Содержание к диссертации
Введение
1. Методы изучения эр типа iiи сравнительный анализ эр типа не 9
1.1. Методы изучения ЭР типа II 9
1.1.1. Кинетический подход 10
1.1.1.1. Методы регистрации расщепления ДНК. 11
1.1.1.2. Стационарная кинетика гидролиза 13
1.1.1.3. Однооборотная кинетика гидролиза ДНК. 15
1.1.1.4. Влияние условий на кинетику расщепления ДНК ЭР. 17
1.1.1.5. Классификация ЭР типа II согласно их кинетическим механизмам расщепления ДНК 18
1.1.2. Использование модифицированных субстратов для изучения контактов, образуемых ЭР с ДНК 20
1.1.2.1. Модификация гетероциклических оснований 22
1.1.2.1.1. Классификация модификаций 22
1.1.2.1.2. Энергетическая оценка ДНК-белковых взаимодействий в терминах теории переходного состояния 23
1.1.2.1.3. Факторы, которые необходимо учитывать при определении ДНК-белковых контактов 30
1.1.2.1.4. Наиболее охарактеризованные модификации 31
1.1.2.1.5. Мало охарактеризованные модификации 35
1.1.2.1.6. Определение контактов со стороны белка, с помощью модифицированных аналогов субстрата 39
1.1.2.2. Модификация углеводофосфатного остова 39
1.1.2.2.1. Статистическое алкилирование или футпринтинг 43
1.1.2.2.2, Межнуклеотидная тиофосфатная (Ps-) группа 44
1.1.3. Аффинная модификация ЭР типа II 50
1.1.3.1. Зондирование ДНК-белковых контактов 51
1.1.3.1.1. 5-Иодо-2'-дезоксиуридин (5-IdU) и 5-иодо-2*-дезоксицитидин (5-IdC). 51
1.1.3.1.2. 5-бромо-2'-дезоксиуридин(5-ЕЫи) 53
1.1.3.1.3. 6-тио-2*-дезоксигуанозин (d6SG) и 4-тио-2'-дезокситимидин (d4ST) 54
1.1.3.1.4. Азидофенацильыая группа 55
1.1.3.1.5. Замещённая пирофосфатная группа (ЗПГ) 55
1.1.3.1.6. Диальдегидная группа 56
1.1.3.2. Определение механизма действия ЭР типа II с помощью аффинной модификации ЭР или модификации ЭР низкомолекулярными бифункциональными реагентами 58
1.1.4. Использование спектроскопических методов для изучения ЭР типа II 60
1.2. Сравнительный анализ ЭР типа IIE 66
1.2.1. Структурная организация 66
1.2.2. Гомология с другими ферментами 68
1.2.3. Механизм гидролиза ДНК. 69
1.2.3.1. Критерии двухсайтового механизма действия ЭР 69
1.2.3.2. Число гидролизуемых связей 70
1.2.3.3. Зависимость гидролиза от длины односайтового субстрата 70
1.2.3.4. Цис- и w/w/ис-взаимодействия 71
1.2.2.1. Механизм транслокации 74
1.2.2.2. Кинетические модели гидролиза ДНК. 75
2. Исследование структуры комплекса эндонуклеазы рестрикции ecor1i с днк с помощью биохимических и спектральных методов 78
2.1. Зондирование контактов эндонуклеазы EcoRII с фосфатными группами ДНК 78
2.1.1. ДНК-дуплексы, содержащие модифицированные углеводные остатки 78
2.1.2. ДНК-дуплексы, содержащие межнуклеотидную хиральную тиофосфатную группу. 82
2.1.2.1. Синтез и хроматографическое разделение Rp- и 5^,-днастереомеров 12-звенных олигонуклеотидов 83
2.1.2.2. Получение 12-звенных олигонуклеотидов, содержащих хиральную тиофосфатную группу, с помощью хроматографического разделения 5-7-звенных олигонуклеотидов и последующего ферментативного лигирования. 85
2.1.2.3. Определение конфигурации тиофосфатной группы 87
2.1.2.4. Гидролиз эндонуклеазой ЕсоШІ ДНК-дуплексов, содержащих в участке узнавания EcoRII тиофосфатную группу. 90
2.1.3. Зондирование контактов эндонуклеазы EcoRII с группами атомов ДНК, расположенными в малой бороздке, с помощью ДНК-дуплексов, содержащих остатки (+)- или (-)-т/мшс-анти-бснзо[я]пирена^ -dG 96
2.2. Идентификация участка эндонуклеазы EcoRII, взаимодействующего с центральной нуклеотидной парой участка узнавания в ДНК, методом фотоаффинной модификации. 101
2.3. Изучение структуры комплекса К.ЕсоШ1-ДНК с помощью флуоресценции 104
2.3.1. Взаиморасположение участков узнавания EcoRII в комплексе R.EcoRII-ДНК 104
2.3.1.1. Гранс-локализация участков узнавания 105
2.3.1.2. Ifuc-локализация участков узнавания 108
3. Экспериментальная часть 116
3.1. Материалы 116
3.2. Приборы и методы 118
3.3. Общие методики 120
3.3.1. Выделение R.EcoRII 120
3.3.2. Хроматографичсское разделение Rp- и ^-диастереомеров олигонуклеотидов и определение их конфигурации 121
3.3.3 -Фосфорилирование олигонуклеотидов 121
3.3.4. Ферментативное лигирование. 122
3.3.5. Выделение олигонуклеотидов из геля 122
3.3.6. Гидролиз ДНК-дуплексов эндонуклеазой EcoRII 122
3.3.7. Разделение (-)- и (+)-диастереомеров олигонуклеотидов, содержащих остаток (+,-)-TpaHc-aHTH-B[a]P-N2-dG 123
3.3.8. Получение ДНК методом ПЦР 123
3.3.9. Комплексообразование ЭР EcoRII с ДНК 124
3.3.10. Фотоаффинная модификация ЭР EcoRII IdU-содержащими ДНК-дуплексами. 124
3.3.11. Гидролиз ковалентных конъготатов протеолитическими ферментами с последующей очисткой и анализом 124
3.3.12. Измерение переноса энергии и расчет геометрии петли ДНК 125
Выводы 129
- Использование модифицированных субстратов для изучения контактов, образуемых ЭР с ДНК
- Статистическое алкилирование или футпринтинг
- Механизм транслокации
- Идентификация участка эндонуклеазы EcoRII, взаимодействующего с центральной нуклеотидной парой участка узнавания в ДНК, методом фотоаффинной модификации.
