Введение к работе
Актуальность проблемы. Зрительный родопсин является одним из дставителей большой семьи сопряженных с G-белками мембранных рецеп-юв, имеющих сходную'структурно-функциональную организацию. Изучение вкулярных механизмов функционирования этих рецепторов и их роли в інсмембранной передаче сигналов является одним из важнейших и интен-іно развивающихся направлений современной биохимии. . Процесс трансмембранной передачи сигналов (световых, гормональ-:, нейромедиаторных и т.п.) рецепторами, сопряженными с G-белками, современным представлениям осуществляется в несколько стадий, вклю-щих:
юсприятие сигнала молекулой рецептора и его активацию (конформаци-іую перестройку),
взаимодействие активированного рецептора с гетеротримерным регуля-іннм G-белком (Gap7) в GDP-форме, в результате которого он переходит эктивную GTP-форму и диссоциирует, освобождая свою a-субъединицу в плексе с GTP,
ваимодействие активированной а-субъадиницы G-белка (Ga*GTP) с моле-юй фермента-эффектора, в результате которого происходит изменение явности этого фермента и соответствующее изменение уровня концент-ии вторичного посредника в клетке,
зызванное изменением концентрации внутриклеточного посредника даль-алее развитие биохимических событий в клетке, приводящее, в конечном ire, к физиологическому ответу на уровне организма.
Зрительный родопсин является одним из наиболее доступных и хорошо :ледованных рецепторов этой семьи, как в отношении его локализации в ібране, так и участия в отдельных этапах преобразования рецепторного нала. Поэтому он является хорошим модельным объектом, удобным для чения детальных механизмов функционирования сопряженных с G-белками [епторов, которые до сих пор остаются не вполне понятными.
Одним из эффективных и популярных в настоящее время приемов, поз-[яюших исследовать механизмы функционирования белков, является метод сгонуклеотид-направленного мутагенеза. Важнейшим моментом в осущест-иши этого подхода является получение функционально активного реком-іантного белка, то есть, выбор адекватной системы экспрессии. Одной перспективных и удобных является бесклеточная- система трансляции. [ того чтобы с ее помощью получить рекомбинантный белок, в количест-: достаточных для функциональных исследований, необходимо иметь [ыпие количества соответствующей мРНК. Ее получают in vitro с помо-) фаговых РНК-полимераз и специальных плазмидных (фаговых) векторов, [ержащих их промоторы. Одной из наиболее специфичных и эффективных
- г -
является РНК-полимераза бактериофага SP6 Salmonella typhlmurlvm. Од ко процесс получения SP6 РНК-полимеразы из зараженной фагом бактер: льной культуры довольно сложен и.капризен, и не позволяет получ этот фермент в больших количествах с необходимой высокой активность
В связи с этим клонирование гена РНК-полимеразы фага SP6 и соз вив штамма-суперпродуцента, э.того фэрмента, существенно упрощающее п цессы его наработки и выделения, представляется актуальным для при нения и дальнейшего развития системы экспрессии белков in vlt Кроме того, синтезированные In vitro специфические РНК имеют широ сферу применения и в других областях молекулярно-биологических исс дований.
Цель работы. Настоящая работа является частью проводимого в им.М.М.Шемякина АН СССР комплексного структурно-функционального исс .дования белков, участвующих в процессах восприятия и преобразова зрительного сигнала.
Целью исследования являлось изучение функциональных свойств тантных форм зрительного родопсина быка, полученных методом олигон леотвд-направленного мутагенеза, а также создание штамма-суперпро цента РНК-полимеразы бактериофага SP6 Salmonella typhtmurlvm, необ димой для осуществления экспрессии рекомбинантного родопсина в бес» точной системе трансляции.
Научная новизна -и практическая ценность работы. Методом еда нуклеотид-направленного мутагенеза получены две мутантныэ формы j опсина быка, в которых отрицательно заряженные аминокислотные осте Asp83 во втором и G1U134 в третьем трансмембранных доменах заменень незаряженные Авп и Gin, соответственно. Охарактеризована функционЕ ная активность полученных мутантов по их способности стимулирої GTP-азную активность G-белка зрительного каскада - транедуцина и аъ вировать эффекторный фермент - фосфодиэстеразу cGMP.
Показано, что как одна (Asp83->Asn), так и другая (Glu134->C замены существенно не изменяют способности родопсина стимулирої GTP-азную активность транедуцина, однако полностью нарушают его спс бность активировать фосфодиэстеразу cGMP.
Осуществлено клонирование гена практически важного фермент ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага SP6 бактерии Salmonella typlxlma (SP6 РНК-полимеразы, К.Ф. 2.7.7.6). Сконструирован экспрессионный і тор pTISIDT и на его основе экспрессирующая плазмида pTISP6, коди] щая термоиндуцибельный синтез SP6 РНК-полимеразы в клетках E.col позволяющая существенно упростить процессы наработки и выделения в: фермента. Созданный штамм-суперпродуцент позволяет получать неско.
їлионов единиц активности фермента с 1л бактериальной культуры.
Публикации. По теме работы опубликовано 6 статей, в том числе 3 в кдународных научных журналах, получено авторское свидетельство на )бретениэ. Результаты работы докладывались на Советско - Западаобер-іском симпозиуме "Рецепторы и ионные каналы" (Зап. Берлин, 1989), шозиуме UCLA по молекулярной и клеточной биологии "Передача сигнала жтивация генов при дифференцировке" (США, 1990), на 4-ом Созетско-зманском симпозиуме "Рецепторы и ионные каналы" (Москва, 1991).
Объем работы. Диссертация содержит стр. машинописного текста
зостоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экс-
эиментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (
ів.). В обзоре литературы рассмотрены работы", посвященные структур--функциональным исследованиям мутантних форм сопряженных с G-белками дапторов, полученных белково-инженерными методами. Обсуждается роль їельннх структурных элементов молекул этих рецепторов в их функцио-эовании.
