Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Биологическая эффективность низкоинтенсивного лазерного излучения (обзор литературы) 12
1.1 Лазерное излучение в медицине: история и современность 12
1.2 Физико-химические основы взаимодействия низкоэнергетического лазерного излучения с биообъектом и возможные механизмы его биологического действия 15
1.3 Применение НИЛИ в экспериментальной медицине 34
1.4 Влияние НИЛИ на иммунную систему организма 40
1.5 Терапевтические эффекты НИЛИ 44
Глава 2. Материал и методы исследования 52
Глава 3. Влияние низкоинтенсивного ИК лазерного излучения на электрокинетические свойства лимфоцитов тимуса, селезенки и лимфатических узлов 71
3.1.Изучение электрокинетических свойств лимфоцитов тимуса до и в различные сроки после облучения низкоинтенсивным ИК лазером 73
3.2 Динамика электрофоретической подвижности лимфоцитов селезенки под влиянием низкоинтенсивного лазерного излучения 80
3.3.Изучение электрокинетических свойств лимфоцитов лимфатических узлов в динамике облучения ИК лазером 86
Глава 4. Морфо-функциональные изменения органов иммуногенеза при лазерном воздействии 93
4.1 Изменение гистоморфлогии тимуса при воздействии низкоинтенсивного ИК лазерного излучения 94
4.2 Влияние ИК лазерного излучения на динамику клеточного состава лимфатических узлов 113
4.3 Влияние ИК лазерного излучения на цитоморфологию лимфоидной ткани селезенки 130
Глава 5. Влияние инфракрасного лазерного излучения на динамику субпопуляционного состава лимфоцитов в органах иммунной системы 148
5.1 Динамика содержания CD3+, CD4+ и СВ8+лимфоцитов в тимусе при воздействии ИК НИЛИ 150
5.2 Динамика содержания CD3+, CD4+ и С08+лимфоцитов в лимфатических узлах при воздействии ИК НИЛИ 158
5.3 Динамика содержания CD3+, CD4+ и СВ8+лимфоцитов в селезенке, при воздействии ИК НИЛИ 163
Глава 6. Влияние низкоинтенсивного ИК лазерного излучения на секрецию цитокинов лимфоцитами и макрофагами органов иммуногенеза 172
6.1 Динамика содержания ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-а в тимусе при ИК лазерном облучении животных 174
6.2 Динамика содержания ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-а в лимфатически узлах при ИК лазерном облучении животных 181
6.3 Динамика содержания ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-а в селезенке при ИК лазерном облучении животных 188
Глава 7. Влияние ИК НИЛИ на генетический аппарат лимфоцитов в органах иммуной системы 200
7.1 Содержание ДНК и РНК в клетках тимуса крыс в динамике облучения ИК лазером 202
7.1.1 Показатели зеленой флюоресценции (АО-ДНК) тимоцитов в динамике лазерного облучения 203
7.1.2. Показатели красной флюоресценции (АО-РНК) тимоцитов в динамике лазерного облучения 209
7.2 Содержание ДНК и РНК в клетках лимфатических узлов крыс в динамике облучения ИК лазером 213
7.2.1 Показатели зеленой флюоресценции (АО-ДНК) лимфоцитов лимфатических узлов в динамике лазерного облучения 213
7.2.2. Показатели красной флюоресценции лимфоцитов лимфатических узлов в динамике лазерного облучения 219
7.2.3 Изменение содержания ДНК (распределение лимфоцитов лимфатических узлов по фазам клеточного цикла) в динамике лазерного облучения 224
7.3. Показатели содержания депротеидизированной ДНК и односпиральной РНК клеток селезенки крыс в динамике облучения ИК лазером 231
7.3.1 Показатели зеленой флюоресценции (АО-ДНК) лимфоцитов селезенки в динамике лазерного облучения 232
7.3.2 Показатели красной флюоресценции (содержания односпиральной РНК) лимфоцитов селезенки в динамике лазерного облучения 238
Глава 8. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на процесс фагоцитоза и цитокиновую активность перитонеальных макрофагов 244
8.1 Влияние инфракрасного лазерного излучения на фагоцитарную функцию перитонеальных макрофагов in vitro 246
8.2 Влияние ИК НИЛИ на образование цитокинов перитонеальными макрофагами в процессе фагоцитоза клеток клинического штамма Staphylococcus aureus и энтеропатогенной Escherichia coli in vitro 260
8.3 Влияние ИК лазерного облучения животных на продукцию цитокинов и фагоцитоз макрофагами энтеропатогенной E.coli 263
Заключение 278
Выводы 307
Список литературы 311
- Физико-химические основы взаимодействия низкоэнергетического лазерного излучения с биообъектом и возможные механизмы его биологического действия
- Динамика электрофоретической подвижности лимфоцитов селезенки под влиянием низкоинтенсивного лазерного излучения
- Влияние ИК лазерного излучения на цитоморфологию лимфоидной ткани селезенки
- Изменение содержания ДНК (распределение лимфоцитов лимфатических узлов по фазам клеточного цикла) в динамике лазерного облучения
Введение к работе
Актуальность проблемы
Активная динамика развития лазерных технологий определяет сегодня интенсивный рост лазерной медицины и, в частности, лазерной терапии. Интерес к данной проблеме обусловлен широким спектром медицинских показаний, а также сочетаемостью их с известными традиционными методами лечения. Особое место в современной лазеротерапии занимают мощные импульсные полупроводниковые лазеры, генерирующие в ближнем инфракрасном (И К) диапазоне.