Введение к работе
Объектом исследования в данной работе является ЭР EcoRII (R.EcoRJI), существующая в виде гомодимера. R.EcoRII одновременно связывает два одинаковых участка узнавания ( 5'~~ CCAGG л и в присутствие кофактора Ме+, гидролизует две
3'- GGTCCT фосфодиэфирные связи в двух цепях одного из двух участков узнавания. Особый интерес к ЭР EcoRII связан с тем, что она относится к ЭР типа НЕ, взаимодействующим с двумя участками узнавания. Для ЭР типа НЕ получены данные РСА для эндонуклеаз Nael и EcoRII и комплекса Nael с ДНК [1,2,3]. Как было показано с помощью РСА белка и биохимических исследований, R.EcoRH состоит из двух доменов: каталитического (эндонуклеазного) и ДНК связывающего (эффекторного). Предполагается, что вначале эффекторный домен связывает один из двух участков узнавания (эффекторную ДНК). Это связывание активирует связывание и расщепление второго участка узнавания (ДНК субстрата) в эндонуклеазном домене фермента. В результате исследования взаимодействия R.EcoRII с модифицированными аналогами субстрата были идентифицированы группы атомов гетероциклических оснований ДНК, вовлеченные в образование специфических водородных связей с ЭР EcoRII со стороны большой бороздки ДНК [4,5]. Контакты фермента со стороны малой бороздки ДНК и с углеводофосфатным остовом ДНК оставались неизученными. Поскольку к настоящему времени не удалось охарактеризовать структуру комплекса EcoRII с ДНК-дуплексом методом РСА, особую важность приобретает изучение этого комплекса с помощью различных подходов.
Целью настоящей работы явилось изучение контактов эндонуклеазы рестрикции EcoRII с углеводофосфатным остовом и малой бороздкой ДНК с помощью различных аналогов субстрата, определение области(ей) фермента R.EcoRII, контактирующих с ДНК, методом фотоаффинной модификации фермента, а также исследование структуры фермент-субстратного комплекса методами ИК-спектроскопии и флуоресцентной спектроскопии.
В работе решались следующие задачи. (I) Изучение субстратных свойств ДНК- дуплексов, содержащих в участке узнавания эндонуклеазы EcoRII: остатки l-(P-D-2'- дезокси-трео-пентафуранозил)цитозина (ЙСЖ) и/или 1-(р-В-2'-дезокси-трео- пентафуранозил)тимина (dT„) вместо остатков dC и dT, единичную хиральную тиофосфатную группу, замещающую поочередно все фосфатные группы участка узнавания, остатки (+)- или (-)-mpuHC-aHmw-6eH3o[a]nHpeHa-N2-dG ((+)dG* или (-)dG*) вместо остатков dG; (5) определение участка в ферменте R.EcoRII, взаимодействующего с центральной А/Т парой участка узнавания в ДНК, методом фотоаффинной модификации; (5) изучение переноса энергии в комплексе R.EcoRII^HK между красителями, присоединенными к участкам узнавания EcoRII, расположенным на одной или на разных молекулах ДНК.
Работа содержит литературный обзор, посвященный используемым в данной работе методам изучения ЭР типа II: кинетический подход, методы с использованием модифицированных аналогов субстрата, фотоаффинной модификации фермента и флуоресцентной спектроскопии. Также проводится сравнительный анализ эндонуклеазы EcoRII подтипа НЕ с другими ЭР этого же подтипа.
Использование модифицированных субстратов для изучения контактов, образуемых ЭР с ДНК
Одним из самых поразительных свойств эндонуклеаз рестрикции типа II является их высокая специфичность. В оптимальных условиях участки ДНК, отличающиеся от канонического участка узнавания только на одну пару оснований, пе расщепляются ЭР. За последние годы был достигнут определенный прогресс в понимании высокой специфичности действия этих ферментов. Во-первых, в её основе лежит образование водородных связей между аминокислотными остатками белка и функциональными группами оснований (так называемое "прямое считывание") [57]. Во-вторых, белки также узнают и сиквенс-зависимую конформацию фосфатных групп ДНК посредством образования электростатических контактов и водородных связей между аминокислотными остатками белка и фосфатными группами ДНК (концепция "непрямого считывания") [185]. Взаимодействие ЭР с функцинальными группами ДНК было охарактеризовано с помощью РСА, сайт-направленного мутагенеза белков и изучения взаимодействия ЭР с модифицированными аналогами субстрата. Несмотря на то, что в настоящее время выделено более трех тысяч ЭР, данные РСА получены всего для 14 комплексов ЭР с ДНК-дуплексами, среди которых комплексы, образуемые эндонуклеазами типа IIP (BamHI, Bglll, BsoBI, EcoRI, Bgll, EcoRV, Hindi, Mspl, PvuII, Muni, EcoO109I), типа IIS (Fokl), типа IIF (NgoMIV) и типа HE (Nael) [10]. Данные РСА показали, что ЭР образуют контакты преимущественно с гетероциклическими и с фосфатными группами ДНК в пределах участка узнавания и/или непосредственно рядом с ним. Прямые или опосредованные контакты ЭР с гетероциклическими основаниями (число прямых водородных и ван-дер-ваальсовых связей варьирует в пределах 12-22 и 2-Ю, соответственно [13]) осуществляются в семействе R.EcoRI (при гидролизе ДНК образуют 5 -выступающие концы, например, R.EcoRII) премущественно со стороны большой бороздки ДНК, а в семействе R.EcoRV (при гидролизе ДНК образуют тупые или 3 -выступающие концы, например R.NaeI) - со стороны малой бороздки ДНК. Хотя уже сейчас в семействе R.EcoRI найдены исключения, так как R.Eco0109I и R.BsoBI, связывают ДНК со стороны малой бороздки ДНК [58]. Контакты ЭР с углеводофосфатным остовом образуются с немостиковыми атомами кислорода фосфатных групп ДНК напрямую или через молекулы воды и солевые мостики (их число в среднем равно 12 [13]).
