Содержание к диссертации
Введение
1 Физико-географическая и эколого- ценотическая характеристика среды обитания исследуемых растений 16
1.1. Географические факторы 16
1.2. Климатические факторы 19
1.3. Эдафические факторы 22
1.4. Ценотические факторы 25
2. Материал и методы исследований 33
2.1. Определение запаса фитомассы (урожайности) изучаемых растений 36
2.2. Извлечение и идентификция биологически активных веществ в исследуемом растительном сырье 47
2.3. Изучение фенологии растений papaver usae n.busch и p. Oreophilum rupr 68
2.3.1. Динамика накопления видами мака индивидуальных алкалоидов по фазам вегетации 77
2.3.2. Исследование анатомических структур papaver lisae n. Busch и p. Oreophilum rupr 78
2.5. Методы определения биологической активности выделенных соединений из растений, а также их суммарных препаратов 87
2.5.1. Изучение противовоспалительной и антигиалуронидазной активности оридина гидрохлорида 87
2.5.2. Методы исследования гиполипидемической и аналептической активности суммы тритерпенових соединений onobrychis tanaitica sperng 89
2.5.3. Методы исследования производных алкалоида глауцина, полученного из травы растений glaucium flavum crantz: и отходов производства препарата«глауцин гидрохлорид» 90
2.5.4. Экспериментальные методы исследования нативного порошка и шрота растений rhodiola rosea l 91
2.5.5. Методы определения антиоксидантной активности 92
3. Биоценотическая оценка ресурсов исследуемых растений северного кавказа 96
3.1. Дикорастущие виды 96
3.2. Интродуцированные виды 108
4. Биологически активные вещества исследуемых видов растений 115
5. Влияние экологических факторов на урожайность, динамику фитомассы и число побегов изучаемых растений 150
5.1. Статистическая обработка полученных результатов исследования 150
5.3. Результаты изучениярастений onobrychis tanaitica spreng. 156
5.4. Результаты изучения урожайности galium articulatum lam. 158
6. Особенности накопления биологически активных веществ растениями в различных экологических условиях 161
6.1. Динамика накопления биологически активных веществ у agrimonia eupatoria l. В зависимости от условий произрастания 161
6.2. Результаты исследования биологически активных веществ onobrychis tanaitica spreng 166
6.3. Содержание биологически активных веществ и их динамика у galium articulatum lam 171
6.4. Результаты изучения биологически активных веществ papaver lisae. N. Busch 175
6.5. Фитохимические исследования papaver oreophilum rupr 181 vi. 6. Утилизация отходов производства глауцина, получение его полусинтетических продуктов из растений glaucium flavum crantz. 185
6.6.1. Получение новых полусинтетических продуктов из глауцина-основания 193
6.7. Результаты ресурсных и фотохимических исследований sophora japonica l 195
6.8. Фитохимические исследования подземных органов rhodiola rosea l и её шрота 205
7. Биологические свойства соединений, суммарных препаратов дикорастущих растений и интродуцентов северного кавказа 211
7.1. Биологические свойства алкалоида оридина, выделенного из корневищ и травы papaver lisae n. Busch 211
7.2. Результаты исследований производных алкалоида глауцина, полученного из отходов фармацевтического производства 217
7.3. Биологически активные соединения плодов sophora japonica l стандартизация сырья 221
7.4. Фармакологические свойства rhodila rosea l. И ее шрота, получение из них новых лечебных и лечебно-профилактических средств 225
7.5. Биологические свойства тритерпеновых соединений травы растения onobrychis tanaitica spreng 227
7.6. Острая токсичность agrimoniaeupatoria l и galium articulatum lam 228
7.7. Антиоксидантная и диуретическая активность водных экстрактов из растений agrimonia eupatoria l. И galium articulatum lam 229
7.8. Диуретические свойства корневищ подмаренника членистого и травы репейничка аптечного 231
Заключение 232
Выводы 246
- Климатические факторы
- Извлечение и идентификция биологически активных веществ в исследуемом растительном сырье
- Методы определения биологической активности выделенных соединений из растений, а также их суммарных препаратов
- Результаты исследования биологически активных веществ onobrychis tanaitica spreng
Введение к работе
Северный Кавказ - один из богатейших во флористическом отношении регионов Российской Федерации, насчитывающий около 4000 видов дикорастущих растений (Галушко ЛИ., 1978-1980). На этой территории произрастает свыше 200 видов растений, нашедших свое применение в научной медицине, и более 1000 - в народной. Большая часть (около 3000) дикорастущих растений региона не изучена, либо слабо изучена биологически, химически и фармакологически, что не позволяет пополнить арсенал лекарственных растительных средств новыми препаратами и биологически активными добавками (нутрицевтиками) как для человека, так и для сельскохозяйственных животных.
Биологически активные вещества в растениях находятся в определенных состояниях и количествах в зависимости от экологических факторов; поэтому изучение зависимости закономерностей накопления этих веществ от условий произрастания, как в природе, так и в культуре является весьма актуальной задачей.
Разнообразие географических зон, особенности эдафических и климатических условий произрастания сказываются на обменных процессах, биосинтезе и накоплении таких веществ, как флавоноиды, танины, сапонины, алкалоиды и др., что, в конечном счете, определяет лекарственные свойства растений.
В настоящее время в научной литературе крайне ограничены сведения о химическом составе биологически активных веществ изучаемых нами растений, нет данных об этих веществах в дикорастущих маках -эндемиках Северного Кавказа. Полностью отсутствует информация о динамике накопления основных биологически активных веществ в растениях в зависимости от эколого-ценотических условий их произрастания. Недостаточно с точки зрения фитохимии изучен эспарцет донской, широко представленный во флоре Северного Кавказа. Отсутствуют также данные по интродукции таких эндемиков Кавказа как Papaver oreophilum Rupr. и P. fisae N. Busch., их морфолого-анатомической характеристик!.
Сведения по фармакологии выделенных из исследуемых растений биологически активных веществ (флавоноидам, алкалоидам, танинам и сапонинам) также нуждаются в уточнении.
Отсутствуют подтверждения безвредности и обоснование целесообразности применения изучаемых растений в качестве БАД и лекарственного сырья для человека и животных. Не разработаны конкретные рекомендации по их использованию.
