Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы стало очевидным, іто протеолитические ферменты не только участвуют в обмене ве-[еств, но и играют фундаментальную роль во внутриклеточной рефляции на посттрансляционном уровне. Для понимания этих провесов необходимо изучение внутриклеточных протеаз и тех реакций, которые они катализируют. С другой стороны, протеолитиче-:кие ферменты все более активно применяются в промышленности, гедицине и в различных биохимических исследованиях. Особенно іерспективннм является применение ферментов бактерий, так как іактерии обладают широким набором различающихся по субстратной зпецифичности протеаз. Так из клеток Escherichia соїі- классического объекта микробиологии и генной инженерии, выделено жоло 20 протеиназ, но, по-видимому, они не охватывают все іротеолитические процессы, протекающие в клетке. Поэтому при їспользовании в качестве субстратов различных белков или синтетических пептидов можно ожидать обнаружение новых протеаз, что, /читывая большую потребность в них, является актуальной проблемой .
Особый интерес вызывают протеиназы, обладающие узкой субстратной специфичностью. Подобные ферменты находят применение, в частности, в структурно-функциональных исследованиях белков с помощью метода ограниченного протеолиза. Примером такого использования протеиназ может служить исследование структуры и функций актина, одного из основных сократительных белков клетки. Актин обладает несколькими функциональными центрами, локализованными на разных частях молекула. Одним из возможных подходов к изучению локализации этих центров на молекуле актина является исследование функциональных свойств фрагментов молекулы, полученных с помощью разных протеиназ. В ходе такого исследования был обнаружен ограниченный протеолиз актина протеазой бактериального происхождения (Мантуленко и др., 1983). Позднее бактерия продуцент была выделена и идентифицирована как штамм Escherichia coli А2 (Хайглина И др., 1988).
Цель и задачи исследования. Целью данной работы является
Изучение СПеЦИфИЧеСКОЙ ПрОТеИНаЗЫ E.coli А2 и возможности ее
использования для исследования актина.
Решались следующие экспериментальные задачи:
-
Разработка метода выделения и очистки протеиназы
-
Изучение основных биохимических свойств протеиназы
-
Получение с помощью протеиназы "расщепленного актина" - продукта ограниченного цротеолиза нагивного актина
-
Изучение некоторых физико-химических свойств "расщепленного актина".
Научная новизна и теоретическая значимость работы. Впервые обнаружена новая внутриклеточная протеиназа е.соіі А2, специфически гидролизущая нативный актин. Разработан метод выделения и очистки фермента. Показано, что фермент относится к классу нейтральных термолабильных металлопротеиназ. Протеиназа расщепляет молекулу актина на два стабильных фрагмента с молекулярной массой 36 и 8 кДа, вызывает гидролиз связи Гли 42 -Вал 43, что отличает ее от действия известных протеиназ, которые гидролизуют в актине иные, пептидные связи. Расщепление связи Гли 42-Вал 43 приводит к образованию комплекса 36 и 8 кДа фрагментов ("расщепленного актина"), который отличается от описанных ранее в литературе расщепленных актинов полной потерей
СПОСОбНОСТИ ПОЛИМерИЗОВаТЬСЯ В ПРИСУТСТВИИ 0.1 М КС1.
Практическое значение работы. Новый фермент может быть использован для ограниченного протеолиза актина с целью изучения его свойств и, в первую очередь, механизма процесса полимеризации, лежащего в основе функционирования актина в клетке, а также при исследовании внутриклеточных функций актина. Кроме того, возможно использование новой протеиназы при изучении структуры и функции других белков.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на Международном симпозиуме "Механизмы адаптации мышц" (Сегед, Венгрия, 1986), на УШ и IX Всесоюзных симпозиумах по биофизике и биохимии мышечного сокращения (Пущино, 1987; Тбилиси, 1990), на Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печач ных работ, получено одно авторское свидетельство СССР.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов исследования .и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 144 страницах машинописного текста, иллюстрирована 32 рисунками и 9 таблицами. В списке литературы приведено 204 источника.