Метод сайт-направленного мутагенеза позволяет изучать контакты со стороны фермента путем замены одних аминокислотных остатков на другие, находящиеся по данным РСА в непосредственной близости от гетероциклических оснований [49,13] и углеводофосфатного остова [59,60] ДНК. Бьшо обнаружено, что эти замены значительно влияют на специфичность процесса узнавания и на каталитическую активность. Замещение на другие аминокислотные остатки аминокислотных остатков, образующих прямые контакты с гетероциклическими основаниями ДНК ("первичные"), по сравнению с замещением а.о., образующих контакты с углеводофосфатным остовом или опосредованные контакты через другие аминокислотные остатки, через молекулы воды, солевые мостики ("вторичные"), оказывают сравнимый эффект на активность ферментов [11]. Это говорит о необходимости поддержания всей сети ДНК-белковых контактов для нормального функционирования фермента. Остановимся на используемом в нашей работе подходе с применением модифицированных аналогов субстрата, позволяющем изучить взаимодействие ЭР с группами атомов ДНК. С помощью этого метода изучается влияние вносимых в ДНК модификаций, ослабляющих или полностью устраняющих контакты фермента с определенными атомами или группами атомов в ДНК, на взаимодействие фермента с модифицированными аналогами субстрата. Важно понимать, что для нормального функционирования ЭР необходимо сохранение всей сети ДНК-белковых контактов, как "первичных", так и "вторичных", поэтому этот метод дает информацию о том, входят ли изучаемые атомы или группа атомов ДНК в эту сеть ДНК-белковых контактов или нет. К настоящему времени для зонидрования контактов ЭР с гетероциклическими основаниями ДНК в реакциях с ЭР опробован широкий набор аналогов субстрата, содержащих модификации по гетероциклическим основаниям ДНК (Табл. 3-Табл. 5). К ним относятся протяженные ДНК или короткие ДНК-дуплексы, в которых удалена группа атомов (или основание) или определенные группы атомов (или основания) замещены на различные группы (или основания). Часто к модификациям - "удалениям" относят, например, замещение dT на dU или dA на dP, в которых удаляются функциональные СНз-или ЫНз-группы, соответственно [61]. К модификациям - "замещениям", например, относится замена dT на d4ST, при которой атом кислорода кето-группы замещается на атом серы. В некоторых статьях модификации - "удаления" рассматриваются как замещение функциональных групп на атом Н или С-Н-группу. Различают модификации, при которых число водородных связей в двойной спирали ДНК сохраняется (не изменяется термодинамическая стабильность двойной спирали ДНК) и при которых число этих водородных связей изменяется (Табл. 3-Табл. 5). В связи с этим стоит упомянуть модификации-"инверсии": замещение н.п. dA:dT на dlidM или dG:dC на dD:dU не изменяет число водородных связей в ДНК (не нарушает её стабильность), но при этом акцептор и донор Н-связи меняются местами (отсюда и названые модификации - "инверсия"). Большинство модификаций удаляют в ДНК потенциальные донор или акцептор Н-связи по отношению к эндонуклеазе. Например, замещение dA на dP или dT на d Т приводит к удалению донора (NH2-rpynna) или акцептора (С=0-группа) Н-связи, соответственно.
