Введение к работе
Актуальность проблемы. Протеолитические ферменты ракообразных обладают рядом необычных свойств и находят широкое применение в медицине и биотехнологии. У многих видов крабов и креветок обнаружены сериновые коллагенолитические протеиназы (СКП), которые способны гидролизовать коллаген в физиологических условиях и поэтому успешно используются для лечения рубцово-изменённой ткани. Ферментные препараты из ракообразных также являются эффективными средствами лечения ран, так как разрушают избыточные фибриновые отложения. При этом действие индивидуальных протеиназ из ракообразных на фибриноген, фибрин и другие белки плазмы крови мало изучено. Исследование взаимодействия протеиназ с компонентами плазмы крови имеет большое значение для создания более эффективных ферментных препаратов.
Для полной характеристики некоторых протеиназ камчатского краба, обладающих широкой первичной специфичностью, требуется исследование их взаимодействия с высокомолекулярными субстратами. Данные о влиянии пространственной структуры белковых субстратов на эффективность протеолиза представляют несомненный теоретический интерес и могут быть использованы для разработки методик изучения пространственной структуры белков с помощью ограниченного протеолиза. Расширение набора ферментов, используемых для ограниченного протеолиза, в том числе внедрение высокоактивных и доступных в больших количествах протеиназ ракообразных, безусловно, откроет новые возможности для исследователей.
Для пищеварительных сериновых протеиназ ракообразных характерно наличие изоформ. Сходство первичной структуры изоформ при заметных различиях в некоторых свойствах делает эти белки привлекательными объектами для изучения структурно-функциональных взаимосвязей.
Температура среды обитания камчатского краба составляет +4 ...+8С, и поэтому ферменты этого беспозвоночного, вероятно, приспособлены к функционированию при низких температурах. Протеиназы психротрофных организмов представляют интерес для биотехнологии. Структурно-функциональные исследования таких ферментов имеют большое значение для белковой инженерии. Большинство исследованных протеиназ из психротрофных организмов принадлежит к семейству трипсина, а ферменты других семейств мало изучены, хотя известно, что механизмы холодовой адаптации протеиназ, принадлежащих к разным семействам, могут различаться. Определение характера зависимости кинетических констант от температуры - важный этап изучения любого фермента, приспособленного к низким температурам. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение двух эндо-пептидаз камчатского краба - металлопротеиназы, принадлежащей к семейству аста-
цина, и изоформы сериновой коллагенолитической протеиназы (сокращённое обозначение - СКП-2). Для выполнения работы были поставлены следующие задачи:
Получение металлопротеиназы и СКП-2 в электрофоретически гомогенном состоянии.
Анализ первичной структуры металлопротеиназы и доказательство её соответствия структуре, определённой по кДНК. Исследование структуры СКП-2 с помощью масс-спектрометрии.
Определение энзиматических свойств выделенных протеиназ.
Изучение температурной зависимости кинетических констант гидролиза различных субстратов металлопротеиназой и СКП-2.
Исследование действия металлопротеиназы и СКП-2 на фибриноген, фибрин, плаз-миноген и плазму крови, а также на коллаген. Идентификация высокомолекулярных продуктов гидролиза фибриногена с помощью масс-спектрометрии.
Научная новизна и практическая значимость работы. Установлена первичная структура и определены свойства металлопротеиназы камчатского краба - нового представителя семейства астацина. Первичная структура СКП-2 - изоформы сериновой коллагенолитической протеиназы камчатского краба - установлена частично. Определены свойства СКП-2, в том числе кинетические параметры гидролиза хромогенных субстратов. Охарактеризована зависимость кинетических параметров гидролиза азо-казеина металлопротеиназой и хромогенных субстратов СКП-2 от температуры. Охарактеризованы высокомолекулярные продукты гидролиза фибриногена металлопротеиназой краба и СКП-2.
Фибринолитическая активность исследованных протеиназ и их способность активировать плазминоген, а также коллагенолитическая активность СКП-2 имеют большое значение для разработки новых средств лечения ран и рубцов. Получено положительное решение по заявке на патент РФ, оформленной по результатам работы.
Публикация и апробация работы. По материалам диссертации опубликованы 5 статей. Результаты работы были представлены на международных конференциях студентов и аспирантов «Ломоносов» (Москва, 2005 и 2006 гг.), конференции «Метцин-киновые протеиназы в здоровом организме и при патологиях» (Аскона, Швейцария, 2006), IV Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007), VI международном симпозиуме "Химия протео-литических ферментов" (Москва, 2007), V съезде международного общества по изучению протеолиза (Патра, Греция, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (232 ссылки). Работа изложена на 148 страницах и содержит 33 рисунка и 10 таблиц.