Низкоинтенсивное ИК лазерное излучение с успехом
используется в различных областях медицины для получения
выраженного терапевтического эффекта. Важнейшее значение
при этом может иметь активация иммунной системы.
Клинические и экспериментальные исследования дают
основание предполагать, при определенных параметрах,
возможность стимулирующего действия лазерного света на
состояние гуморального и клеточного иммунитета (Мельдеханов
Т.Т.,1977; Мороз АМ.,1980; Крюк АС, 1р83; -Wester Е.,
Nagyluckay S., 1975; 1976; 1978., и др.). Важное значение &этом
аспекте имеют исследования тонких морфофункциональных
изменений, происходящих в органах иммунной системы, и в
частности в лимфатических узлах, которые принимают участие
в развитии разнообразных иммунологических реакций:
антигензависимая диффёренцировка Т- и В-лимфоцитов с
последующим антителообразованием. В механизме активации
иммунной системы определяющую роль играет усиление
пролиферативной функции иммунокомпетентных клеток и
увеличение синтеза белков. Динамика популяционного и
субпопуляционного состава клеток этих органов в ответ на
воздействие низкоинтенсивным лазерным светом до настоящего
времени недостаточно изучена. Комплексного
морфофункционального анализа состояния клеточных
элементов органов иммунной системы под влиянием лазерного облучения не проводилось.
Учитывая это обстоятельство мы сочли необходимым
изучить действие низкоинтенсивного лазерного света различной
импульсной частоты на ряд важнейших механизмов,
определяющих морфофункциональное состояние
лимфатических узлов. К числу основных изучаемых
показателей относилось изменение активности хроматина центрального генетического аппарата клетки. Активация его приводит к изменениям содержания ДНК, РНК, белка в лимфоцитах и может рассматриваться как пусковой механизм включения клеток в пролиферацию и активное функционирование (Кару Т.Й., 1990;Брилль Г.Е. 1994; Mester Е., 1978; Martucci С, 1983).
Другим интегральным показателем пролиферативной активности является характер распределения лимфоцитов по фазам клеточного цикла с определением числа ДНК-синтезирующих клеток, т.е. клеток, находящихся в S+G2+M фазах митоза (Крюк А.С., Мостовников В.А., Хохлов И.В. с соавт., 1986).
К числу важных функциональных параметров состояния
органов иммунной системы относится также
электрофоретическая подвижность (ЭФП) лимфоцитов,
обусловленная наличием на поверхности клетки
определенного электрического потенциала. По характеру ЭФП лимфоцитов (при разделительном клеточном электрофорезе) можно судить об изменениях в популяционном составе, степени дифференцировки клеток и состоянии архитектоники их мембран.
При исследовании иммуномодулирующих воздействий
особо важным является вопрос о функциональном состоянии
лизосомального аппарата, посредством которого
осуществляется прямое разрушение генетически чужеродного материала, фрагментация его с последующей презентацией.
Сведения о количественной динамической оценке морфофункционального состояния клеток по вышеуказанным параметрам в комплексе с характеристикой гистологических структур лимфоузлов при лазерном облучении в литературе отсутствуют. В то же время изучение адаптивных реакций лимфоузлов в условиях облучения низкоэнергетическим лазерным светом позволяет оценить степень и механизмы иммуномодулирующего эффекта лазерного воздействия, а также разработать возможные способы повышения резистентности организма при различного рода патологических процессах.
Цель исследования
Изучить характер структурно-функциональных
изменений брыжеечных лимфатических узлов крыс в условиях
облучения низкоинтенсивным (И К) лазерным светом и
определить оптимальный режим воздействия для
исследования механизма и динамики иммуномодулирующего эффекта.
Задачи исследования
-
Изучить кинетику популяционного состава клеток брыжеечных лимфатических узлов крыс в условиях различного режима облучения низкоинтенсивным И К лазерным светом.
-
Обосновать оптимальный режим облучения, вызывающий наибольший иммуностимулирующий эффект.
-
В условиях оптимального режима облучения животных И К лазером в мезентериальных лимфатических узлах определить в динамике:
функциональную активность хроматина по интенсивности флюоресценции комплекса АО-ДНК методом проточной цитофлюориметрии;
количество ДНК-синтезирующих лимфоцитов и соотношение их по фазам клеточного цикла;
функциональное состояния лизосомального аппарата по цитофлюориметрическим характеристикам;
характер изменения величины поверхностного заряда лимфоцитов посредством препаративной электрофоретической их сортировки.