Замещение атома кислорода кето-группы на атом серы представляет собой более сложный случай, чем просто удаление Н-связи. Во-первых, связь C=S длиннее связи С=0 на 0.04 нм, атом серы 0.185 нм) имеет больший ван-дер-ваальсов радиус, чем атом кислорода (0.14 нм), поэтому введение данной модификации приводит к некоторым стерическим затруднениям. Во-вторых, тиокето-группа может образовывать Н-связь, хотя и в меньшей степени, чем кето-группа. Так как введение модификаций приводит к удалению или изменению групп атомов, локализованных в большой и/или малой бороздках ДНК (Рис. 3), поэтому возможна классификация модификаций и по этому признаку. Структура модификаций и их классификация приведены в Табл. З-Табл. 5. Приведены модификации, для которых, во-первых, получены количественные данные по влиянию на взаимодействие ЭР с ДНК, и, во-вторых, возможно определить нарушаемый контакт между ЭР и ДНК, согласно данным РСА для комплекса ЭР со специфической ДНК. Рассмотрим свойства модификаций и их влияние на взаимодействие ЭР типа II с ДНК. 1.1.2.1.2. Энергетическая оценка ДНК-белковых взаимодействий в терминах теории переходного состояния. Влияние вносимых модификаций на взаимодействие ЭР с ДНК рассмотрены в терминах теории переходного состояния. Согласно этой теории, полная энергия активации гидролиза, AG , состоит из двух составляющих: одна из них, AG", отвечает энергии активации химических стадий, в ходе которых происходит образование и разрыв связей, а другая, AGES, отражает энергию связывания (Рис. 4) [63]. Изменение стабильности фермент-субстратного комплекса ES (AAGr5) рассчитывается через константы Михаэлиса, определяемые в результате изучения стационарной кинетики, как AAGES = RTln(K od "1 ( К одиф) [63], так и через константы ассоциации, находимые в результате изучения связывания фермента с ДНК, как AAGFS = -НТЩК% /КТ" ) [41], где Я=1.986х10"3ккал/моль и Т=310 К. В последнем случае сравнение данных по связыванию, полученных в присутствии и в отсутствие аналога кофактора, ионов Са2+, позволяет установить влияет ли вносимая модификация на сродство комплекса ЭР-ДНК к ионам металла, являющимся необходимыми кофакторами для осуществления гидролиза. Изменение энергии активации химической стадии (AAG#) определяется обычно через максимальные скорости гидролиза, определяемые в результате изучения стационарной кинетики, как AAG№ =-КТ\п(У иф/У иф) [63]. Однако более информативным является определение AAG" через константы скорости гидролиза первого порядка, определяемые в результате изучения однооборотной кинетики, как AAG =-RTba(kZ /kZde ) [64]. Первый расчет менее информативен, так как изменение Vmax, определяемой в стационарных условиях, может определяться как скоростью химической стадии гидролиза, так и скоростью диссоциации продукта реакции.
Статистическое алкилирование или футпринтинг
Метод футпринтинга, связанный со статистическим алкилированием (этилированием или метилированием, Схема 4), позволяет сканировать контакты ЭР с фосфатными группами по всей молекуле ДНК. Один из вариантов футпринтинга основан на изучении связывания белка с популяцией статистически алкилированных молекул ДНК [98]. В том случае, если алкилирование конкретного фосфата влияет Схема 4 на связывание, продукт щелочного расщепления в фосфотриэфирном узле будет отсутствовать во фракции связанной ДНК и находиться в избытке во фракции несвязанной ДНК. С помощью этого метода было найдено, что 3-4 фосфатные группы ДНК образуют контакты ("ключевые" контакты) с ЭР (Табл. 9), необходимые для образования специфического ДНК-белкового комплекса. Эти контакты симметричны для обеих цепей относительно центра участков узнавания ЭР. Сравнение контактов, определённых данным методом с кристаллическими структурами комплексов EcoRI-ДНК и репрессор-ДНК показало, что сильная интерференция (влияние алкилирования фосфатной группы на связьгаание ЭР) наблюдается только с фосфатными группами, которые тесно связаны Н-связями с короткими полярными боковыми цепями или полипептидным остовом [100]. Фосфатные группы, которые контактируют с белком через солевые мостики или через молекулы НгО проявляют слабую интерференцию. В случае R.EcoRI фосфатные группы, найденные этим методом, необходимы для узнавания R.EcoRI специфической последовательности гетероциклических оснований, так как они закрепляют и ориентируют ДНК-узнающие спирали R.EcoRI в большой борозке ДНК [80] и стабилизируют изогнутую конформацию ДНК в ДНК-белковом комплексе [103]. Удаление этих фосфатных групп приводило к изменениям энергии связывания AAG в пределах +0.6 - +2.4 ккал/моль (Табл. 8). Для R.TaqI с помощью модификации этого метода, называемого ингибированием расщепления ДНК с помощью статистического этилирования (изучается не связывание, а гидролиз ДНК ЭР), определено, что все фосфатные группы участка узнавания TaqI в позициях TpCpGpAp необходимы для расщепления ДНК R.TaqI [104]. Было показано, что алкилирование фосфатных групп ДНК не влияет на образование неспецифического комплекса R.EcoRV с ДНК, в которой отсутствует участок узнавания EcoRV, и влияет на образование специфического комплекса [102]. Таким образом, в неспецифическом комплексе ЭР с ДНК, в которой нет участка узнавания ЭР, реализуются неспецифические контакты с фосфатными группами ДНК. Остановимся более подробно на методе, основанном на использовании аналогов субстрата, содержащих межнуклеотидную тиофосфатную группу. Для этого рассмотрим их свойства и взаимодействие с ЭР типа II. Тиофосфатные аналоги субстратов (Схема 5) являются незаменимым инструментом для зондирования контактов индивидуальных атомов кислорода фосфатных групп ДНК с ЭР и установления механизма их действия. Тиофосфатная группа (Ps-группа) существует в виде двух Rp- и Sp-диастереомеров (Схема 5), в которых атом серы Схема 5 направлен в большую бороздку и в сторону от ДНК, соответственно.
Отрицательный заряд в Ps-группе локализуется преимущественно на атоме серы, тогда как в фосфатной группе он делокализован между двумя атомами кислорода [105, 106, 107]. Атом серы больше атома кислорода, также связь P-S длиннее связи Р-0 на 0.5А, что может приводить к стерическим затруднениям в ДНК-белковом комплексе. Также тиофосфаты более кислотны, чем фосфаты (атом серы хуже образует Н-связь, чем атом кислорода) и могут быть по разному сольватированы. Mg +, кофактор ЭР, обладает хорошим сродством к атому кислорода и плохим сродством к атому серы. В последние годы исследования с применением тиосодержащих аналогов субстратов были направлены на изучение механизмов действия ЭР EcoRI и EcoRV. Ps-группа поочередно вводилась в участки узнавания R.EcoRI и R.EcoRV и рядом с ними в поз., отмеченные цифрами (Табл. 10). Замещение фосфатной группы на Ps-группу является одной из самых консервативных модификаций ДНК, практически не влияющей на структуру двойной спирали ДНК (как было показано с помощью РСА [108]), поэтому её введение должно нарушать ДНК-белковые взаимодействия только в месте модификации. Действительно, в случае большинства ЭР введение нескольких Ps-групп в участок узнавания ЭР в одну из цепей ДНК не нарушает гидролиз ЭР модифицированной цепи ДНК, а гидролиз модифицированной цепи блокируется только при модификации гидролизуемой связи [113-115]. Изменение свободной энергии связывания (AAGES) при введении двух Ps-rpynn (в случае R.EcoRI в поз. -I или 1) является простой суммой изменений AAG при введении одной Ps-группы в данные поз. по отдельности (аддитивный эффект) [110,111]. К тому же, введение Ps-группы в поз. -1 участка узнавания EcoRI не изменяло контакты R.EcoRI с фосфатными группами, как было показано с помощью метода статистического этилирования и изучения зависимости связывания от концентрации соли [110].
