и между продуцируемыми этими клетками провоспалительными медиаторами (PJ. Barnes, 1989), что и определяет необходимость раннего начала регулярной антивоспалительной терапии. Лечение бронхиальной астмы предусматривает использование противовоспалительных средств, наиболее эффективными из которых являются глюкокортикостероиды (ГКС).
ГКС оказывают влияние на течение воспалительного процесса в дыхательных путях, блокируя все этапы воспаления, включая продукцию цитоки-нов, про воспалительных медиаторов и их действие на клетки-мишени, уменьшая сосудистую проницаемость, предотвращая отек бронхиальной стенки, а также обладая рядом других эффектов (А.Г. Чучалин, 1994).
Как и все стероидные гормоны, кортикостероиды характеризуются ли-пофильностью, они в физиологических концентрациях легко диффундируют через мембрану, относительно свободно выходят из одних клеток и прони-каютв другие (В.Б. Розен, А.Н. Смирнов, 1981).
ГКС оказывают свои эффекты главным образом ядерным путем (рис. I), связываясь с глюкокортикостероидными рецепторами (ГКР), расположенными в цитоплазме клеток мишеней, в том числе в эпителии дыхательных путей и эндотелии бронхиальных сосудов человека (I.M. Adcock et al., 1991), куда они поступают путем пассивной диффузии через плазматические мембраны клеток.
Образующийся гормонрецепторный комплекс трансформируется, в силу конформационных изменений, в активный, приобретающий способность транспортироваться в ядро и, обладая высоким аффинитетом к ядерным ДНК, связываться с их акцепторными местами, которые называются глюко-кортикостероидчувствительными элементами. Последние могут быть поло
Обозначения: iNOS - индуцибельная NO-синтаза; СОХ-2 - циклоокси-геназа-2; hsp90 - белок теплового шока. жительными и отрицательными, то есть увеличивающими или уменьшающими транскрипцию стероидочувствительных генов мишени, что приводит к активации или угнетению синтеза специфических мРНК и белков, определяющих фенотипический ответ клетки (Н. Gronemeyer, 1992). Такой механизм действия назван геномным эффектом глюкокортикоидов.
Структурно глюкокортикостероидный рецептор состоит из нескольких частей (доменов). Та часть молекулы ГКР, которая связывается с гормоном, находится в С-концевом участке. Два пальцевидных отростка в средней части рецептора ответственны за связывание с ядерной ДНК клетки-мишени. Каждый из этих отростков сформирован ионом цинка, связанной с четырьмя цистеиновыми остатками, получивших образное название «цинковые пальцы». Функция N-концевой части молекулы глюкокортикоидного рецептора сводится к связыванию с факторами транскрипции и активации генов после встраивания комплекса гормон-рецептор в ядерную ДНК (Г.Н. Дранник, 2003).
Неактивированный (не связанный с гормоном) ГКР входит в состав белкового комплекса, который состоит из белка теплового шока с молекулярной массой 90 кДа (hsp90), белка иммунофиллина и нескольких белков, обладающих ингибиторным влиянием на глюкокортикоидный рецептор. Молекула hsp90 действует как молекулярный шаперон — не позволяет рецептору проникнуть в ядро клетки. При связывании гормона с рецептором происходит диссоциация молекулы hsp90, после чего активированный комплекс гормон-рецептор может проникнуть в ядро и связаться с ДНК (Т.Н. Дранник, 2003).
Наряду с простыми ГКС-чувствительными элементами ДНК, с которыми связываются только ГКР (B.F. Luisi et al., 1991), имеются и смешанные элементы, с которыми способны связываться не только ГКР, но и другие факторы, оказывающие влияние на транскрипцию гена (МЛ. Diamond et al., 1990). К таким факторам относятся активирующий белок-І (AP-I) и ядерный фактор NF-кВ, расположенные внутриклеточно — в цитоплазме и ядре, и активируемые цитокинами и протеинкиназой С (Y. Nishizuka, 1986), продуцируемыми при активации аллергического воспаления. Взаимодействие ГКР с этими факторами способствует «включению» так называемого негеномного противовоспалительного эффекта (рис. 2).
Использование больших концентраций Р-2-агонистов способствует активации еще одного внутриядерного фактора, оказывающего влияние на транскрипцию гена, — CREB (cAMP response element binding protein) (D.A. Stevens et al., 1995). Последний прямо связывается с активированным ГКР, вследствие чего снижается количество рецепторов, способных связаться с ГКР-акцептирующими элементами ДНК. Это приводит к уменьшению противовоспалительных эффектов ГКС.
