Введение к работе
Актуальность проблемы
Трипсины являются наиболее типичными представителями сериновых протеиназ. В настоящее время трипсины обнаружены в организмах, принадлежащих к различным таксономическим группам. Функции, выполняемые этими ферментами, довольно разнообразны. Основной функцией трипсина в организме человека, млекопитающих и беспозвоночных животных является участие данного фермента в пищеварении и активации других протеолитических ферментов, участвующих в этом процессе. Кроме того, у человека и млекопитающих доказано участие трипсина в процессах клеточной пролиферации, расширении сосудов, развитии воспаления, а также в различных патологических состояниях: от рака, панкреатита, астмы и до дерматитов и экземы. У беспозвоночных животных физиологические и биохимические процессы, в которых принимают участие трипсины, изучены слабее. На данный момент, у насекомых и ракообразных показано участие трипсина в пищеварении, клеточной дифференцировке и реакциях иммунного ответа.
В настоящее время большой интерес вызывают трипсины, выделенные из психрофильных организмов. Наиболее изучены психрофильные трипсины рыб. Работы по изучению психрофильных трипсинов беспозвоночных малочисленны и содержат сведения либо о физико-химических и энзимологических свойствах, либо о первичной структуре. Для полного понимания эффективности действия психрофильных трипсинов необходимо комплексное изучение структуры и свойств трипсинов беспозвоночных, обитающих при низких температурах. Камчатский краб в этом смысле является подходящим объектом исследования. Данные таких исследований позволяют более полно понять разнообразие биологических функций трипсинов, а также могут быть использованы для создания биокатализаторов с заданными свойствами.
Трипсин, как и некоторые другие сериновые протеиназы, успешно экспрессируется в культуре клеток млекопитающих, Escherichia coli, дрожжах Pichiapastoris. Несмотря на это, производство трипсина этими системами в силу ряда причин не получило широкого распространения, и в настоящее время большая часть фермента вырабатывается из панкреатической железы крупного рогатого скота и свиней. Производство трипсина из гепатопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtschaticus (трипсина PC) является более целесообразным в том смысле, что трипсин, полученный таким образом, не будет загрязнен вирусами, прионами и другими инфекционными агентами, свойственными млекопитающим, а также будут частично утилизированы отходы краболовства.
Цель и задачи исследования
Настоящая работа посвящена изучению свойств и первичной структуры трипсина камчатского краба. Для выполнения работы были поставлены следующие задачи:
Разработка эффективного метода получения фермента в гомогенном состоянии в количествах, достаточных для проведения научных исследований.
Подтверждение чистоты полученного препарата.
Изучение физико-химических и энзиматических свойств трипсина.
Установление первичной структуры трипсина.
Сравнение первичной структуры трипсина PC с первичными структурами психрофильных и мезофильных трипсинов.
Определение филогенетической связи между трипсинами, выделенными из организмов, принадлежащих к различным таксономическим группам.
Научная новизна и практическая значимость работы
Трипсин PC выделен из камчатского краба, морского беспозвоночного, приспособленного к обитанию при температуре воды близкой к замерзанию. Актуальность изучения трипсина из такого источника обусловлена тем, что молекулярная организация ферментов психрофильных организмов позволяет им проявлять ферментативную активность, несмотря на замедление метаболических реакций при низких температурах.
По структурно-функциональным особенностям трипсин PC отличается от трипсинов млекопитающих и относится к группе психрофильных ферментов. Результаты, полученные в настоящей работе, вносят вклад в структурно-функциональные исследования трипсинов, выделенных из организмов, принадлежащих к разным таксономическим группам, и могут быть использованы для создания биокатализаторов с заданными свойствами.
Трипсин камчатского краба является одним из важнейших компонентов мазей, применяемых для лечения ожогов, рубцов, пролежней. Мазь "Морикрол," созданная на основе суммарного препарата протеиназ камчатского краба, включая трипсин PC, прошла успешные испытания в различных клиниках Москвы.
Публикация и апробация работы По теме диссертации опубликованы 3 статьи. Результаты диссертации были представлены на V международном симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва 2002), III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург 2002), Международной конференции по природным соединениям (Алматы, Казахстан, 2003), VI международном симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва 2007).
Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 156 страницах и содержит 23 рисунка и 22 таблицы.