Таким образом, введение Ps-группы в одну половину участка узнавания не вызывало изменений ДНК-белковых контактов в другой, удалённой половине участка узнавания. Введение Ps-модификации, во многих случаях (Табл. 10), приводит к изменениям свободной энергии связывания (AAG ) в пределах -1.1 - +1.2 ккал/моль или энергии активации (AAG ) в пределах +0.5-+1.8 ккал/моль, сравнимым с энергией Н-связи (1.3 ккал/моль). Однако в случае модификации гидролизуемых фосфатных групп или соседних с З -конца от гидролизуемой, наблюдается значительно большее влияние на энергетку ДНК-белковых взаимодействий. При замещении расщепляемой фосфатной группы на Ps-группу происходит сильное ингибирование или блокирование гидролиза ДНК ЭР EcoRI, EcoRV (Табл. 10). Если несколько нехиральных Ps-групп вводились в одну цепь ДНК фага М13 или её производных в место расщепления и рядом (внутри участка узнавания), то большинство ЭР, узнающих последовательности ДНК длиной 5-7 н.п., такие как, BamHI, EcoRI, НішШІ, Aval [113], Hhal, Mspl, Hpall, PvuII, SacI [114], Avail, Banll, Hindll, Neil, PstI, Pvul, Bgll [115] гидролизовали немодифицированную цепь ДНК, а модифицированную цепь гидролизовали значительно медленнее или вообще не гидролизовали. Диэфиры тиофосфорной кислоты гидролизуются приблизительно с такой же скоростью, как и диэфиры фосфорной кислоты [185]. Поэтому ингибирование или блокирование гидролиза ЭР Ps-группы в месте расщепления нельзя объяснить химическими свойствами Ps-группы. Вероятно, это связано с нарушением сети водородных связей ЭР с расщепляемой фосфатной группой и более низким сродством ионов магния к Ps-группе, чем к фосфатной группе. Действительно, как отмечалось во многих работах, гидролизуемая фосфатная группа участвует в сборке каталитических компонентов (ионов Mg + и трех а. о. фермента, участвующих в катализе) и входит в состав сети прямых водородных связей, образуемых между ферментом и ДНК [185]. Замещение на атом серы про-5р-атома кислорода гидролизуемой связи приводило к отсутствию гидролиза ДНК, а замещение про-Йр-атома кислорода - к ухудшению гидролиза ДНК эндонуклеазами EcoRI, EcoRV (Табл. 10) и Sfil [116]. Такая разница в гидролизе изомеров может быть связана с тем, что по данным РСА (Табл. 10) замещаемый на атом серы npo-Sp атом кислорода расщепляемой связи, в противоположность про-йр-атому, образует контакт с кофактором Mg2+, абсолютно необходимым для гидролиза ДНК ЭР EcoRI и EcoRV. Сродство атома серы к Mg2+ значительно хуже, чем у атома кислорода [105-107], поэтому замена на атом серы кислорода фосфатной группы может нарушать контакт с Mg +. К тому же связь P-S длиннее связи Р-0 на 0.5А, что может приводить к стерическим затруднениям при связывании аналога кофактора Са + (ионный радиус lA) или кофактора Mg2+ (ионный радиус 0.72А). Вероятно, замена на атом серы npo-Sp-кислорода нарушает контакт с Mg + и поэтому полностью блокирует гидролиз, а замена на атом серы про-Др-кислорода не нарушает контакт с Mg2+ и поэтому только ингибирует гидролиз.
Механизм транслокации
Взаимодействие ЭР с двумя фрагментами ДНК может осуществляться по ID-механизму (линейная диффузия фермента вдоль ДНК без диссоциации) или по трехмерному ЗО-механизму, при котором поиск участка узнавания происходит путем диссоциации фермента с ДНК в раствор [56]. Установлено, что в случае ЭР типа I и III, одновременно взаимодействующих с двумя участками ДНК, поиск участков узнавания происходит путем транслокации вдоль ДНК за счет энергии гидролиза АТФ. В случае ЭР подтипа НЕ было установлено, что взаимодействие с двумя участками узнавания происходит согласно ЗО-механизму за счёт броуновского движения. Очевидно, что транслокация по Ш-механизму требовала бы дополнительных энергетических затрат, например, гидролиза АТФ. Так, в случае ЭР EcoRII связывание Lac-penpeccopa с ДНК между двумя участками узнавания EcoRII в ДНК не препятствовало расщеплению ДНК эндонуклеазой EcoRII [160]. В случае ID-механизма Lac-penpeccop являлся бы "барьером" для R.EcoRII, как было показано для "классических" ЭР типа IIP (например, для EcoRI [182]). В случае R.NaeI катенановая ДНК, содержащая два участка узнавания Nael, гидролизуется ЭР Nael гораздо эффективнее, чем кольцевые плазмиды, содержащие один участок узнавания, не сцепленные в катенан (Если бы R.NaeI взаимодействовала с участками узнавания по Ш-механизму, то участки узнавания из разных колец ДНК не могли бы быть объединены ферментом в один комплекс и гидролиза не происходило бы. Сцепление колец позволяет удерживать участки узнавания в непосредственной близости друг к другу, что облегчает ферменту их объединение через пространство по ЗО-механизму. 1.2.2.6. Кинетические модели гидролиза ДНК. На основании изучения активации гидролиза "устойчивых" к действию ЭР типа НЕ ДНК, содержащих один участок узнавания (в случае R.NaeI - ДНК бактериофага М13тр18, в случае R.EcoRII 71-звенного ДНК-дуплекса) в присутствии 14-ти-звенных ДНК-дуплексов с одним участком узнавания были предложены кинетические схемы, описывающие активированное расщепления ДНК эндонуклеазами R.EcoRII [172,183] (Рис. 15А и Б) и R.NaeI [171] (Рис. 15В). Результаты обрабатывались в рамках модели Михаэлиса-Ментен.