Определение интенсивности люминолзависимой хемилюминес ценции иммуноцитов
В основу использованного метода положено ингибирование фотоинду-цированной, опосредованной супероксидными анион-радикалами, хемилгоминесценции при окислении люминола в присутствии образцов, содержащих супероксиддисмутазу (Л.Т. Рязанцева с соавт., 2001).
В кювету хемилюминометра последовательно вносили 0,1 мл натрий-фосфатного буфера (0,1 моль/л, рН 7,4), 0,1 мл раствора тетраметилэтилен-диамина (ТЕМЭД, 0,05 моль/л) в натриевой соли этилендиаминтетраацетата (ЭДТА, 0,2 ммоль/л), 0,4 мл дистилированной воды, 0,1 мл супернатанта исследуемых лимфоцитов и 0,2 мл раствора рибофлавина (0,034 ммоль/л). В контролыгую пробу вместо образца вносили такой же объем дистилированной воды. Реакцию образования Ог в системе рибофлавин — ТЭМЭД инициировали облучением лампы видимого света (100 Вт) на расстоянии 20 см в течение 60 с. За 10 с до истечения времени облучения вносили 0,1 мл раствора люминола (0,25 ммоль/л). После облучения кюветное отделение перемещали в рабочее положение перед фотокатодом фотоэлектронного умножите-
ля ( 1 с) биохемилюминометра БХЛ-06 М и регистрировали вспышку хеми-люминесценции. СОД-активность (А) оценивали в относительных единицах по формуле: где 1к и 10 — интенсивность ХЛ в контрольной и опытной пробе соответственно. Миелопероксидаза является одним из ключевых ферментов фагоцитов, от которого в значительной степени зависит их бактерицидность.
Принцип метода основан на способности миелопероксидазы (МПО) окислять органические субстраты в присутствии Н202- В данном методе в качестве субстрата использовали 3,5,3 ,5 -тетраметилбензидин (ТМБ).
Для определения активности готовили следующие реактивы: 1) раствор ТМБ: 15 мг тетраметилбензидина в 1 мл дим етил сульфоксид а; 2) раствор пероксида водорода (8,0 ммоль/л), приготовленный на фосфат-цитратном буфере (0,1 моль/л; рН 6,0); концентрацию пероксида водорода контролировали спектрофотометрически, используя коэффициент молярной экстинкции Б24о=43,6 л-моль" -см" ; 3) субстратная смесь, состоящая из растворов № I и № 2 в соотношении 1:1.
В лунки плоскодонных полистироловых планшет вносили по 50 мкл супернатанта нейтрофилов, 100 мкл субстратной смеси и оставляли на 10 мин в темноте при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 20 % раствора серной кислоты. Оптическую плотность реакционной смеси измеряли с помощью спектро фотометрии ее кого ИФА-анализатора «Унискан» (производство ООО «Пикон», Москва) при длине волны 450 нм. Активность МПО рассчитывали по формуле: A = (Do - DK) V2 /(V, t I m6 єАІ0), ед/мг белка, где D0 — оптическая плотность исследуемой пробы; DK - оптическая плотность контрольного раствора; та — концентрация белка в пробе, мг; t -время реакции, мин; і — длина оптического пути, см; Vj — объем исследуемого образца, мл; V2 - объем реакционной смеси, мл; є — коэффициент молярной экстинкции продукта окисления ТМБ, 5,9-102 л-моль см"1. Одноэлектронное окисление диамина приводит к образованию двух продуктов синего цвета: радикального катиона и комплекса с переносом заряда, которые находятся в динамическом равновесии. При дальнейшем окислении образуется желтый продукт - диимин, который является устойчивым при кислых значениях рН. В менее чем эквимолярной перекиси, все четыре разновидности (диамин, радикальный катион, комплекс с переносом заряда, и диимин) существуют в равновесии (P.D. Josephygg et al., 1982). УФ-облучение суспензии иммуноцитов (лимфоцитов и нейтрофилов в соответствующих опыту концентрациях) объемом 2 мл проводили в термо-статируемой (20+1 С) полусферической формы кювете (площадь облучае У гу мой поверхности 10" м ) при постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки типа ММ-ЗМ излучением ртутно-кварцевой лампы ДРТ-400 через светофильтр УФС-1 с полосой пропускания в области 240-390 нм. Интенсивность излучения - 151 Дж/м2 в минуту с учетом расстояния до облу-чаемого объекта 0,23 м. В работе использовали дозу облучения 151 Дж/м", что соответствует терапевтическому диапазону доз.
Для реализации изолированного УФ-облучения крови требуется специальная аппаратура, обеспечивающая полную стерильность процедуры. В настоящее время широко используется проточный метод облучения крови с использованием перистальтического насоса и с забором крови в изолированную емкость, которая отвечает требованиям стерильности.