4. Исследовать степень влияния ИК лазерного излучения на
гистологические структуры и иммуноцитопоэз
мезентериальных лимфатических узлов экспериментальных
животных.
Научная новизна
Впервые представлена комплексная характеристика
структурно-функциональных изменений мезентериальных
лимфатических узлов в условиях воздействия
низкоинтенсивного лазерного И К излучения. В результате
применения гистологических, гистохимических
иммуноморфологических и морфометрических методов
исследования установлены новые закономерности изменения
клеточного состава лимфоузлов под влиянием
низкоинтенсивного лазерного излучения. Наибольший
иммуностимулирующий эффект зарегистрирован при
использовании импульсной частоты 1500 Гц., что подтверждалось увеличением малодифференцированных форм лимфоцитов в корковом, а затем и в мозговом веществе лимфоузлов с последующим нарастанием количества антителообразующих клеток в мозговых тяжах. Излучение с частотой 80 Гц. вызывало лишь кратковременную стимуляцию иммуноцитопоэза с быстрым восстановлением исходного клеточного состава лимфоузлов. Импульсная частота 3000 Гц. оказывала ингибирующее действие на пролиферативные процессы клеток лимфоидного ряда во всех структурно-функциональных зонах лимфоузлов.
Получены новые данные о механизмах иммуностимулирующего действия лазерного излучения. Впервые установлено, что низкоинтенсивное И К лазерное излучение с частотой импульсов 1500 Гц. вызывало в лимфатических узлах повышение функциональной активности хроматина лимфоцитов, количества ДНК-синтезирующих клеток, распределение по фазам клеточного цикла в сторону увеличения числа лимфоцитов, находящихся в S+G2+M фазах клеточного цикла. Новыми являются данные о влиянии лазерного света на пролиферативную активность и степень зрелости лимфоцитов, полученные методом регистрации ЭФП. Повышение ЭФП лимфоцитов свидетельствовало об активации процессов пролиферации и дифференцировки лимфоцитов.
Впервые установлена динамика
цитофлюориметрических показателей функционального состояния лизосомальной системы в клетках лимфоузлов под влиянием лазерного облучения. Увеличение содержания клеток с большей интенсивностью флюоресценции в красной области спектра свидетельствовало о повышении лизосомальной активности клеток.
Предложены новые методические подходы к оценке
влияния лазерного облучения на уровень иммунологической
перестройки, основанные на проточном
цитофлюориметрическом тестировании и препаративной злектрофоретической сортировке иммунокомпетентных клеток.
Практическая значимость работы
Определен комплекс информативных количественных и
качественных иммуноморфологических, цитофлюориметриче-
ских, электрокинетических критериев для использования в
научно-исследовательской работе при изучении механизмов
действия низкоинтенсивного инфракрасного импульсного
лазерного излучения на важнейшее звено иммунной системы
организма. Результаты, полученные при исследовании
влияния переменного инфракрасного лазерного излучения на
состояние периферических органов иммуногенеза
экспериментальных животных, могут быть использованы и в клинической практике для выбора оптимальных параметров излучения с целью достижения эффекта стимуляции иммуноцитопоэза. Возможно использование результатов исследования с целью разработки мероприятий по предотвращению отрицательного воздействия лазерного света на организм человека в производственных условиях.
Внедрение в практику.
Материалы диссертации включены в руководство "Иммунология чумы", Саратов (1992), используются при чтении лекций в Саратовском медицинском университете, в Тверской медицинской академии, на курсах специализации врачей по особо опасным инфекциям и усовершенствования врачей бактериологов санитарно-эпидемиологических учреждений России и СНГ (при институте "Микроб"), о чем свидетельствуют соответствующие акты о внедрении.
Апробация работы
Материалы диссертационного исследования доложены:
- на 2-й Всероссийской конференции "Влияние антропогенных
факторов на структурные преобразования органов, тканей и
клеток человека и животных" (Саратов., 1993);
- на 3-й Всероссийской конференции "Влияние антропогенных
факторов на структурные преобразования органов, тканей и
клеток человека и животных. (Волгоград., 1995);
-на III съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Тюмень.,
1994);
- на обществе анатомов, гистологов и эмбриологов
(Саратов., 1995);
на центральной методической комиссии (Саратов., 1996);
на Международной конференции BiOS'96 (San-Jose, California , USA, 1996);
на Международной конференции European Biomedical Optics Week (BIOS Europe 96, Vienna, Austria, 1996).
Диссертация обсуждена и одобрена на расширенной научной конференции кафедр гистологии, патологической анатомии СГМУ и лаборатории иммунологии Российского НИПЧИ "Микроб".
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 10 работ.
Объем и структура работы
Физико-химические основы взаимодействия низкоэнергетического лазерного излучения с биообъектом и возможные механизмы его биологического действия
Термин "лазер" ("laser") составлен из начальных букв пяти слов "Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation", что в переводе с английского означает " Усиление света путем его вынужденного излучения".