Были получены кинетические параметры (Км и Ктах). ЭР типа ИЕ можно подразделить на два основных класса, класс V и класс К, на основании сравнения кинетики гидролиза ДНК-субстрата в присутствии ДНК-аллостерического эффектора с кинетикой гидролиза ДНК-субстрата самого по себе [184]. В случае R.NaeI и R.BspMI [184], ферментов класса V, добавление аллостерического эффектора приводит к увеличению максимальной скорости гидролиза субстрата Vmax без изменения константы Михаэлиса Км- Таким образом, для Nael характерен неконкурентный тип активации расщепления "устойчивых" ДНК в присутствии ДНК-активаторов (эффекторов). Действие эффектора проявлялось на стадии катализа, а не связывания. В рамках предложенной схемы было найдено, что сродство эффектор-связывающего участка R.NaeI выше к ДНК-дуплексам с GC-богатыми фланкирующими последовательностями, тогда как сродство субстрат-связывающего участка R.NaeI, наоборот, выше к ДНК-дуплексам с АТ-богатыми фланкирующими последовательностями. В случае R.EcoRJI [172], R.NarI, R.HpaII, R.SacII [184], ферментов класса К, добавление аллостерического эффектора приводит к уменьшению константы Км, тогда как константа Vmax не изменяется. Таким образом, для R.EcoRII характерен конкурентный тип активации расщепления "устойчивых" ДНК в присутствии ДНК-активаторов (эффекторов). Действие эффектора проявляется на стадии связывания, а не катализа. В случае R.EcoRII обе кинетические схемы I и II одинаково хорошо описьшают экспериментальные данные. Другими словами, в случае ферментов класса V места связывания ДНК-субстрата и ДНК-эффектора сильно отличаются, поэтому ДНК-субстрат и ДНК-эффектор не конкурируют за место связывания. В случае ферментов класса К места связывания ДНК-субстрата и ДНК-эффектора не различаются (или мало отличаются) друг от друга и имеет место конкуренция ДНК-субстрата и ДНК-эффектора за места связывания. 2.1. Зондирование контактов эндонуклеазы EcoRII с фосфатными группами ДНК. Как отмечалось в главе 1, одним из подходов, позволяющих изучать взаимодействие ЭР с функциональными группами ДНК, является использование модифицированных аналогов субстрата. С помощью этого метода изучается влияние вносимых в ДНК модификаций, ослабляющих или полностью устраняющих контакты фермента с определенными атомами или группами атомов в ДНК, на взаимодействие фермента с модифицированными аналогами субстрата. Высокая специфичность расщепления ДНК ЭР обусловлена образованием контактов ЭР с гетероциклическими основаниями ("прямое считывание") и межнуклеотидными фосфатными группами ДНК ("непрямое считывание") участка узнавания ЭР. Ранее с помощью модифицированных аналогов субстрата были исследованы контакты ЭР EcoRII с гетероциклическими основаниями ДНК, однако данные относительно контактов R.EcoRII с фосфатными группами ДНК практически отсутствовали. 2.1.1. ДНК-дуплексы, содержащие модифицированные углеводные остатки.