Выбор исследуемых нами* объектов (репейничек аптечный, подмаренник членистый, эспарцет донской, мак Лизы и мак горный) обусловлен малоизученностью этих растений, их эколого-ценотической приуроченности, данными народной медицины и их незначительным использованием в настоящее время (Носаль М.А., Носаль И.М., 1960; Попов А.П., 1969; Чхве Тхэсоп, 1987; Петков В., 1988; Махлаюк В.П., 1993 и др.).
При обработке литературных данных по эколого-ценотической приуроченности растений, было установлено, что интересующие нас дикорастущие растения флоры Северного Кавказа могут служить предметом: исследования как в фитоценотическом плане, так и в ресурсоведческом..
Одно из современных направлений в биологии — ресурсоведческие исследования по выявлению влияния экологических факторов на урожайность растений в природных сообществах и содержание в них биологически активных веществ.
Значение этих работ велико, поскольку они позволяют выявить оптимальные районы для заготовки качественного сырья, наметить мероприятия по повышению урожайности более ценных растений в лесных хозяйствах и на приписных территориях, а также дать экологическую характеристику видов и уточнить параметры их фитоцено-тических и экологических оптимумов.
Данное направление находится на начальном этапе своего развития и является малоизученной областью научных исследований.
Результаты экологических и фитоценотических исследований растений Северного Кавказа, а также изучение их химических и биологических свойств, позволят выйти на новые рубежи по рациональному использованию растений данного региона.
Все вышеперечисленное определило характер выбора тематики данной диссертационной работы.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является исследование ресурсов дикорастущих и культивируемых растений на Северном Кавказе; определение влияния экологических факторов на урожайность растений в природных сообществах, выявление возможностей их интродукции; определение содержания в исследуемых объектах биологически активных веществ и получение из них лечебных или лечебно-профилактических средств применяемых в медицине и ветеринарии; использование вторичного сырья растительного происхождения в качестве источника производства препаратов, биологически активных добавок (БАД) к пище и ветеринарных препаратов.
Для достижения намеченной цели были поставлены и решены следующие задачи:
1) определить ареалы и осуществить их картирование для дикорастущих видов: Papaver lisae N.Busch, P. oreophilum Rupr., Agri-monia eupatoha !_., Onobrychis tanaitica Spreng., Galium articulatum Lam., а также on редел еить наиболее благоприятные регионы для культивирования Glaucium fiavum Crantz., Sophora japonica L, и Rhodiola rosea L как перспективных интродуцентов на Северном Кавказе; выявить условия произрастания исследуемых растений на конкретных участках (учетных площадках) территорий Ставропольского и Краснодарского краев, Кабардино-Балкарии, Северной Осетии (республики Алания), определить состав их растительного покрова, урожайность; выделить из исследуемых растений, произрастающих в различных эколого-ценотических условиях, основные биологически активные вещества и определить влияние экологических особенностей произрастания на динамику их химического состава;
4) изучить возможности интродукции эндемиков флоры Северного Кавказа Papaver oreophilum Rupr. и Papaver lisae N. Busch и выявить возможность использования интродуцентов для получения биологически активных веществ;
5) установить морфолого-анатомические признаки растений (обоих видов мака), позволяющие диагностировать последние, с целью разработки соответствующего стандарта на растительное сырье;
Установить (на животных) фармакологическую активность выделенных из растений биологически активных веществ (алкалоидов, флавоноидов, сапонинов), суммарных препаратов; определить их острую токсичность; разработать стандарты на БАД к пище с использованием нативного сырья лекарственных растений флоры Северного Кавказа, (чайные и фруктовые напитки, последние — на базе виноградного и яблочного соков с добавлением экстрактов растений Кавказской флоры).
Исследования проводились с 1976 по 2003 гг, на территории Северного Кавказа, в том числе на базе ботанического сада и кафедры фармации Пятигорской государственной фармацевтической ф, академии, в лабораториях кафедры общей биологии и ботаники
Ставропольского государственного университета, кафедры ботаники Воронежского государственного аграрного университета, Северо-Осетинского государственного университета (г. Владикавказ), в лаборатории систематики и анатомии растений научно- ' исследовательского института ботаники АН республики Армения (г.
Ереван), на базе лаборатории природных соединений и противовоспалительных средств института тонкой органической химии им. А.Л. Мнджояна АН Республики Армения (г. Ереван), центральной лаборатории Чимкентского химико-фармацевтического завода (г; Чимкент, Республика Казахстан), лаборатории изохинолиновых структур НИИ физической и органической химии Ростовского государственного университета (г. Ростов-на-Дону).
Научная новизна исследования. Выявлена урожайность и установлена эколого-ценотическая приуроченность исследуемых дикорастущих растений Северного Кавказа - Agrimonia eupatoha L, tt> Onobrychis tanaitica Spreng., Galium articulatum Lam., Papaver ore- ophifum Rupr., Papaver lisae N. Busch. Осуществлено их картирование, установлено влияние условий произрастания на продуктивность исследуемых растений. Осуществлена интродукция эндемиков Большого Кавказа Papaver oreophilum Rupr. и Papaver //- ф; sae N. Busch в условиях ботанического сада г. Пятигорска, эти материалы были использованы при написании Красной книги РСФСР (1988). Определена урожайность и алкалоидоносность интродуцированных видов растений.
Впервые проведены химические исследования надземных и подземных частей Papaver oreophilum Rupr. и P. fisae N. Busch, a л также установлена динамика накопления ими биологически активных веществ в зависимости от экологических факторов.
Установлена на животных биологическая активность алкалоида оридина, выделенного из травы и корневищ растений Papaver fisae N. Busch, суммы тритерпеновых сапонинов травы растений Onobrychis tanaitica Spreng. и суммарных препаратов из Agrimonia eupatoria L и Galium articulatum Lam., антиоксидантная активность водных экстрактов Agrimonia eupatoria L. и Galium articulatum Lam.; установлено диуретическое действие экстрактов обоих видов.
Изучено распространение интродуцента Sophora japonica L на территории Каневского лесхоза Краснодарского края, определены площади участков, как чистой культуры, так и смешанных посадок, в том числе в полезащитных лесонасаждениях. Определены урожайность и химический состав плодов этого растения, собранных в Краснодарском и Ставропольском краях, а также в Крыму. Установлены основные нормативные (биологические) показатели для растительного сырья.
