Введение к работе
Актуальность проблемы. Рибосома представляет собой сложный макромолекулярный комплекс РНК и белков, осуществляющий биосинтез белка во всех живых организмах. Таким образом, исследование структуры рибосомы представляет собой огромный научный интерес. В связи с крупными размерами рибосомы определение ее структуры является крайне сложной задачей. Несмотря на значительные успехи в развитии структурных физико-химических методов, к настоящему времени удхзось определить структуру рибосомы лишь с относительно низким разрешением (9А). Такое разрешение дает представление о форме рибосомы и даже позволяет выявить определенные спиральные районы РНК в рибосоме, однако, не позволяет соотнести эти районы с известными элементами первичной и вторичной структуры. Единственный способ представить себе реальное расположение РНК в рибосоме -компьютерное моделирование, основанное на комбинации данных о структуре рибосомы полученных с низким разрешением с помощью РСА или криоэлектронной микроскопии, вместе с данными, полученными с помощью различных биохимических методов. Однако, следует заметить, что количество биохимических данных для разных районов РНК значительно зарьируется и, как следствие, различные области моделей рибосомы построены с разной степенью достоверности. В связи с этим совершенно необходимой является разработка методов, позволяющих избирательно изучить структуру отдельных районов рибосомы.
Цель работы. Разработка и применение метода направленной фотохимической модификации рнбосомных РНК.
Научная новизна и практическая значимость. В настоящей работе был разработан универсальный метод для внесения фотохимической пробы в выбранные районы высокомолекулярных РНК, в частности, рибосомной РНК. Метод основан на гидролизе РНК с помощью РНКазы Н в присутствии модифицированных олигорибонуклеотидов. Фотоактивируемый нуклеотид, например 5'-3'-дифосфат тиоуридина, вводится в место разрыва в РНК с помощью РНК лигазы. Фрагментированная РНК, несущая фотоактивируемый нуклеотид, впоследствии ассоциирует с рибосомными белками с образованием активных рибосомных субчастиц. Далее такие рибосомные субчастицы облучаются мягким УФ-светом и полученные пришивки анализируются с помощью стандартных методов: гидролиза РНКазой Н и обратной транскрипцией.
^гот метод был успешно применен для 16S рРНК. Дифосфат тиоуридина был присоединен к нуклеотиду 1041 39 спирали 16S рРНК и пришит к двум нуклеотидам спирали 41. Полученные данные, с одной стороны, согласуются с ранее описанными сшивками между этими спиралями, которые получали облучением рибосом жестким УФ-светом. и. с другой стороны, позволяют судить о взаимной ориентации спиралей 39 и 41 в 30S субчастице.
Использование данного метода для 23S рРНК позволило получить и идентифицировать ряд внутренних РНК-сшивок. Несколько сшивок были получены внутри одних и тех же элементов вторичной структуры. Такие пришивки могут служить, с одной стороны, независимым подтверждением предложенной вторичной структуры рРНК и, с другой стороны, проясняют особенности структуры спиралей, в которых они были получены. Также было получено несколько пришивок между различными элементами вторичной структуры 23S рРНК. На основании этих данных можно утверждать, что спирали 21 и 22 домена 1 23 S рРНК сближены в пространстве, и скорее всего расположены антипараллельно по отношению друг к другу. Также было показано, что спирали 41 и 42, находящиеся в непосредственной близости к району связывания элонгационных факторов, формируют "U-образный" поворот.
Полученные данные открывают новые возможности изучения структуры рРНК; они несут новую важную информацию о конформации ряда элементов рРНК и .могут значительно помочь моделированию пространственной структуры рибосомы.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на международной конференции "Взаимодействие лигандов с рибосомой", Москва-Гурзуф, 1994, на международной конференции "Контроль трансляции", Колд Спринг Харбор, Нью-Йорк (США), 1994, на 3-м международном симпозиуме "Биоорганическая химия", Дагомыс, 1995, на международной конференции "Frontiers in translation", Виктория (Канада), 1995, на 1-й ежегодной конференции международного РНК общества, Мэдисон (США), 1996, на всероссийской конференции студентов и аспирантов, Москва, 1997, на 2-й ежегодной конференции международного РНК общества, Альберта (Канада), 1997. на третьей международной конференции посвященной памяти Энгельгардта, Волга, 1997, на 3-й ежегодной конференции международного РНК общества, Мэдисон (США), 1998, на международной Гордон конференции "Исследования нуклеиновых кислот" Нью-Порт, Род Айлэнд (США), 1998, на международной конференции "Структурные исследования рибосомы и ее функциональных комплексов", Ганновер (Германия), 1998.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на страницах