Проточная система с перистальтическим насосом реализована в аппарате «Надежда», который используется в клинической практике на базе Воронежской городской больницы № 9 (скорой медицинской помощи) (БСМГТ).
Исследование взаимодействия дибазола с лимфоцитами крови доноров методом флуоресцентных зондов
Нарушение функциональной активности клеток иммунной системы и дисрегуляция продукции цитокинов в настоящее время рассматриваются как причина и, одновременно, следствие тяжелой гнойной инфекции и сепсиса. Данные патологии, как правило, сопровождаются значительной интоксикацией и развивающимся вследствие этого иммунодефицитным состоянием организма. Иммуносупрессия может быть обусловлена накоплением в сыворотке липопротеинов низкой и очень низкой плотности, белков острой фазы воспаления, иммунных комплексов, С-реактивного белка и т. д. (В.П. Лесков, И.С. Гущин, 1993). Эндогенные супрессорные факторы, обусловливающие недостаточность иммунной системы, могут послужить причиной затяжного течения болезни, снизить эффективность проводимой терапии. Это определяет необходимость разработки наиболее действенных способов иммунокор-рекции, позволяющих не только восстановить иммунокомпетентность организма, но и быстро снизить интоксикацию.
Одним из перспективных подходов к экстренной иммунокоррекции состояний, сопровождающихся выраженной интоксикацией, относится экстракорпоральная иммунофармакотерапия (ЭИФТ). Этот метод позволяет полностью вывести иммуноциты из-под действия супрессорных факторов и значительно сократить время наступления эффекта иммунокоррекции. Суть его заключается в следующем. С помощью приемов цитафереза часть лейкоцитов, обогащенную лимфоцитами, выводят из кровотока и в условиях in vitro обрабатывают лекарственным препаратом, активирующим клетки иммунной системы, отмывают и реинфузируют пациенту. На базе Воронежской городской больницы № 9 (скорой медицинской помощи) стандартную процедуру проведения ЭИФТ дополнили УФ-облучением лейкоцитарной массы, за которой следует инкубация клеток с иммуномодулирующим препаратом. Экстракорпоральную УФ- и фармакологическую модификацию лимфоцитов (УФМЛ) в настоящее время проводят при лечении заболеваний воспалительного генеза. В качестве иммуномодулирующего препарата при проведении УФМЛ больным с гнойными патологиями применяли дибазол. Известно, что во всех заболеваниях, где в качестве обязательного компонента присутствует воспалительная реакция, ведущую роль в повреждении клеток и тканей организма выполняют АФК, продуцируемые лейкоцитами, главным образом, нейтро-филами. Воспаление вызывает сдвиг системы «антиоксиданты— прооксиданты» в сторону последних. При этом отмечается развитие окислительного стресса с выбросом большого количества АФК и других медиаторов воспаления. Одним из важнейших следствий избыточного образования АФК является значительная и неконтролируемая в этих условиях активация процессов ПОЛ (S. Kitagawa et al., 1980). Это является пусковым фактором развития целого перечня разнообразных патологических процессов.
Патогенному воздействию АФК на организм противостоят специализированные ферментные системы и целый ряд неферментных соединений, составляющих антиоксидантную систему защиты организма (см. главу 1,2.). Ключевым ферментом антиоксидантно и защиты является супероксиддисму-таза, дезактивирующая высокореакционноспособные супероксидные анион-радикалы в менее токсичный для организма пероксид водорода (I. Fridovich, 1978). В связи с этим нами было проведено исследование динамики СОД-активности и интенсивности ПОЛ (по уровню ХЛ) в лимфоцитах больных с гнойно-септической патологией в ходе проведения УФМЛ с дибазолом.
При изучении интенсивности ХЛ и СОД-активности лимфоцитов здоровых доноров было установлено, что в норме максимальная интенсивность ХЛ равна 0,41+0,06 мВ, а СОД-активность - 0,38+0,02 отн.ед.
На основании исходного уровня СОД-активности и интенсивности ХЛ лимфоцитов все больные с гнойно-септической патологией были разделены на 3 группы. В первую группу вошли 8 больных, исследуемые показатели у которых были в среднем на 40 % выше нормальных значений, характерных для здоровых доноров (рис. 15 и 16). В ходе проведения им 3 сеансов УФМЛ-терапии наблюдалось снижение значений СОД-активности. По окончании курса фотогемотерапии активность фермента понизилась на 24 % по сравнению с величиной данного показателя до лечения и достоверно не отличалась от донорских значений. Уровень ПОЛ к началу 2-го сеанса повышался на 60 % и к окончанию курса лечения снижался до исходного уровня.