В результате изучения макро- и микроэлементного состава нативного сырья и шрота родиолы розовой разработаны БАДы к пище на основе продуктов сырья растительного происхождения; установлена биологическая активность корневищ растения, его шрота и комплексного препарата «Мелирод».
Впервые опытным путем на лабораторных животных доказана безвредность, токсичность, препарата МЕЛИРОД, водных экстрактов травы Agrimonia eupatoria L, и корневищ Galium articulatum Lam., установлены антиоксидантные свойства этих растений. Отработана методика утилизации отходов фармацевтического производства, с целью использования шрота травы растений Glaucium flavum Crantz.- и получение дополнительно изохинолинового алкалоида глауцина.
Проведены фармакологические исследования модификаций субстанции глауцина {полусинтетических продуктов), выделенной из отходов производства препарата из Glaucium flavum Crantz.
Определена на животных острая токсичность водных извлечений Agrimonia eupatoria L.t Galium articulatum Lam., что позволило отнести полученные извлечения к относительно безвредным и рекомендовать использовать их в медицине и ветеринарной практике; впервые установлена выраженная атиоксидантная активность и диуретическое действие исследуемых растительных объектов.
Предложена рецептура (с использованием лекарственных растений Северного Кавказа: Agrimonia eupatoria L, Galium articulatum Lam. и др.), разработаны стандарты на биологически активные добавки (БАД) к пище в виде соков, растительных сборов, а также лечебно-профилактических чайных налитков.
Приоритетность выполненных исследований подтверждена следующими авторскими свидетельствами и патентами: авторское свидетельство № 931187 от 27 февраля 1980 г. «Способ получения оридина»; авторское свидетельство № 1410323 от 12 января 1987 г. «Способ получения суммы тритерпеновых сапонинов, обладающих гиполипидемической и аналептической активностью»; патент на изобретение № 1754048 от 22 апреля 1993 г. на лечебно-профилактический напиток «Крепыш».
Практическая ценность диссертационной работы:: в результате проведенных исследований выявлены оптимальные районы для заготовки качественного растительного сырья. Это позволило наметить мероприятия по повышению урожайности ценных растений в лесных хозяйствах и на приписных территориях, а также дать экологическую характеристику видов, за счет выявления их фитоценотических и экологических оптимумов.
Рекомендовано Бештаугорскому лесхозу (Ставропольский край) производить посадку Sophora japonica L. на территории края не только в виде парковой культуры, но и в чистых, смешанных посадках, а также в лесозащитных насаждениях.
Составлены карты-схемы ареалов изучаемых растений Северного Кавказа, и даны рекомендации заготовительным организациям для проведения возможных промышленных заготовок.
На основании результатов проведенных исследований внедрено: технические условия на лечебно-профилактический чайный напиток «Здоровье»; технические условия на биологически активную добавку к пище (БАД) «Мелирод»; технические условия на биологически активную добавку к пище «Чай из плодов софоры японской».
Результаты исследований эколого-ценотической приуроченности изученных видов растений Северного Кавказа и полученных из них биологически активных соединений используются в качестве учебно-методического материала студентами, интернами, слушателями факультета последипломного образования, а также аспирантами биологических факультетов и фармацевтических ВУЗов Юга России.
Положения, выносимые на защиту: современные ареалы и урожайность некоторых дикорастущих видов растений Северного Кавказа (репейничка аптечного,подмаренника членистого, эспарцета донского, маков Лизы и горного); зависимость химического состава и урожайности растений от условий произрастания; урожайность и химический состав интродуцентов (софоры японской, мачка желтого и родиолы розовой); - биологическая активность, выделенных из растительного сырья индивидуальных соединений и суммарных препаратов и сборов; безвредность, токсичность полученных соединений; - возможность применения нативного сырья растительного происхождения, а также его шрота с целью получения новых отечественных БАДов к пище, лекарственных препаратов и использования их в ветеринарии.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывалисьна ежегодных, региональных научных конференциях Пятигорской государственной фармацевтической академии (1990-2003 г.); на И, III, V, Vll.VIII, IX и X Российских научных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 1995-2003 г.); на 1-й и 3-й республиканских конференциях по медицинской ботанике (Киев, 1984, 1991 г.); на 7-м Всесоюзном, совещании по вопросам изучения и освоения флоры высокогорий (Новосибирск, 1977); на симпозиуме по хроматографическим методам в фармации (Тбилиси, 1977); на 2-м и 3-м съездах фармацевтов Армении (Ереван, 1979, 1985 г.); на 3-м Всесоюзном съезде фармацевтов (Кишинев, 1980); на 4-м симпозиуме по ресурсам и химической оценке эфиромасличных растений и маслам (Симферополь, 1985); на Республиканской научно-практической конференции по фармации (Ялта, 1989); на Республиканской конференции по актуальным вопросам фармацевтической науки и практики (Курск, 1991); на Всероссийской конференции «Резервы совершенствования лекарственного обеспечения населения РСФСР» (Владимир, 1991); на Российской научно-практической конференции, посвященной 75-летию основания Государственного НИИ курортологии (Пятигорск, 1995); на 3-й международной конференции «Циклы природы и общества» (Ставрополь, 1995); на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях» (Воронеж, 2002); на 5-й Международной
4 научно-практической конференции «Экология и жизнь» (Пенза, 2002); на Международной научно-практической конференции «Биоресурсы. Биотехнология. Инновации Юга России» (Пятигорск, 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 51 работа, которые охватывают основное ее содержание, в том числе: ^ 2 монографии, 15 публикаций в центральной и 8 в рецензируемой, рекомендованной ВАКом печати.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 317 страницах машинописного текста, состоит из введения, 7 глав, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы и приложений. Работа иллюстрирована 37 рисунками, 58 таблицами и одной схемой. Библиографический список включает 430 источников, в том числе 116 на иностранных языках.
