Введение к работе
Актуальность проблемы. Решение основных проблем физико-химической и молекулярной биологии, биооргаїшческой химии и генной инженерии во многом зависит от возможности получения структурно-функциональной информации с помощью физико-химических методов анализа. В то же время необходимость изучения более сложных биологических систем, таких как мембранные белки, белок-нуклеотидные комплексы, живущие клетки, а также требования проведения исследования на микроколичествах вещества вызывают некоторый кризис в применении традиционных и высокоинформативных методов рентгеноструктурного анализа, инфракрасной спектроскопии, спектроскопии спонтанного комбинационного рассеяния и кругового дихроизма.
Ключом к решению этих проблем является разработка новых физико-химических методов исследования биологических молекул и надмолекулярных комплексов, которые позволили бы, во-первых, резхо повысить чувствительность анализа, снизив предел регистрация спектров до пюсограммовых количеств вещества и, во-вторых, проводить селективный структурно-функциональный анализ различных компонеіітов бяологачесхой системы in vivo.
Среди методов оптической спектроскопии в приложениях к изучению биомолекул выделяется спектроскопия комбинационного рассеяния (КР) света. Этот метод позволяет получать информацию о структуре основной цепи белков и нуклеиновых кислот, а также о микроокружении отдельных аминокислотных остатков и нуклеотидов, изучать конформацию дисульфидных связей, проводить кинетические измерения in vivo. Спонтанная спектроскопия КР позволяет получать спектры изучаемых молекул в любых агрегатных состояниях, что особенно важно для интерпретации данных рештеноструктурного анализа высокого разрешения. В то же время этот метод отличается низкой чувствительностью, что вызывает необходимость использования высоких (до 10 М) концентраций биомолекул и больших, часто недоступных, количеств вещества. Кроме того, он дает усредненную информацию о микроокружении всех компонентов макромолекул (например, всех остатков триптофана в молекуле белка, либо общее содержание регулярной структуры одного типа в конформации основной цепи белка).
1-І
В начале 80-х годов возникли новые разновидности этого метода - спектроскопии резонансного комбинационного рассеяния (РКР) и гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) биомолекул. Эти методические подходы позволили резко снизить необходимое количество исследуемого вещества, а > также повысить информативность за счет высокой селективности анализа. При этом значительно увеличились объем и качество информации о пространственной структуре белков, нуклеиновых кислот и надмолекулярных комплексов.
Цели и задачи исследования. Основной целью исследования
была разработка на основании ГКР-спектроскопии принципиально
новых методов анализа пространственной структуры мембранных и
водорастворимых белков и нуклеиновых кислот, позволяющих
использовать пикограммовые количества вещества. Следующая задача
заключалась в разработке подхода к. изучению структуры
надмолекулярных комплексов, отличающегося высокой
избирательностью анализа состояния отдельных, входящих в их состав, компонентов. Кроме того, разрабатывались методы исследования топографии надмолекулярных комплексов, позволяющие избирательно детектировать сигналы от гидрофобных и экспонированных в водную фазу областей мембранно-связанных белков in vivo; определения вторичной структуры нуклеиновых кислот и участков дестабилизации двойной спирали с использованием пикограммовых количеств вещества, а также различные аналитические приложения, основанные на рекордной чувствительности метода спектроскопии ГКР.
При решении указанных методических задач было проведено структурно-функциональное исследование молекул, играющих ключевую роль в изучении механизмов следующих процессов:
светоиндуцированного транспорта протонов через клеточную мембрану (бактериородопсин);
переноса зрительного импульса (зрительный родопсин);
- АТФ-зависимого ' транспорта ионов через каналы в
биологических мембранах (Na,K-AT
Кроме того, предложен метод диагностики катаракты и получено авторское свидетельство на способ получения ГКР-актквноа поверхности, обеспечивающей усиление сечения КР на 5-7 порядков величины.
Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе впервые:
- разработан новый физико-химический метод изучения
биологических молекул на основании спектроскопии ГКР и получены
спектры аминокислот, дипептидов, водорастворимых и мембранных
белков, нуклеиновых кислот и некоторых низкомолекулярных
соединений;
- предложены экспериментальные системы для анализа
пикограммовых количеств биомолекул, обеспечивающие увеличение
сечения КР на 5-7 порядков величины;
- обнаружен эффект индуцированной адсорбцией оптической
активности комплексов гидрозолей серебра с биомолекулами, который
может послужить основой для разработки новых высокочувствительных
методов поляризационной спектроскопии;
разработаны подходы к определению вторичной структуры нуклеиновых кислот и локализации участков дестабилизации двойной спирали на основании спектроскопии ГКР;
предложен метод изучения топографии мембранно-связанных надмолекулярных комплексов на основе избирательной реализации дально- и короткодействующей компонент механизма усиления КР;
- показано, что спектроскопия ГКР обеспечивает
экспресс-диагностику ранних стадий катаракты.
На основании указанных новых методических подходов впервые:
определено трансмембранное положение и ориентация хромофоров бактериального и зрительного родопсинов на различных стадиях функционирования пигментов и предложена модель их микроокружения; локализован аминокислотный остаток катализирующий еветоиндуциро— ванное депротонирование альдимина ретиналя бактериородопсина;
проведен селективный анализ гидрофобных и гидрофильных участков а- и р-субъединиц КаД-АТФазы из почки свиньи и на основании комбинированного подхода, включающего данные оптической спектроскопии и расчетных методов предложена модель трансмембранной организации фермента;
- обнаружены н локализованы конформационные изменения
Na^C-АТФазы, индуцированные связыванием одновалентных катионов;
- предложена технология получения ГКР-активных поверхностей,
обеспечивающая усиление КР на 5-7 порядков.
Практическая значимость диссертационной работы заключается прежде всего в создании' нового физико-химического метода анализа биомолекул; метода диагностики катаракты; получении структурно-функциональной информации для ряда белков и нуклеиновых кислот, а также новой технологии получения ГКР—активных поверхностей, которые могут быть использованы в качестве высокочувствительных детекторов в приборах новых поколений.