Для зондирования контактов R.EcoRII с межнуклеотидными фосфатными группами ДНК в участке узнавания EcoRII в пяти позициях 2-4, 8 и 9 изменялось пространственное положение фосфатной группы с помощью замещения остатков dC или dT в участке узнавания EcoRII на остатки 1-(р-0-2 -дезокси-/ирео-пентафуранозил)цитозина (dCx) или 1-(р-В-2 -дезокси-трео-пентафуранозил)тимина (dT,), соответственно, (Схема 12 и Табл. 13) и исследовалось влияние этих модификаций на субстратные свойства ДНК-дуплексов II-VI В отсутствие ионов Mg2" " немодифицированный ДНК-дуплекс I образовывал комплекс с R.EcoRII в противоположность неспецифическому ДНК-дуплексу VII (5(AGAGCCGGTTGGGT-ATCTCGGCCAACCG), у которого отсутствовал участок узнавания EcoRII. R.EcoRII связывала ДНК-дуплексы III, IV и VI (Рис. 17, дор. 4, 5 и 7) с той же эффективностью, что и немодифицированный субстрат I (Рис. 17, дор. 2); связывание ДНК-дуплекса II ухудшалось в 2.5 раза, а ДНК-дуплекс V вообще не связывался R.EcoRII (Рис. 17, дор. 3 и 6). Можно предположить, что в отсутствие ионов Mg2+ R.EcoRII образует контакты с фосфатными группами ДНК в позициях 2 и 8 (Схема 12), расположенными с 3 -конца от расщепляемых связей, и не образует контактов с фосфатными группами в позициях 3, 4 и 9. Возможно, эти контакты отвечают за взаимодействие эффекторных доменов R.EcoRII с ДНК, так как в отсутствие ионов Mg эффекторные домены, полученные путём удаления каталитических доменов из полноразмерной R.EcoRII с помощью молекулярного клонирования, прочно связывают субстрат, а каталитические домены, полученные аналогичным способом, практически не связывают ДНК при используемых нами концентрациях R.EcoRII и ДНК-дуплексов (Tamulaitis, G., and Siksnys, V., неопубл. данные). Расщепление R.EcoRII обеих цепей ДНК-дуплексов II, III, V и VI, содержащих остатки dCx, было полностью блокировано (Рис. 18). ДНК-дуплекс IV, содержащий остаток dTx, обладал такими же субстратными свойствами (К$ф 4.6 мкМ, ккат 3.4 мин"1), как и немодифицированный субстрат I (Кэфф 2.3 мкМ, ккат 3.0 мин"1). Следует отметить, что и эффекторные, и каталитические домены R.EcoRII образуют контакты с ДНК, поэтому нарушение ДНК-белкового контакта хотя бы в одном из доменов может приводить к нарушению расщепления ДНК R.EcoRII. На основании влияния нарушения пространственного расположения межнуклеотидной фосфатной группы на расщепление ДНК R.EcoRII можно предположить, что эффекторные и/или каталитические домены R.EcoRII образуют контакты с фосфатными группами ДНК в позициях 2, 3, 8 и 9 и не образуют контактов с фосфатной группой в позиции 4.
Идентификация участка эндонуклеазы EcoRII, взаимодействующего с центральной нуклеотидной парой участка узнавания в ДНК, методом фотоаффинной модификации.
Ранее в нашей лаборатории Кирсановой О.В. с помощью ДНК-дуплексов, содержащих остатки 5-иод-2 -дезоксиуридина (IdU) в различных положениях участка узнавания EcoRII и рядом с ним, бьшо определено, что в присутствии аналога кофактора, ионов Са +, при замене dT или dA центральной н. п. участка узнавания на IdU происходит фотоприсоединение IdU-содержащих ДНК-дуплексов R.EcoRII с высоким выходом. В присутствии кофактора, ионов Mg+, также происходит фотоаффинная модификация R.EcoRII ДНК-дуплексами, содержащими IdU в центре участка узнавания [124], но с меньшими выходами, вероятно, по причине гидролиза ДНК-дуплексов в процессе фотоприсоединения. Таким образом, комплекс R.EcoRH-/]HK в присутствии инов Са2+ имитирует комплекс R.EcoRII-flHK в присутствии природного кофактора. Для идентификации области(ей) EcoRII, образующей(их) специфические контакты с каждым гетероциклическим основанием А/Т-пары участка узнавания EcoRII в фермент-субстратном комплексе, была проведена фотоаффинная модификация R.EcoRII ДНК-дуплексами, содержащими в участке узнавания EcoRII остаток 5-иододезоксиуридина (IdU) вместо остатка dA (XXV, S -AGAGCCAGGTTGGC/S CTCGG-IdU-CCAACCG) или dT (XXVI, 5 -AGAGCC-IdU-GGTTGGa3vrCTCGGTCCAACCG) в условиях, разработанных ранее Бабкиной О.В. Комплекс R.EcoRII-flHK формировали в присутствии ионов Са2+, при молярном соотношении R.EcoWIju.uepflHK-.iryiineKc, равном 1:2 (Схема 16). Фотоаффинную модификацию R.EcoRII ДНК-дуплексами XXV и XXVI проводили мягким УФ-облучением (к 300 им) комплекса R.EcoRII-flHK. Установление места фотоприсоединения ДНК-дуплексов XXV и XXVI к R.EcoRII осуществляли с помощью полного расщепления белка химотрипсином в составе каждого ковалентного конъюгата (при соотношении R.EcoRII:xHMOTpHncHH, равном 30:1 (по массе)). В этих условиях из каждого конъюгата был получен только один олигонуклеотидопептид (ОН-пептид) (Схема 16). Полученные ОН-пептиды были проанализированы методами MALDI масс- спектрометрии и секвенировапия по Эдману. Молекулярная масса (Мг) ОН-пептида, полученного путём протеолиза конъюгата К.ЕсоК11-(ДНК-дуплекс XXV), составила 7018 Да, что соответствует ОН-пептиду, включающему олигонуклеотид 5 -AGAGCC-dU- GGTTGGC с массой 4305 Да (за вычетом Мг атома Н) и пептид с массой 2713 Да. Мг ОН- пептида, полученного путём протеолиза конъюгата ІІ.ЕсоІШ-(ДНК-дуплекс XXVI), составила 6900 Да, что соответствует ОН-пептиду, включающему олигонуклеотид 5 - GCCAACC-dU-GGCTCT с массой 4185 Да (за вычетом Мг атома Н) и пептид с массой 2715 Да. Таким образом, Мг каждого из пептидных фрагментов в обоих ОН-пептидах равны между собой.