Климатические факторы
Климат региона формируется за счет поступления достаточного количества солнечной радиации. Влияние на климат оказывает удаленность от океана, наличие высокой стены Кавказских гор, задерживающих перенос холодных, воздушных масс с севера, большое разнообразие рельефа и подстилающей поверхности. В горном поясе (высота 2000 м над у. м.) среднегодовое количество осадков на Главном хребте составляет 610 мм, на Боковом - 520 мм, при подъеме на большую высоту (до 3000 м над у. м. и выше) количество осадков возрастает до 1210 мм. Среднегодовая температура в районе Главного хребта на высоте 2000 м над у. м. составляет плюс 2,9С; на 3000 и - минус 2,2С; причем период устойчивых отрицательных температур на высоте 2000 м над у. м. продолжается с начала ноября до апреля. Самый теплый месяц высокогорья — июль, среднемесячная температура плюс 12,6С; максимальная - плюс 25,5С. Самый холодный -декабрь, среднемесячная - минус 6,7С; минимальная - минус 21,6С. Среднегодовая температура - плюс 2,7С. Сумма осадков за год 859 мм при максимуме в июне (134,4 мм) и минимуме - в марте (25,7 мм). Относительная влажность в среднем за год 75%, максимальная в июле (81%), минимальная в декабре - январе (71%). Первые снегопады начинаются в сентябре-октябре, а последние бывают в июне (Заповедники СССР. Заповедники Кавказа, 1990). Основное количество осадков выпадает на северных склонах и в предгорьях Скалистого хребта, в результате чего в котловинах у подножия южного склона Скалистого хребта создается так называемая дождевая тень. Северные склоны Скалистого хребта получают более 1000 мм осадков в год, тогда как котловины в «дождевой тени» всего 440 мм. В субальпийском поясе зима наступает в сентябре. В межгорных котловинах снег выпадает в октябре. В нижних поясах и в долинах зима мягкая с неустойчивым снежным покровом (Серебряная М.И., 1969). Лето на большей части территории обследованных нами районов умеренно теплое и влажное.
Среднемесячная температура июля и августа изменяется от плюс 7,3С до плюс 20,3С. Абсолютный максимум температуры воздуха плюс 34,4С; минимум - минус 34,0С. Предгорная зона отличается гористым рельефом местности, сильно пересеченной реками и отличается более благоприятными климатическими условиями. Среднегодовое количество осадков составляет 615 мм, снежный покров 14-16 см держится не продолжительное время. Среднегодовая температура плюс 7,6С; температура июля (самого жаркого месяца) плюс 21,1С; средняя температура января (самого холодного месяца) минус 4,3С; абсолютный минимум минус 31,0С. Равнинные территории Ставропольского края получают 120-125 ккал/см2 суммарной радиации в год, что в свою очередь определяет длительный вегетационный период растений. На большей части края он продолжается 180-185 дней, на Ставропольской возвышенности до 160 дней, в горных долинах до 120 дней. В горной части условия поступления солнечной радиации зависят от абсолютной высоты места, крутизны и ориентации склонов. На большей территории лето жаркое и сухое. Самый теплый месяц - июль, его средние температуры воздуха на равнинах плюс 25С, на возвышенностях и в предгорьях - плюс 20...22С (Савельева В.В. и др., 1987). Максимальные температуры воздуха в равнинных восточных районах плюс 45С, на Ставропольской возвышенности - плюс 37С, в среднегорьях - плюс 35С. Осадки летом в крае кратковременные, в восточной части их выпадает 170-180 мм, на Ставропольской возвышенности 300 мм, в горах 500-1000 мм и более. Самый холодный месяц — январь - температура воздуха в горах минус 10С, на Ставропольской возвышенности минус 4,5С; на равнинах минус 4,0С. Минимальные температуры на равнинах и в горах минус 32...37С. Азово-Кубанская наклонная равнина относится к степной зоне, подзоне разнотравно-злаковых степей. Климат складывается под. влиянием бассейна Азовского моря с одной стороны, и засушливой Щ степи с другой, и характеризуется как умеренно-континентальный с недостаточным увлажнением. Среднегодовая температура составляет плюс 10,0С; самым холодным месяцем является январь (минус 3,5С), самым теплым июль (плюс 23,3С). Амплитуда колебания температур на протяжении года не превышает 27С. Максимальные температуры в августе достигают плюс 40,1С; а минимальные в январе минус 29,6С. Относительная влажность воздуха колеблется от 62% в июле-августе до 87%, в декабре и в среднем составляет 73%. Засушливые периоды наблюдаются часто.
Средняя суммарная годовая продолжительность засушливого периода 137 дней. Повторение засушливых периодов наибольшее в августе и сентябре (1,2), наименьшее в июле (0,8), однако засушливые периоды в июле повторяются почти ежегодно. В зимний период часто наблюдаются оттепели, дней с оттепелями в среднем бывает 50-60, из них около 10 дней со л средними суточными температурами выше плюс 5С. Продолжительность вегетационного периода составляет 225-230 дней. Начинается он в конце марта - начале апреля и продолжается до второй декады ноября. Среднегодовое количество осадков составляет 577 мм. На вегетационный период приходится 62% общегодового количества осадков, из них максимум на июнь. Наименьшее количество осадков выпадает в сентябре-октябре (Проект организации и развития хозяйства Каневского мехлесхоза Комитета природных ресурсов по Краснодарскому краю Министерства природных ресурсов РФ: Таксационное описание. Воронеж, 2002, Т. 3). I. 3. Эдафические факторы Эдафический фактор определяет экологические условия, от которых зависит развитие растений и их распределение. 0 Территория Предкавказья представлена разнообразными ландшафтными зонами, втом числе четырьмя почвенными зонами: - полупустынная степь со светлокаштановыми почвами (18%); - сухая степь с темно-каштановыми и каштановыми почвами (36%); - умеренно засушливая степь с черноземами карбонатными (южными и обыкновенными) (40%); достаточно увлажненная степь с черноземами слабовыщелоченными, выщелоченными и темно-серыми лесными почвами (40%). Основной тип почв субальпийского пояса - горно-луговой, имеющий небольшую мощность, высокое содержание гумуса в верхних слоях, значительную кислотность и влажность. Эти. почвы формируются под луговой растительностью; по верхней границе леса формируются торфянисто-подзолистые почвы. Под остепненными лугами лесного пояса формируются горные лугово-степные почвы, в аридных котловинах развиты горностепные почвы (Серебряная М.И., 1969).