В сущности, лазер представляет собой источник света, в котором путем внешнего освещения достигается возбуждение атомов определенного вещества. Когда эти атомы под воздействием внешнего электромагнитного излучения возвращаются в исходное состояние, происходит вынужденное излучение света (Приезжев А.В., 1989; Берлиен Х.П., 1997; Тучин В. В., 1997; Брилль Г.Е., 2003).
В зависимости от устройства лазера его излучение может происходить в виде отдельных импульсов, либо непрерывно. Поэтому различают лазеры импульсного и непрерывного действия. К первым относятся рубиновые лазеры, а ко вторым - газовые. Полупроводниковые лазеры могут работать как в импульсном, так и в непрерывном режиме.
Лазерное излучение имеет свои характеристические черты. Ряд авторов (Трапезников Н.Н., 1985; Тучин В.В., 1997,1998) связывают биологические эффекты НИЛИ с его высокой монохроматичностью, когерентностью, направленностью и большой плотностью энергии.
Монохроматический - значит одноцветный. Монохроматичность лазерного света придает ему уникальное свойство, которое объясняется избирательностью действия лазерного излучения. Свет лазера вызывает изменения лишь в той среде, которая его поглощает, а степень поглощения зависит от оптических свойств материала. Обьгано, каждый материал максимально поглощает излучение лишь определенной длины волны (Илюшин В.М., 1970; БогушН-А., 1977; Фаин С, 1978; Зуфаров К.А., 1986; Владимиров Ю.А., 1989; Виноградов А.Б., 1994; Байбеков И.М., 1995; Чучков В.М., 2001; Bonner R., Nossal R.3 1981; Anderson R.R., Pamsh J.A., 1982).
Второй отличительной чертой лазерного излучения является его когерентность. В переводе с английского языка (coherency), означает связь, согласованность. А это значит, что в различных точках пространства в одно и то же время или в одной и той же точке в различные отрезки времени световые колебания координированы между собой. В лазере излучение носит вынужденный характер, поэтому генерация фотонов происходит согласованно и по направлению и по фазе. Когерентность лазерного излучения обусловливает его строгую направленность — распространение светового потока узким пучком в пределах очень малого угла. Для света лазеров угол расходимости может быть меньше 0,01 минуты, а это значит, что лазерные лучи распространяются практически параллельно (Рубин А.Б.,1988; Тучин В.В.,1997). По мнению некоторых авторов, более высокая эффективность лазерного света объясняется его поляризованностью и высокой степенью когерентности (Мазо Л.Я., 1967; Кару Т.И.,1983; Кемилева З.В., 1984; ДевятковН.Д.,1987).
Уникальное свойство лазерного излучения (монохроматичность и малая расходимость) позволяют с помощью системы линз сфокусировать его на очень малую площадь. Таким образом можно создать чрезвычайно высокую плотность излучения. Вспышка (импульс) лазера длится миллионные доли секунды и, следовательно, та же энергия оказывается спрессованной в миллион раз.
Плотность мощности - это параметр имеющий определяющее значение. Из клинико-экспериментальных данных известно, что оптимальный диапазон энергетических доз колеблется в пределах 0,01 до 5 Дж/см2; превышение оптимальных доз лазерного воздействия ведет к дизфункциональным, а порой и к деструктивным изменениям в организме (Байбеков И. М. и соавт., 1995,1996; Козлов В.И., 1997).
Успешное применение лазеров в биологии и медицине в значительной мере зависит от выбора источника лазерного излучения и от средства доставки излучения к биообъекту. Различают четыре основных способа доставки НИЛИ. Наружное или чрескожное (транскутанное) воздействие: орган, сосуды, нервы, болевые зоны и точки облучаются через неповрежденную кожу в соответствующей области тела. Транскутанное воздействие основывается на том, что лазерное излучение ближней инфракрасной области хорошо проникает в ткани на глубину до 5-7 см и достигает пораженного органа (Буйлин В.А. и соавт., 1995,1996,1997,2000).
Доставка излучения к поверхности кожи осуществляется либо непосредственно излучающей головкой, либо с помощью волоконного световода и световодной насадки.
Лазерная акупунктура влияет на различные рефлекторные и нейрогуморальные реакции организма (Агов Б.С.,1981;Инюшин В.М.,1984; Лященко Д.С., 1989; Гримблатов В.М.,1996; БуйлинВ.А. и соавт., 1996, 1997; Гусейнов Т.Ю.,1997; Москвин СВ., 2000). Стимулируется синтез гормонов, улучшается микроциркуляция в различных областях тела, увеличивается синтез простагландинов Е, F, эндорфинов, энкефалинов (Бабушкина Г.В.,1993). Максимальный эффект достигается к 5-7 процедуре и держится значительно дольше, чем при иглорефлексотерапии.
Внутриполостной путь - это подведение НИЛИ к патологическому очагу с помощью световолокна (например, к слизистой оболочке желудка).
Осуществляется, либо через эндоскопическую аппаратуру, либо с помощью специальных насадок. При этом способе доставки НИЛИ с успехом используется как красное, так и инфракрасное излучение (Непомнящих Г.И.,1994).
