Содержание к диссертации
Введение 5
1. Активные центры АТР-зависимых протеиназ и протеолитических комплексов,
осуществляющих селективную внутриклеточную деградацию белков (Обзор
литературы) 6
1.1. Семейство ААА+-белков 6
1.1.1 .Структурные особенности ААА+-белков 8
Классификация ААА+-белков 11
Функции ААА+-белков 13
Классификация, структура и функции шаперонов 14
Регуляция межбелковых взаимодействий 18
ДНК-связывающие представители ААА+-семейства 21
Молекулярные моторы 23
1.1.4. Биологическая роль ААА+-белков 24
1.2. Типы активных центров АТР-зависимых протеиназ и протеолитических
комплексов 26
Металлопротеиназа FtsH 26
Классическая каталитическая триада. Протеиназы ClpAP и ClpXP.30
Треониновые протеиназы: HslUV и протеасомы 33
Каталитическая диада Ser-Lys 41
Lon-протеиназа 41
Репрессор Lex А 48
Сигнальная пептидаза типа 1 50
Протеиназа Tsp 52
Пептидаза CtpA 53
1.2.4.6. Неканонические Lon-протеиназы 54
1.3. Заключение 55
2. Результаты работы и их обсуждение 57
Общая характеристика Lon-протеиназы Е. coli 57
Выделение Lon-протеиназы Е. coli 61
Ограниченный протеолиз Lon-протеиназы химотрипсином 64
Разделение и очистка фрагментов Lon-протеиназы 71
Структурная характеристика Lon-протеиназы и ее фрагментов 78
Микрокалориметрическое исследование Lon-протеиназы и ее изолированных фрагментов 78
Третичная структура фрагментов Lon-протеиназы 80
Третичная структура а-спирализованного домена Lon-протеиназы 81
Третичная структура протеолитического домена Lon-протеиназы 83
2.5.3. Олигомерное состояние Lon-протеиназы и ее фрагментов 90
2.6. Сравнительная характеристика функциональной активности Lon-протеиназы и
ее изолированных фрагментов 95
АТР-азная активность Lon-протеиназы и ее химотриптических фрагментов 95
Пептидазная активность Lon-протеиназы и ее укороченных форм.. 98
Протеолитическая активность Lon-протеиназы и ее укороченных форм 104
2.7. Заключение 110
3. Эксперименатальная часть 112
3.1. Материалы 112
Реактивы 112
Штаммы Е. coli 112
Растворы 113
Культуральные среды 115
3.2. Методы 115
Процедуры, использованные при работе с клетками 115
Процедуры, использованные при работе с плазмидной ДНК 116
Выделение и очистка Lon-протеиназы и ее фрагментов 118
Ограниченный протеолиз Lon-протеиназы химотрипсином 121
Определение олигомерного состояния 122
Тестирование ферментативной активности 123
Выводы 128
Литература 129
Список сокращений
а.о. - аминокислотный остаток;
е.а. - единица активности;
о.е. - оптическая единица;
Nu - нуклеотид;
АТР - аденозин-5'-трифосфат;
ADP - аденозин-5'-дифосфат;
AMP-PNP - 5'-аденилил-Р,у-имидодифосфат;
АМР-СРР - аденозин-5'-(а,р-метилен)-трифосфат;
GTP - гуанозин-5'-трифосфат;
Sue - сукцинил;
SBzl - тиобензил;
pNa - пара-нитроанилид;
Мм - молекулярная масса.
Введение к работе
Процессы жизнеобеспечения клетки имеют многоуровневую регуляцию и таким образом строго контролируются. В поддержании гомеостаза важную роль играет адекватное функционирование клеточных белков. Наряду с ковалентной модификацией, изменением субклеточной локализации, взаимодействием с лигандами, особое место в регуляции активности белков отведено их протеолитической деградации.
Известно, что одни белки существуют in vivo довольно длительное время, другие живут от нескольких минут до 2-3 часов. Короткоживущие белки обычно синтезируются в определенный момент жизни клетки, в ответ на некоторые внутренние и внешние импульсы [']. Когда потребность в таком белке отпадает, специальные факторы сигнализируют о том, что его синтез должен быть остановлен, либо на этапе считывания матричных РНК (мРНК) с ДНК (факторы транскрипции), либо на стадии синтеза белка с РНК-матриц. Однако если белок уже существует, должен быть и механизм, обеспечивающий регуляцию его работы. Такой механизм давно и достаточно детально исследован для ферментов, активность которых обратимо подавляется ингибиторами белковой или небелковой природы. Однако клетка на протяжении своей жизни синтезирует и множество белков неферментативной природы, выполняющих разнообразные функции. К ним относятся, в частности, короткоживущие регуляторные белки, необходимые лишь на определенных стадиях клеточного метаболизма или развития, например, белки, функционирующие в условиях стресса, регулирующие стадии клеточного деления или инициирующие регуляторные каскады [']. Избыточное содержание таких белков удаляется посредством внутриклеточного протеолиза. Другой важной функцией внутриклеточного протеолиза является быстрое устранение дефектных полипептидов, образовавшихся в результате ошибок транскрипции или трансляции или в результате временного пребывания организма под влиянием факторов стресса (химического повреждения, тепловой денатурации, биохимического голодания, повреждающего излучения) [ ]. Деструктивный протеолиз носит "защитный" характер. Кроме того, быстрой деградации подвергаются белки, "лишенные партнеров", стабильные в составе олигомерных комплексов. Отдельные субъединицы таких белков, образующиеся в результате недостаточного или избыточного биосинтеза, считаются "условными субстратами".
Основная возможность обеспечить качество и поддерживать баланс клеточного белка предоставляется клетке АТР-зависимыми протеиназами, способными производить высокоселективный отбор субстратов с последующим их рефолдингом или деградацией.