Извлечение и идентификция биологически активных веществ в исследуемом растительном сырье
Выделение алкалоидов из Papaver oreophilum Rupr. Методом метанольной экстракции из надземной части мака горного получено извлечение, которое сгущали под вакуумом при температуре плюс 35С до смолообразного состояния. Алкалоиды извлекали 10% раствором серной кислоты, кислое извлечение промывали несколько раз диэтиловым эфиром. Нерастворившуюся смолу растворяли в промывном эфире, затем эфирный раствор обрабатывали 10% раствором серной кислоты и сернокислое извлечение объединяли с кислым извлечением, полученным ранее. Объединенное кислое извлечение обрабатывали 25% раствором аммиака до рН 7-8, водно-щелочной раствор многократно обрабатывали хлороформом до полного истощения раствора (реакция на алкалоиды с реактивом Драгендорфа и 1 % раствором кремне-вольфрамовой кислоты - отрицательная). Полученную после сгущения хлороформного экстракта и высушивания остатка, сумму алкалоидов подвергали дальнейшей обработке, применяя метод разделения на фенольные и нефенольные алкалоиды, а также используя растворимость их гидрохлоридов в хлороформе. Хлороформную сумму алкалоидов растворяли в 3% растворе хлористоводородной кислоты, кислую сумму алкалоидов промывали несколько раз хлороформом. Часть алкалоидов, гидрохлориды которых растворимы в хлороформе, перешли в хлороформный раствор в виде, солей, часть осталась в кислом растворе. Из двух полученных растворов извлекали алкалоиды фенольного и нефенольного характера по методике И-Славика (Slavik J. et al., 1963). Таким образом, из хлороформной суммы алкалоидов мака горного было получено шесть фракций, которые мы обозначили АДі (эфирное извлечение), АДі (хлороформное извлечение), АДг (хлороформное извлечение), ACt (эфирное извлечение), АСі (хлороформное извлечение) и АС2 (хлороформное извлечение), где АД- фракции сумм алкалоидов, гидрохлориды которых нерастворимы в хлороформе, АС — гидрохлориды которых растворимы в хлороформе, цифры 1 и 2 обозначают извлечения нефенольного и фенольного характера соответственно. При хроматографировании фракций АДІ - хлороформное извлечение и АДг - хлороформное извлечение в тонком слое окиси алюминия в обеих фракциях было установлено наличие четырех пятен, аналогичных по величине Rf алкалоидов. Это позволило нам объединить указанные фракции и продолжить разделение на хроматографической колонке с окисью алюминия.
Разделение вели смесью хлороформ-метанол в соотношении 99:1, 98:2, 97:3, 25:1,4:1, 1:1. Из хлороформ-метанольного элюата (97:3) выделили алкалоиды протопин и а-аллокриптопин. При элюировании смесью другого соотношения составляющих (25:1) выделили алкалоид мекамбридин. Фракцию АДі (эфирное извлечение) обрабатывали смесью ацетон-эфир (1:1) и выделили; алкалоид армепавин. Маточник фракции АДі (эфирное извлечение) объединили с маточниками АЦ и АД2 (хлороформные извлечения), а затем хроматографировали на колонке с силикагелем марки КСК. Разделение вели смесью бензол-метанол в соотношениях 99:1, 98:2, 97:3, 25:1, 9:1 і 1:1 (система 1). При элюировании смесью 97:3 выделии алкалоиды протопин и а-аллокриптопин, а при элюировании смесью 9:1 выделили мекамбридин. Фракцию АСт (эфирное извлечение) обрабатывали спиртовым раствором щавелевой кислоты, в результате чего получили оксалат армепавина. Маточник хроматографировали на колонке с окисью алюминия. Разделение вели смесью хлоророформ-метанол в соотношениях: 99:1, 98:2, 97:3, 25:1, 4:1, 1:1 (система 2). При элюировании смесью 25:1 выделили алкалоид наркотин, при элюировании смесью 1:1 изолировали оридин. Из объединенных фракций АСі и АС2 (хлороформные извлечения) дробной кристаллизацией из ацетона выделили протопин и оридин. При дальнейшей обработке маточника спиртовым раствором хлористоводородной кислоты с последующим извлечением эфиром изолировали фугапавин. Маточники фракций АСІ (эфирное извлечение), АСІ И АС2 (хлороформные извлечения) объединили и хроматографировали, используя метод колоночной хроматографии с силикагелем марки КСК. В качестве системы для элюирования была использована смесь бензол-метанол (система 1) в соотношениях 99:1, 98:2, 97:3, 25:1, 1:1. При элюировании смесью 97:3 были выделены протопин и а-аллокриптопин, при элюировании смесью 1:1 изолировали армепавин. Выделение алкалоидов из Papaver lisae N.Busch. Исходным сырьем для получения суммы алкалоидов служили; надземные и подземные части органов мака Лизы. Метод выделения из м. Лизы аналогичен методу выделения из м. горного. В результате были получены АДІ - эфирное, АД2 - хлороформное, АДГ — хлороформное, АСч - эфирное, ACt - хлороформное, АС2 -хлороформное извлечения. Объединяя фракции АДі - эфирное и АДі - хлороформное извлечения, мы разделяли алкалоиды, используя метод колоночной хроматографии на силикагеле марки КСК. Системой для элюирования была выбрана смесь бензол-метанол (система 1) в соотношениях 99:1, 98:2, 97:3, 25:1, 9:1, 1:1. Из смеси бензол-метанол (97:3) выделены протопин и мекамбридин. Элюируя смесью бензол-метанол (9:1), выделили оридин. Хлороформную фракцию АД2 также хроматографировали на колонке с силикагелем, элюировали смесью бензол-метанол (система 1). Из элюата (9:1) изолировали оридин и N-метилоридин. Хлороформную фракцию ACt обрабатывали ацетоном, при этом кристаллизовался мекамбридин. Маточник объединили с эфирной фракцией АС и хроматографировали на колонке с окисью алюминия. В качестве элюатов использовали смесь хлороформ-метанол (система 2) в соотношениях 99:1, 98:2, 97:3, 25:1, 4:1, 1:1. Смесью хлороформ-метанол (25:1) изолировали макранталин и мекамбридин. Маточник хроматографировали на колонке с силикагелем. Для элюирования выбрана смесь бензол-метанол в соотношениях 99:1, 98:2, 97:3, 25:1, 9:1, 1:1. Из смеси бензол-метанол (98:2) изолировали изокоридин, бензол-метанол (97:3) - протопин и макранталин; из элюата 25:1 — мекамбридин. При обработке хлороформной фракции АС2 ацетоном изолировали оридин. Метод выделения хлороформной суммы алкалоидов из корневищ мака Лизы аналогичен выделению алкалоидов из надземной части.