Внутривенное лазерное облучение крови (ВЛОК) проводится путем пункции локтевой или подключичной вены. Для ВЛОК обычно используют лазерное излучение красной или инфракрасной области спектра (Козлов В.И., 1993; Коряков А.И., 1999). Многие отечественные методические разработки в этом направлении являются приоритетными (Буйлин В.А. и соавт, 1995, 1996, 1997,2000; Козлов Б.И. и соавт.,1988, 1989, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995, 1996,1997; Головин С.Н., 1998; Кару Т.И. и соавт, 1983,1998; Клебанов Г.И. и соавт.,1996, 1997, 1998, 1999, 2001, 2003).
Механизм позитивного биологического эффекта НИЛИ весьма весьма сложен и до конца не изучен. Воздействие на живой организм низкоэнергетическим лазерным излучением с лечебной целью относится к методам физического воздействия. Несмотря на большое количество работ, посвященных применению лазеров в терапии широкого круга заболеваний и описанию многообразных благоприятных кинических эффектов, механизм лечебного действия НИЛИ все еще остается не ясным. Раскрытие механизмов терапевтической эффективности лазерного света будет способствовать значительному прогрессу многих актуальных аспектов патофизиологии, теоретической и практической медицины.
Совокупность экспериментальных и клинических данных противоречит предположению о том, что лечебное действие лазеров можно свести к «психотерапевтическому эффекту». Это также не подтверждается прямыми опытами с плацебо (красный луч лампочки малой мощности) (Агов Б.С., 1981). Об этом же свидетельствует и эффективность лазерного света при воздействии на организм животных (Виноградов А.Б.Д994). Данные современной физиологии отрицают наличие на коже животных и человека специфических фотоакцепторов. Различают ряд фотобиологических эффектов (Александров М.Т.,1990; Бадур Г.И.,1993; Байбеков И.М. и соавт, 1995,1996; Александров В.А., 1997), первый из которых - невозмущающее воздействие, когда биосубстанция не изменяет своих свойств в процессе взаимодействия со светом (рассеяние и отражение).
Динамика электрофоретической подвижности лимфоцитов селезенки под влиянием низкоинтенсивного лазерного излучения
В селезенке уже через сутки после первого сеанса облучения отмечалось незначительное снижение ЭФП лимфоцитов; Как видно из рисунка 3, контрольная гистограмма распределения лимфоцитов по степени электрофоретической подвижности, представлена двумя пиками с, максимальным выходом клеток в 61-й: (18,3+0j9%) и, 66-й (14,2+1,02%) фракциях. Процентное соотношение, клеток вышедших в коллектор фракций достоверно не отличалось от контроля (р 0,05).
Через трое суток (рис.3,6) левый пик гистограммы смещался вправо уже на три фракции, а правый на две. Профиль распределения лимфоцитов по ЭФП представлял собой два отдельных острых пика гистограммы. Максимальный выход лимфоцитов отмечался в 62-й (27,3+1,3%)? иГв .- 67-й- (20,1+1,8%) "фракциях. В 63-й и: 66-й фракциях определялись Т- и В-лимфоциты, а также клетки не имеющие: маркеров Т- или В-клеток, по-видимому О-лимфоциты. (9;5+0,45%).
На 7 сутки (Рис:3,в) наблюдалось еще более выраженное снижение ЭФП лимфоцитов селезенки (18 5+2,04% клеток идентифицировалось справа от контрольной гистограммы в 69-й фракции). Правый пик отражал наличие менее электрофоретически подвижных В-лимфоцитов. Клетки с пониженной подвижностью определялись до 72-й фракции. Левый пик гистограммы соответствует 65-й фракции лимфоцитов в которой определялись более подвижные Т-клетки (14,0±0,89%). Профиль гистограммы распределения лимфоцитов по ЭФП свидетельствует о повышении содержания в селезенке менее подвижных В-лимфоцитов. Снижение ЭФП В-клеток, очевидно, обусловлено синтезом поверхностных иммуноглобулинов - стадией необходимой для дифференцировки В-лимфоцитов в зрелые антителопродуцирующие клетки.
После 10-ти сеансов лазерного облучения показатели электрофоретической подвижности лимфоцитов селезенки снижены, профиль гистограммы практически совпадает с таковой на 7-е сутки исследования (рис.3,г).
К 15 суткам (Рис.3,д) снижение ЭФП достигало максимальных значений. Гистограмма в этот срок исследования более однородна, чем в предыдущие дни наблюдения. Максимальный выход наиболее подвижных лимфоцитов регистрировался в 65-й фракции и составлял 21,3±1,1%. Менее подвижные клетки тестировались вплоть до 76-й фракции. Фракции 67-71 включали в себя как Т- так и В-клетки. Характер гистограммы свидетельствует о снижении в селезенке количества антителопродуцирующих клеток к 15 суткам наблюдения и о повышении (в сравнении с предьщущим сроком исследования) содержания дифференцированных (тестируемых как Т-лимфоциты) клеток. Через 21 день (Рис.3,е) отмечалось возвращение ЭФП большей части лимфоцитов в пределы контрольной гистограммы. Лишь небольшая популяция лимфоцитов (6,2±0,2%) продолжала характеризоваться значениями ЭФП ниже контрольных (13,8±1,3%), (Р 0,05).