Они наиболее соответствуют пептиду 208VKNSLDPDEQLLDRRRVEYDIF229, теоретическая масса которого составляет 2718 Да. Определены аминокислотные последовательности ОН-пептидов, полученных при фотоприсоединении к R.EcoRII ДНК-дуплексов XXV и XXVI: V NSLDPDEQLL RRV и V NSLDP (" " - а.о., которые не приводили к образованию фенилтиогидантоинового производного аминокислоты), соответственно. Мг и первичная структура пептидных фрагментов совпадают для обоих ОН-пептидов, значит, места присоединения к ферменту ДНК-дуплексов XXV (замещение остатка dT на IdU) и XXVI (замещение остатка dA на IdU) в составе ДНК-белкового конъюгата совпадают. Ранее такой же вывод был сделан Бабкиной О.В. на основании того, что при расщеплении продуктов фотоприсоединения R.EcoRJI к ДНК-дуплексам XXV и XXVI химическими реагентами получались идентичные наборы ОН-пептидов. ОН-пептид с массой 7018 Да, полученный из конъюгата Я.ЕсоИ11-(ДНК-дуплекс XXV), был дополнительно обработан неспецифической протеиназой К. Масс-спектр продуктов гидролиза приведен на Рис. 29. Массы пептидов, соответствующие продуктам гидролиза, суммированы в Табл. 18. Анализ масс всех возможных продуктов неспецифического гидролиза ОН-пептида с массой 7018 Да с помощью программы GPMAW позволил определить пептиды из найденной ранее области VKNSLDPDEQLLDRRRVEYDIF, соответствующие массам, указанным в колонке 1 с точностью 1 % (Табл. 18, кол, 2). Каждой массе пептида (Табл. 18, кол, 1) соответствует пептид VEYD , подчеркнутый и выделенный жирным цветом (Табл. 18, кол. 2). В среднем, разность между теоретической массой пептида и экспериментально определенной составляет +6 Да, что соответствует разности +3-+5 Да в случае ОН-пептидов после химотрипсинолиза. Таким образом, последующая обработка неспецифической протеиназой К ОН-пептида, полученного из конъюгата R.EcoRII-(HHK-дуплекс XXV), и анализ полученных продуктов с помощью MALDI масс-спектрометрии позволили сузить район фотоприсоединения до области 224VEYD227. -получена путем вычитания массы олигонуклеотида 4187 Да из массы ОН-пептида, указанной на Рис. 29,6 - пептиды из области VKNSLDPDEQLLDRRRVEYDIF, у которых масса отличалась не более, чем на 1% от массы, указанной в колонке 2, — из массы пептида в колонке 2 вычтена масса пептида в колонке 1. Найденная область находится в каталитическом домене R.EcoRII (Схема 16 и Рис. 30). Фотоприсоединение остатка IdU обычно происходит к электрон-богатым а.о.: Туг, Phe, Тгр, His или Met. Поэтому, возможно, что из области VEYD227 ковалентно присоединяется к А/Т-паре участка узнавания остаток Y226. Отсутствие фотоприсоединения IdU-содержащих ДНК-дуплексов к эффекторным доменам R.EcoRII позволяет предположить, что А/Т-пара участка узнавания, расположенного в ДНК- связывающей полости, образованной эффекторными доменами R.EcoRII, не сближена с электрон-богатыми а.о.
Ранее с помощью фотоаффинной модификации R.EcoRII ДНК-дуплексами, содержащими 5-иодо-2 -дезоксицитидин вместо внешнего остатка dC участка узнавания EcoRII, было установлено, что в ДНК-связывающей полости, образованной эффекторными доменами R.EcoRII, остаток Тут сближен с внешним остатком dC участка узнавания [124]. По данным РСА R.EcoRII область 224VEYD227 находится внутри ДНК-связывающей полости, образуемой каталитическими доменами R.EcoRII (Рис. 30), вне каталитического кора R.EcoRII и принадлежит центральной части а-спирали Н-10, принимающей участие в димеризации субъединиц R.EcoRII [3]. По данным моделирования комплекса каталитического домена R.EcoRII с ДНК-дуплексом 5 -CCTGG/3 -GGACC центральная часть спирали НЮ сближена с А/Т-пароЙ участка узнавания [3]. Таким образом, в комплексе R.EcoRII-flHK область фермента 224VEYD227 сближена с А/Т-парой участка узнавания. Участие а-спирали, обеспечивающей димеризацию субъединиц ЭР, в узнавании ДНК характерно для семейства ЭР, образующих 5 -выступающие концы при расщеплении ДНК [14]. 2.3. Изучение структуры комплекса К.ЕсоШ1-ДНК с помощью флуоресценции. 2.3.1. Взаиморасположение участков узнавания EcoRII в комплексе R.EcoRlI-ДНК. Ввиду отсутствия РСА комплекса &ЕсоРЛ-ДНК неизвестно, как ориентированы участки узнавания EcoRII друг относительно друга в комплексе, образующемся в присутствии ионов Са +. Для решения этого вопроса мы изучали резонансный перенос энергии возбуждения флуоресценции (FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer) в комплексе R.EcoRII-flHK между флуоресцентными метками, находящимися на разных молекулах ДНК, содержащих один участок узнавания (/я/лянс-локализация участков узнавания) (Табл. 19) или на разных концах молекулы ДНК, содержащей два участка узнавания EcoRII (//нс-локализация участков узнавания) (Табл. 20). Определение эффективности FRET (Е ) позволяет согласно уравнению Фёрстера EFRkT = RQ/(RQ +R6) (где Ro - расстояние Фёрстера) определить расстояние (R) между красителями. Однако для определения пространственного расположения двух участков узнавания в комплексе R.EcoRII HK необходимо иметь набор расстояний между красителями. Для получения этих данных варьировали расстояние между флуоресцентными красителями и участком узнавания, изменяя длину ДНК. 2.3.1.1. 7ранс-локалшация участков узнавания. В случае трдас-локализации сайтов изучался FRET в комплексе R.EcoRII-,HHK между донором - 5(6)-карбоксифлуоресцеином (FAM) и акцептором - 5(6)-карбокситетраметилродамином (TAMRA), ковалентно присоединёнными к 5 - или 3 -концу одной из цепей ДНК-дуплексов (Табл. 19).