Полученную сумму алкалоидов обрабатывали ацетоном, и многократной кристаллизацией был изолирован оридин. Алкалоиды из маточника выделяли, используя колоночную хроматографию на силикагеле марки КСК. Элюирование проводили смесью бензол-мета нол (система 1) в соотношениях 99:1, 98:2, 97:3, 25:1, 9:1, 1:1. Из смеси 98:2 изолировали алкалоид изокоридин. Элюируя смесью 97:3, получили макранталин, смесью 25:1 -мекамбридин, смесью 9:1 - N-метилоридин и оридин (Sariyar G. et al.t 1977; Sariyar G, 1980; Phillipson I.D. et al., 1981). Идентификация алкалоидов в растительном сырье. 1; В результате реакции взаимодействия алкалоидного извлечения с реактивом Майера (раствор дихлорида ртути и йодида калия) образовывался желтоватый осадок. 2. С реактивами Вагнера и Бушарда (растворы йода и йодида калия) извлечение из алкалоидного растительного сырья образовывало бурые осадки. 3. Реактив Драгендорфа с извлечением образовывал оранжево-красные или кирпично-красные осадки. 4. Реактив Марме с алкалоидами давал белые осадки. 5. Пикриновая кислота в кислых извлечениях алкалоидов образовывала желтоватые аморфные осадки. Хроматографическая идентификация алкалоидов. 0,1 мл извлечения алкалоидов-оснований, выделенных из растительного сырья, наносили на линию старта капилляром на стеклянную пластинку с закрепленным слоем силикагеля марки КСК, а рядом эталонные образцы («свидетели») алкалоидов. После высушивания пластину помещали в хроматографическую камеру с разделительной системой растворителей: хлороформ-ацетон-диэтиламин (5:4:1). Время экспозиции 30-40 мин, затем хроматограмму подсушивали и проявляли реактивом Драгендорфа. На желтом фоне появлялись оранжевые пятна, что указывало на присутствие алкалоидов. Количественное определение алкалоидов в растительном сырье. При исследовании растений рода PapaverL. нами использовались три основных метода количественного определения алкалоидов: гравиметрический, титрометрический и хроматоспектрофото-метрический. Гравиметрический метод определения алкалоидов. Описан в разделах «выделение алкалоидов из мака горного и. мака Лизы». После получения сырой суммы алкалоидов последние определяли методом (весовым), основанным на различной адсорбционной способности или растворимости алкалоидов. Титрометрический метод определения алкалоидов
Методы определения биологической активности выделенных соединений из растений, а также их суммарных препаратов
Выделенный нами из надземной и подземной частей мака Лизы, в качестве главного (мажорного) алкалоида оридин (ореолин) представляет собой изохинолиновое основание тетрагидропроапорфинового ряда. Выделение основания оридина из суммы алкалоидов проводили ацетоном в соотношении к сумме 1:10. При этом оридин-основание выпадал в виде призматических кристаллов белого цвета. Растворив оридин-основание в минимальном количестве этилового спирта и прибавив по каплям спиртовый: раствор хлористоводородной кислоты до рН 6,0; получили соль оридина гидрохлорида. Ф Противовоспалительные свойства оридина гидрохлорида изучались в лаборатории противовоспалительных средств института тонкой органической химии АН Республики Армения на моделях острого экссудативного воспаления, вызванного введением в подошву лапки крысы 0,1 мл флорогенного раздражителя — 1% # карагенина, 10% каолина или введением в плевральную полость 0,6% азотнокислого серебра. Динамику воспалительных реакций изучали на гисто препаратах, полученных и обработанных по общепринятой методике (фиксация 8% нейтральным формалином), проводки и окраска гематоксилин-эозином. Опыты были поставлены на белых беспородных крысах-самцах 100-150 г. Исследуемый алкалоид вводили внутрь в дозах 5, 25, 50 мг/кг. В связи с тем, что существенную роль в воспалительном процессе играет фермент гиалуронидаза, нами была изучена также, антигиалуронидазная активность оридина гидрохлорида. Одновременно изучалась антигиалуронидазная активность in vitro и жаропонижающие свойства оридина гидрохлорида при дрожжевой лихорадке у крыс. Гиалуроновую кислоту выделяли из пупочных канатиков новорожденных животных. К 0,2 мл фермента (активность 20 ед./мл) добавляли 0,2 мл раствора алкалоида в разведении М 10 2- М 10"7 и ингибировали 60 мин при плюс 37С. Затем эту смесь инактивировали нагреванием в течение 10 мин при плюс 60С и добавляли 0,2 мл гиалуроновой кислоты. Антигиалуронидазную активность определяли викозиметрически аппаратом ВК-4. Изменение вязкости гиалуроновой кислоты указывало на активацию или ингибицию фермента. Измерение активности фермента рассчитывали в процентах по отношению к вязкости контроля гиалуроновой кислоты без добавления оридина. //. 5, 2. Методы исследования гиполипидемической и аналептической активности суммы тритерпеновых соединений Onobrychis tanaitica Sperng.