30-е сутки наблюдения (Рис.3,ж) не выявили достоверных отличий в профиле контрольной и экспериментальной гистограмм.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о выраженной и достаточно стремительной реакции лимфоидных клеток селезенки на облучение ИК лазером.
Уже через трое суток прослеживаются заметные изменения профиля распределения лимфоцитов по электрофоретической подвижности.
Полученные гистограммы отражают изменение реактивности органа и свидетельствуют о повышении содержания в селезенке менее подвижных по сравнению с контролем клеток. Снижение подвижности ЭФП во все сроки исследования касалось как Т-, так и В-лимфоцитов. Снижение ЭФП Т-лимфоцитов, очевидно было связано с повышенным количеством дифференцировочных антигенов на поверхности Т-клеток, наличие которых, как известно, коррелирует с низкой ЭФП. (Ледванов М.Ю., СтуковаШО., 1986; Bauer J., HanningK., 1984; Harming К., 1993). Снижение ЭФП В-лимфоцитов, очевидно было обусловлено синтезом иммуноглобулинов, маскирующих отрицательно заряженные группы на их поверхности.
Наибольшее количество клеток с повышенной ЭФП выявлялось на 7-10 и 15-й дни эксперимента, отражая тем самым преобладание в селезенке зрелых дифференцированных Т- и В- лимфоцитов.
К концу наблюдения (21-е и 30-е сутки) происходило восстановление клеточного состава селезенки, соответствующего таковому у контрольных (интактных) животных.
Влияние ИК лазерного излучения на цитоморфологию лимфоидной ткани селезенки
Данные иммунологии и исследования морфологов (Зуфаров К.А., 1986; Сапин М.Р., 1987, 1988; Буланова Г.В., 1988; Одинцов Ю.Н., 1988; Veerman G.P., 1975; Millikin P.D., 1979; Buyssens N., 1984; Madison R.D., 1991; Deimann W., 1993; Prebylski M., 1997; Каш T.I., 1998; Kimura H., 2000) указывают на видовую, возрастную и локальную специфичность клеточного состава лимфоидной ткани селезенки. В литературе нами не обнаружено данных комплексного исследования цитоморфологии белой пульпы селезенки, где сконцентрированы функционально активные клетки иммунной системы, при воздействии ИК лазерного излучения.
Селезенка расположена на гематогенных путях распространения антигенов, что отличает ее от лимфатических узлов, контролирующих лимфатические пути, и обуславливает единичность этого органа (в отличие от множественности лимфоузлов, дренирующих определенные регионы тела). Селезенка обладает более комплексными функциями, чем лимфатические узлы: у многих животных в ней осуществляется гемопоэз, она служит фильтром для старых эритроцитов, резервуаром, регулирующим объем циркулирующей крови и т.д.
Белая пульпа селезенки связана с артериолами и имеет прямое отношение к иммунологической функции органа. Структура стромы тимусзависимых и тимуснезависимых зон напоминает таковую аналогичных зон лимфатических узлов и характеризуется теми же особыми типами клеток.
В селезенке В-лимфоциты преобладают над Т-лимфоцитами, что свидетельствует о преимущественной ориентации органа на развитие гуморального иммунного ответа (в противоположность лимфатическим узлам) (Сапин М.Р., 1988; Prebylski М.э 1997). Среди Т-лимфоцитов преобладают, как и в других органах иммунной системы, Т-хелперы (Буланова Г.В., Сапин М.Р., 1988; Сапин М.Р., Буланова Г.В., 1989). В селезенке много макрофагов и уровень их функциональной активности достаточно высок (BuyssensN., 1984; Gowans R., 1984).
По структуре белая пульпа селезенки соответствует лимфоидным фолликулам лимфатических узлов (фото 12). В белой пульпе выделяют две зоны: В-зависимая зона - лимфоидные фолликулы, и Т-зависимая зона -периартериальные лимфоидные муфты. В центральной части лимфоидного фолликула располагается временно организующийся центр размножения лимфоцитов (герминативный центр — ГЦ), где протекают процессы пролиферации и дифференцировки (Петров Р.В., 1987; Кузник Б.И., Васильев Н.В., Цыбиков Н.Н.,1989; Ярилин А.А., 1996).
Периартериальная зона (ПАЗ) включает две четко выделяющиеся области: центральная — имеет концентрическую форму и непосредственно примыкает к стенке артерии и периферическая - более мощная по клеточному составу, с одной стороны переходит в маргинальную зону.
Маргинальная зона (МЗ) представляет собой переходную область между белой и красной пульпой. Она расположена на периферии лимфоидных узелков белой пульпы. Венозные синусы окружают лимфоидные фолликулы и имеют диаметр 15-22 мкм.
Морфометрия белой пульпы селезенки в процессе лазерного облучения экспериментальных животных показала характерные динамические изменения клеточного состава.