Очищенную сумму тритерпеновых соединений, выделенных из травы эспарцета донского высушивали в сушильном шкафу при температуре плюс 50...60С в течение 5 часов. Исследование аналептической активности полученной суммы проводилось на белых крысах при внутрибрюшинном введении в дозе 100 мг/кг. Для оценки аналептического действия была использована методика барбитурового-сна. В качестве снотворного средства использовали «Нембутал» в дозе 35 мг/кг массы животного. Рекомендуемый эталонный препарат «Кофеин-бензонат натрия» вводили в дозе 100 мг/кг. Гиполипидемическую активность суммы тритерпеновых соединений травы эспарцета донского в дозе 200 мг/кг изучали на белых крысах линии Вистар, у которых экспериментальная гиперлипидемия вызывалась внутрибрюшинным введением тринона WR-1339. Для сравнения гиполипидемического действия суммы тритерпеновых. соединений группе животных в тех же условиях вводился применяемый для лечения атеросклероза препарат «Полиспонин». У всех животных исследовалась сыворотка крови на содержание холестерина по методу Брегдана и триглицеридов по методу Nerip и Erings С. Введение животным суммы тритерпеновых соединений травы эспарцета донского приводило к значительному торможению развития гиперлипидемии. II. 5. 3. Методы исследования производных алкалоида глауцина, полученного из травы растений Gfaucium flavum Crantz: и отходов производства препарата«глауцин гидрохлорид» Выделенный и очищенный из отходов производства глауцин-основание, равно как и сама субстанция глауцина гидрохлорида, полученная из травы мачка желтого были использованы для получения новых полусинтетических веществ. В результате проведенного полусинтеза было получено 5 соединений (солей) производных глауцина, три из которых проявили выраженную биологическую активность. С полученными соединениями проводились исследования эффекта влияния их на уровень артериального давления, время свертывания крови, продолжительности нембуталового сна. Опыты проводились на белых крысах массой 200-240 г: Системное артериальное давление регистрировали в течение одного часа в левой сонной артерии у наркотизированных крыс с помощью датчиков артериального давления. Время свертывания крови изучали с помощью коагулографа Н-331, кровь для этой процедуры брали из подъязычной вены у бодрствующих крыс-самцов. Нембуталовый сон вызывали с помощью внутрибрюшинного введения этаминала натрия в дозе 25 мг/кг. В качестве эталонных препаратов исследовали папаверина гидрохлорид (10 мг/кг), апрессин (1мг/кг), гепарин (100 ед./кг), викасол (Юмг/кг), аминазин (5мг/кг), кофеин бензоат натрия (10 мг/кг). Все вновь полученные соединения в дозе 10 мг/кг, а также препараты сравнения вводили внутрибрюшинно в подогретом виде. В дальнейшем было исследовано влияние вновь полученных полусинтетических производных глауцина на устойчивость белых мышей к гипоксии. Опыты были проведены на 48 белых мышах-самцах весом 24-25 г. Всего проведено восемь серий опытов, из них шесть опытных, одна контрольная и одна стандартная. Гипоксическую гипоксию воспроизводили следующим образом:; белую мышь помещали в герметически закрытое пространство и регистрировали продолжительность пребывания в нем до агонального дыхания.
В качестве стандартного препарата использовали официнальный препарат пирацетам в дозе 100 мг/кг массы тела, в контрольной серии опытов вводили 1 мг физиологического раствора. Шесть новых веществ в дозе 100 мг/кг, пирацетам и физиологический раствор вводили внутрибрюшинно в течение трех дней один раз в день. Эксперимент начинали через 90 минут после последней инъекции. //. 5. 4. Экспериментальные методы исследования нашивного порошка и шрота растений Rhodiola rosea L. В качестве субстанции предложены нативные порошки (размеры частиц порошков 0,1 мм) корневищ с корнями родиолы розовой (Rhizoma cum radicibus Rhodiolae roseae), а также их шрота. Исследования проведены на белых крысах линии Vistar массой 200-250 г. Всего проведено 10 серий опытов по 6 животных в каждой. В качестве модели использовался критерий продолжительности бокового положения при внутрибрюшинном введении этаминала натрия в дозе 30 мг/кг массы тела животного. Исследуемые комплексы вводились в растворенном виде в желудок за, 30 минут до начала эксперимента. Статистическая обработка результатов проводилась по Т-критерию Стьюдента. Найденные профилактические дозы исследованных комплексов составили от 1/1000 до 1/100 дозы средних терапевтических доз для отдельных компонентов, предлагаемых для медицинского применения в официальных справочниках. Для подтверждения предыдущего эксперимента провели ряд исследований с пентобарбиталом; В этом случае белым крысам. внутрибрюшинно вводили пентобарбитал в дозе 25 мг/кг; вызывая у животных сон (боковое положение). Биологически активные комплексы вводили через рот за 30 минут до введения пентобарбитала. Одновременно ставилась контрольная серия опытов (вводился физиологический раствор) и опытные серии с введением изучаемого соединения и эталонного, официнального препарата. В каждой серии эксперимент проводился на 6 и более животных. Результаты обрабатывались статистически. В случае, если продолжительность пентобарбитурового сна (боковое положение) в опытной серии достоверно меньше, чем в контрольной, то это свидетельствует об антагонизме воздействия нового соединения и пентобарбитала на функцию центральной нервной системы, т.е. изучаемое вещество обладает тонизирующей (аналептической) активностью. Если боковое положение в опытной серии у крыс достоверно больше, значит; новое вещество усиливает угнетающий эффект пентабарбитала на центральную нервную систему и обладает седативным действием.
Результаты исследования биологически активных веществ onobrychis tanaitica spreng
После определения урожайности травы и количества побегов эспарцета донского нами был выявлен основной состав биологически активных веществ растений, произрастающеих в различных эколого-ценотических условиях. Исходные (средние) данные по содержанию биологически активных веществ и количество побегов эспарцета донского в зависимости от экологических условий, обработаны статистически, а щ результаты представлены в таблицах 20, 21, 22, 23. Из травы растения была выделена сумма флавоноидов (7,3%), дубильных веществ (1,2%), тритерпеновых соединений (1,9%). Флавоноидные соединениядостаточ но хорошо изучены, поэтому эти соединения фитохимически нами подробно не исследовались. ; Тритерпеновые гликозиды были выделены этанольной экстракцией (65% этанолом) по известной схеме выделения тритерпеновых сапонинов. Полученные результаты по содержанию биологически активных веществ в траве Onobrychistanaitica Spreng., произрастающих в различных экологических условиях представлены в таблице 24: Наибольшее количество флавоноидов (5,81 ±0,206% в абс. сухом сырье) было обнаружено у экземпляров растений, произрастающих в Ставропольском крае (район горы Малый Джинал, высота 910 м над у. м., разнотравно-злаково-бобовая ассоциация) и в Кабардино-Балкарии, на террасах реки Баксан, высота 930 м над у. м.: злаково-бобовый луг (5,81 ±0,198%. Наибольшее количество танидов (4,96±0,198% в абс. сухом сырье) обнаружено в надземной части растений Onobrychistanaitica Spreng., произрастающих в Кабардино-Балкарии, на средних террасах реки Баксан (остепненный разнотравно-злаковый луг), 810 м над у. м.; и на злаково-бобовом лугу (там же), высота 930 м над у. м. (4,40±0,150%). Причем наиболее высокой танидностью характеризуются растения, собранные на больших высотах. Наибольшее количество дубильных веществ накапливается в траве образцов Onobrychis tanaitica Spreng., произрастающих в оптимальных для данного вида условиях (в эколого-фитоценотическом оптимуме). Наибольшее количество тритерпеновых сапонинов (4,01±0,147% в абс. сухом сырье) было обнаружено у образцов Onobrychhtanaitica Spreng., произрастающих в Ставропольском крае, в районе горы Малый Джинал (910 м над у. м.): разнотравно-злаковая ассоциация; на высоте 780 м над у. м. в разнотравно-злаково-бобовой ассоциации, количество тритерпеновых сапонинов в растении составило 3,50±0,126%, в Кабардино-Балкарии на верхних террасах реки Баксан, (930 м над у. м.) на злаково-бобовом лугу количество тритерпеновых сапонинов составило 3,12±0,084% в абс. сухом сырье.