Лимфоидные муфты селезенки контрольных животных были структурно дифференцированы, однако четких разграничений между функциональными зонами не выявлялось. В периартериальных влагалищах (Т-зависимых зонах) обнаруживались плотно прилежащие друг к другу малые и средние лимфоциты, причем здесь отмечалось пятикратное преобладание малых лимфоцитов. В этой зоне выявлялись единичные большие лимфоциты и иммунобласты, отсутствовали плазмоциты и тучные клетки, редко встречались фигуры митоза (таблица 9).
В герминативных центрах (В-зависимых зонах) преобладающими клеточными элементами также являлись малые лимфоциты (рис. 14). В 4 раза реже встречались средние лимфоциты. Редко обнаруживались большие лимфоциты и иммунобласты, хотя последние встречались чаще, чем в периартериальной зоне. Плазматические и тучные клетки не выявлялись.
Встречались единичные лимфоидные клетки с фигурами митоза. В маргинальной зоне на фоне высокой плотности малых лимфоцитов, реже обнаруживались средние лимфоциты, количество иммунобластов и больших лимфоцитов было невелико, тучные клетки и клетки с фигурами митоза отсутствовали. Здесь же обнаруживались плазматические клетки, не встречающиеся в других областях белой пульпы. Обращает на себя внимание тот факт, что тучные клетки ни в одной из структурных зон селезенки у контрольных животных не обнаруживались.
Спустя сутки после первого сеанса лазерного воздействия явных морофологических признаков активации лимфоидных элементов селезенки экспериментальных животных обнаружено не было. Лимфоидные узелки не имели ярко выраженных зародышевых центров, диаметр их соответствовал контрольным значениям (фото 12). Количественное содержание малых лимфоцитов в герминативных центрах, в центральных отделах и на периферии белой пульпы мало отличалось от контрольных показателей.
Только в периартериальной зоне отмечалось увеличение количества средних и больших лимфоцитов по сравнению с контролем. В герминативных центрах и маргинальной зоне достоверно увеличивалось количество иммунобластов (рис. 15). В маргинальной зоне несколько снижалось число плазматических клеток. В герминативных центрах и в периартериальной зоне чаще, чем в контроле, обнаруживались фигуры митоза (таблица 9).
Ряд авторов (Рахишев А.Р., 1976; Непомнящих Г.И., Лажей Г.А., 1994; Байбеков И.М., Назыров Ф. Г., Ильхамов Ф.А.,1996; Челышев Ю.А., 1999; Boulton М., 1986; Lam T.S., 1986; Lyons R.F., 1987) указывают на стимуляцию лазерным светом пролиферативной активности эпителиальных, соединительнотканных и других видов клеток. Однако имеющиеся в литературе сведения подобного рода касаются воздействия не ИК, а низкоинтенсивного гелий-неонового лазерного излучения.
Через трое суток от начала эксперимента, т.е. после 3-х сеансов лазерного облучения структурная перестройка белой пульпы селезенки характеризуется заметным изменением клеточного состава ее функциональных областей. Так, увеличивается содержание малых лимфоцитов в герминативных центрах, периартериальной и маргинальной зонах по сравнению с контролем и в сравнении с предыдущим сроком исследования (таблица 9). В эти сроки периартериальные лимфоидные муфты представлены 3-5 рядами клеток лимфоидного ряда, расположенными концентрически. Непосредственно вокруг артерий лежат малые лимфоциты, плотно прилежащие друг к другу. Иногда между малыми лимфоцитами просматриваются ретикулярные клетки. Аналогичное положение клеточных элементов (чередование последних) сохраняется во всей периартериальной зоне. В этой же зоне происходит увеличение количества средних лимфоцитов и иммунобластов.
В герминативных центрах на 3-й сутки наблюдения отмечается увеличение числа больших лимфоцитов, нарастает содержание иммунобластов, появляются единичные плазматические клетки и значительно чаще, чем в контроле, выявляются фигуры митоза.
В маргинальной зоне в эти сроки эксперимента заметно повышается количество малых и больших лимфоцитов, на фоне уменьшения числа лимфоцитов среднего размера, в 5 раз чаще, чем в контроле, обнаруживаются иммунобласты, в 2 раза реже встречаются плазмоциты и обнаруживаются единичные тучные клетки и редкие фигуры митоза (таблица 9).
Таким образом, 3-й сутки мониторинга цитоморфологии белой пульпы селезенки характеризуются заметной активацией пролиферации лимфоцитов во всех исследованных зонах.
Властная трансформация лимфоидных клеток также выявляется во всех отделах, но затрагивает в основном элементы маргинальной зоны.
На 7-е сутки опыта в лимфоидных фолликулах селезенки формируются герминативные центры, в которых резко снижено содержание малых лимфоцитов не только по сравнению с контролем, но и в сравнении с предыдущими сроками наблюдения (фото 13).
Изменение содержания ДНК (распределение лимфоцитов лимфатических узлов по фазам клеточного цикла) в динамике лазерного облучения
Учитывая характерные профили гистограмм, отражающих зеленую и красную флюоресценции, а также динамику их изменения под влиянием ИК НИЛИ, мы сочли целесообразным провести дополнительную серию экспериментов по изучению влияния низкоинтенсивного лазерного излучения на содержание ДНК и характер клеточного цикла лимфоцитов лимфатических узлов (таблица.20).
Проведенные исследования показали (рис.43), что у необлученных крыс распределение лимфоцитов по содержанию в них ДНК характеризовалось следующими показателями. В фазе синтеза ДНК (S - фаза, количество ДНК 2С) находилась 4,5% клеток (таблица 19). В постсинтетическом периоде интерфазы и непосредственно в митозе (02+М-фаза, клеточного цикла, 4С ДНК) определялось 8,1 ±0,8% лимфоцитов, и соответственно в G0+G1 фазах (2С ДНК) идентифицировалось 87,5±3,6% клеток.
На рисунке 44, в качестве примера приведена стандартная гистограмма распределения лимфоцитов мезентериальных лимфатических узлов необлученных животных по содержанию в них ДНК.
По оси абсцисс отложено количество ДНК в условных единицах флюоресценции (каналы анализатора импульсов), по оси ординат - количество клеток с данным содержанием ДНК. Общее число анализированных лимфоцитов составляла 20000 клеток. Гистограмма представляет собой узкий симметричный пик распределения клеток по ДНК с коэффициентом вариации 2,3%. Как видно на гистограмме, основная масса лимфоцитов содержит 2С ДНК (диплоидные клетки в Go - Gi фазах).
Делящиеся клетки, находящиеся в фазе синтеза ДНК (S-фаза), имеет 2С ДНК и идентифицируются на гистограмме справа от основного пика.
Менее 2С ДНК содержат разрушенные или патологически измененные лимфоциты (0,2%). Небольшой пик справа соответствует лимфоцитам, находящимся в постсинтетическом периоде интерфазы и собственно митозе (GD - М). Количество ДНК в таких клетках удвоено - АС.
После облучения лазерным источником света через сутки не наблюдалось статистически достоверного изменения распределения лимфоцитов по фазам клеточного цикла.
Спустя трое суток отмечалось перераспределение лимфоцитов в сторону увеличения числа делящихся клеток. Количество клеток, находящихся в S-фазе увеличивалось вдвое (8,7±1,0% в сравнении с контролем - 4,5±0,3%, р 0,05) (рис.43). В фазе G2+M также наблюдалось увеличение содержания клеток до 10,6±1,1% (рис.47). Соответственно имелась тенденция к уменьшению количества лимфоцитов в Go+Gl - фазах (80,3±3,1% при 87,5± 3,6% в контроле, р 0,05) (рис.45).
К концу недели в мезентериальных узлах также выявлялся высокий по сравнению с контролем уровень клеток, находящихся в S-периоде (8,7±1,0%) и G2+M -периодах (12,6±1,1%). Последние значения были выше, чем в предыдущий срок исследования (р 0,02).
На 10-е сутки наблюдения в лимфатических узлах в 1,75 раза возрастало количество клеток, находящихся в митозе (р 0,001), и в 2,8 раза увеличивалось количество лимфоцитов, синтезирующих ДНК (р 0,001). При этом достоверно снижалось число клеток, находящихся в Go-Gl-периодах клеточного цикла (р 0,001).
Изменения, отмеченные на 10-е сутки эксперимента, сохранялись и спустя 5 суток после окончания курса лазерного облучения. На 15-сутки также выявлялось увеличение количества клеток, находящихся в S- и С2-М-периодах (р 0,001) на фоне снижения числа клеток в Go-G і-периодах клеточного цикла (р 0,01).
Через 21 день от начала опыта количество клеток, синтезирующих ДНК, хотя и снижалось по сравнению с предыдущим сроком наблюдения (р 0,001), но тем не менее оставалось на уровне, превышающем контрольные значения (р 0,001). При этом происходила нормализация числа клеток, находящихся в других фазах клеточного цикла.
К 30-м суткам изучаемые показатели практически не отличались от контрольных (таблица. 19).
Таким образом, проведенные исследования показали, что воздействие низкоинтенсивного ИК лазерного излучения сопровождается увеличением числа ДНК-синтезирующих и делящихся лимфоцитов в мезентериальных лимфатических узлах экспериментальных животных.
Вышеизложенное дает основание предполагать, что при помощи низкоинтенсивного лазерного излучения можно регулировать биосинтетические процессы в клетках и посредством этого способствовать нормализации важнейших клеточных и тканевых функций. Активация биосинтеза нуклеиновых кислот определяет интенсификацию митотических процессов, скорость биосинтеза белков и других соединений (Богуш Н.А., Мостовников В.А. 1981; Baish Н., Gonde W., 1975; Mester Е. et al. 1978; Lyons R.F. et al., 1987), необходимых для повышения резистентности организма и восстановления физиологических функций, нарушающихся при возникновении патологии.