Корреляционная зависимость содержания флавоноидов V (%), дубильных веществ d (%) и сапонинов S (%) Onobrychis tanaitica Spreng.от абсолютной высоты Н (102 м над у.м.), представлена на графике (рис. 27). Зависимость количества побегов п от абсолютной высоты Н: п{Н) = -0,026Я2 - 0,0052 # + 2,574. Максимальное значение функций для Onobrychis tanaitica Spreng.: Vmax=5,746 при H=910 м, dmax=4,9102 при Н=910 м, Smax=4,0132 при Н=910 м, где Н это критическая точка (экстремум), которую мы находим из первой производной полученных функций. Таким образом, на высоте 910 м над у. м.у исследованных растений наблюдается максимальное содержание флавоноидов, дубильных веществ и сапонинов. VI. 3. Содержание биологически активных веществ и их динамика у Galium articulatum Lam. После определения урожайности надземной и подземной частей подмаренника членистого нами был выявлен основной состав биологически активных веществ растений, произрастающих в различных эколого-ценотических условиях Согласно литературным данным в траве подмаренника членистого накапливаются в основном флавоноиды и смолистые вещества, в корневищах - антрахиноны (Растительные ..., 1990; Исламова НА, 1965; Ушаков В.Б. и др., 1988). В этой связи нами было проведено определение количественного содержания флавоноидов в траве растения методом спектрофотометрии, а в корневищах - содержание антрахинонов фотоэлектроколориметрическим методом (Борисов М.Н., 1975; 1976). Для построения математической модели в таблице 25 представлены исходные переменные данные Galium articulatum Lam. В результате была получена математическая модель в виде уравнения регрессии, которое полностью подтверждает процесс увеличения флавоноидов, антрахинонов и сапонинов в зависимости от увеличения абсолютной высоты (таблица 26). Установлено, что наибольшее содержание флавоноидов (0,72±0,030% в абс. сухом сырье) в траве подмаренника членистого наблюдается у растений, собранных в разнотравно-злаково-ковыльной ассоциации горы Лысой (Георгиевский район Ставропольского края, 490 м над у. м.) и наибольшее количество антрахинонов (0,44%) обнаружено в корневищах растений собранных на горе Лысой, георгиевского района Ставропольского края (480 м над у.м.; разнотравно-злаковый луг, пологий склон юго-восточной экспозиции и в окрестности ст. Николаевской Дигорского района Ставропольского края (0,43%) - разнотравно-злаковый луг, пологий склон южной экспозиции (500 м над у. м.). На рисунке 28 показана зависимость содержания антрахинонов и веса корневищ растений и от абсолютной высоты. Исследования проводили на 8 пробных площадках, заложенных в различных частях ареала вида. На каждой пробной площадке выкапывали 15-20 цветущих растений, собранные надземные и подземные части высушивали до воздушно-сухого состояния. Сумму флавоноидов определяли спектрофотометрическим методом (Генкина ГЛ., 1972), количественное содержание дубильных веществ определяли титриметрически (ГФ. XI, 1987).
Сумму алкалоидов выделяли методом многократной экстракции 95% этанолом, с последующим извлечением хлороформной суммы оснований (Попов М.П, 1937; Slavik J., 1963). Данные по содержанию основных биологически активных веществ в траве и подземных органах Papaver lisae N. Busch представлены в таблице 28. В результате исследования травы растения было установлено, что наибольшее содержание флавоноидов (0,52%) обнаружено в сырье, собранном в пойме реки Фиагдон на высоте 1500 м над у. м., а также на пологих склонах близ села Верхний Цей на высоте 1700 м. Наибольшее количество танинов (1,40%) накапливается в подземных частях растений Papaver lisae N.. Busch, собранных на горных склонах в пойме реки Фиагдон на высоте 1950 м над у. м. и на высоте 1950 м в окрестностях села Верхний ЗарамагМ ,39%). Сведения о химическом составе мака Лизы в отечественной и зарубежной литературе отсутствуют. Из растений нами были выделены, кроме флавоноидов и дубильных веществ, ряд ценных изохинолиновых алкалоидов: оридин, мекамбридин, N-метилоридин, изокоридин и макранталин. Поскольку главными (в фармакологическом отношении) в растениях являются алкалоиды, нами было проведено изучение динамики их содержания в зависимости от различных эколого-ценотических условий (таблица 29). Полученные результаты обрабатывали статистически методом наименьших квадратов. Значимость коэффициентов проверяли по критерию Стьюдента,. а адекватность уравнения - по критерию Фишера (таблица 36). Зависимость содержания алкалоидов t {%) в корнях Papaver lisae N. Busch от высоты Н (103 м над у.м.) выражается уравнением: t(H) = -1,56//2 + 0,335tf +1,26 Корреляционная зависимость содержания изохинолиновых алкалоидов U (%) Papaver lisae N. Busch от абсолютной высоты Н (103 м над у.м.) представлена на графике (рис.29). Максимальное значение функций для Papaver I isae N. Busch: tmax=1,198 при H=1700 м, kmax=0,2467 при Н=1700 м. Максимальное содержание алкалоидов в траве растений Papaver I isae N. Busch наблюдалось на высотах 1650-1700 м над у. м. в злаково-разнотравных со обществах, на пестро-овеян и циевых, остепненных лугах, а в корневищах - на высотах 1500-1700 м над у. м., на нагорно-ксерофитных остепненных лугах или щебнистых склонах.
