Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 6
1.1 Общая характеристика и важнейшие производственно-ценные свойства молочнокислых бактерий 6
1.2 Распространение и селекция молочнокислых бактерий 16
1.3 Практическое использование молочнокислых бактерий ...28
2. Собственные исследования 43
2.1 Материал и методика исследований 43
2.2 Результаты собственных исследований
2.2.1 Результаты селекции местных штаммов молочнокислых бактерий 49
2.2.2 Идентификация молочнокислых бактерий
2.2.2.1 Морфологические свойства 54
2.2.2.2 Культуральные свойства 56
2.2.2.3 Физиолого-биохимические свойства
2.2.3 Оценка качества исходного молока и кисломолочных продуктов, изготавливаемых с использованием культур местных штаммов лактобактерий 59
2.2.4 Микробиологические показатели образцов молока, сквашеных разными культурами местных штаммов лактобактерий 71
2.2.5 Апробация культур местных штаммов лактобактерий на животных 73
2.2.5.1 Динамика живой массы подопытных животных 74
2.2.5.2 Морфологические и биохимические показатели крови подопытных животных 77
2.2.5.3 Переваримость и использование питательных веществ рациона...80
2.2.6 Экономическая эффективность использования молочнокислых микроорганизмов при выращивании свиней 91
3. Обсуждение результатов исследований 93
Выводы 104
Предложение производству. 103
Список использованной литературы 106
- Распространение и селекция молочнокислых бактерий
- Практическое использование молочнокислых бактерий
- Идентификация молочнокислых бактерий
- Микробиологические показатели образцов молока, сквашеных разными культурами местных штаммов лактобактерий
Введение к работе
Актуальность темы. Полноценное и здоровое питание является одним из наиболее важных и необходимых условий для сохранения жизни и здоровья нации. Издавна считалось, что кисломолочные продукты оздоровляют организм, поэтому различные виды кислого молока широко употреблялись в пищу. Только значительно позже были обоснованы диетические и лечебные свойства этих продуктов.
В последние годы в науке о питании получило развитие новое направление – функциональное питание. Для повышения биологической ценности и лечебно-профилактического действия продуктов все шире применяют молочнокислые пробиотические микроорганизмы. Значительно возрос интерес ученых к использованию пробиотиков и в сельскохозяйственном производстве. Особое значение в этой связи уделяется технологическим и неизвестным ранее физиолого-биохимическим свойствам молочнокислых микроорганизмов.
Селекцию молочнокислых микроорганизмов осуществляют следующими способами: выделение чистых культур молочнокислых бактерий из природных источников; получение производственно-ценных штаммов лактобактерий; получение улучшенных форм лактобактерий адаптацией в целях приспособления к этим условиям (выращивание микроорганизмов при постоянно изменяющихся условиях культивирования). Внешняя среда при этом является мощным фактором эволюции и изменчивости микроорганизмов. Следовательно, выделение из природных источников местных штаммов лактобактерий считается целесообразным.
Поиск и получение производственно-ценных штаммов молочнокислых бактерий, обладающих повышенной биохимической активностью и своеобразным обменом веществ способствует интенсификации производства и выработке новых высококачественных пробиотических препаратов и кисломолочных продуктов функционального питания.
Исходя из этого, исследования, направленные на изучение биоресурсного потенциала микромира окружающей среды и практическое использование новых пробиотических штаммов молочнокислых микроорганизмов в решении проблем агропромышленного комплекса, являются актуальными.
Целью диссертационной работы явилось выделение чистых культур молочнокислых бактерий из различных природных субстратов; установление их видовой принадлежности и биологических особенностей, а также важнейших производственно-ценных свойств и антагонистической активности в отношении представителей патогенной и условно-патогенной микрофлоры; создание на их основе кисломолочных продуктов функционального назначения; определение эффективности выделенных штаммов в кормлении сельскохозяйственных животных и птицы; депонирование наиболее перспективных штаммов во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИ генетика.
В задачи исследований входило:
выделение чистых культур молочнокислых микроорганизмов из различных природных субстратов;
определение биологических особенностей и технологических свойств местных штаммов лактобактерий;
идентификация наиболее перспективных штаммов с последующим депонированием их культур во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИ генетика;
установление антагонистической активности отобранных штаммов по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре;
разработка технологии получения кисломолочных продуктов функционального питания на основе отобранных штаммов;
апробация выделенных и изученных пробиотических штаммов бактерий на молодняке свиней и цыплятах-бройлерах.
Научная новизна работы заключается в том, что впервые, в условиях РСО-Алания выделены и изучены биологические и технологические свойства, идентифицированы и депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИ Генетика производственно-ценные штаммы бактерий Enterococcus durans ВКПМ В-8731 и Lactobacillus casei ВКПМ В-8730. Установлена антагонистическая активность 13 местных штаммов лактобактерий по отношению к 9 представителям патогенной и условно-патогенной микрофлоры. На основе выделенных штаммов молочнокислых бактерий получены новые продукты функционального питания, обладающие диетическими и лечебно-профилактическими свойствами. Научно обоснована и экспериментально доказана целесообразность практического применения полученных пробиотических препаратов в кормлении молодняка животных и птицы. Разработаны эффективные схемы и нормы скармливания молочнокислых бактерий для поросят-отъемышей и цыплят-бройлеров.
Теоретическая и практическая ценность работы. Работа вносит существенный вклад в использование заквасок прямого внесения на основе пробиотических бактерий селекции Горского ГАУ в пищевой промышленности, агропромышленном и биотехнологическом производстве. Научная полезность результатов работы выражается в выделении новых, биологически и технологически активных, штаммов молочнокислых микроорганизмов в экологически чистых районах РСО-Алания, где микроорганизмы не подвержены мутационным изменениям.
Использование разработок позволяет значительно расширить ассортимент функциональных продуктов питания, способствует реализации биоресурсного потенциала молодняка свиней и цыплят-бройлеров, а также повышает экономическую эффективность выращивания молодняка сельскохозяйственных животных и птицы, увеличивая приросты живой массы и снижая падеж от кишечных инфекций.
Материалы исследований могут быть использованы в учебном процессе при подготовке специалистов в высших учебных заведениях биологического и сельскохозяйственного профиля.
Представленная работа является частью плана научно-исследовательских работ ФГБОУ ВПО «Горский государственный аграрный университет» (№ гос. регистрации 01.2.007 08206, 01.2.007 08213) и НИИ биотехнологии Горского ГАУ «Рациональное использование биоресурсов в АПК горной и предгорной зон (№ гос. регистрации 01.2.007 08211).
Апробация и реализация результатов исследований. Основные научные положения диссертации доложены и обсуждены на Международных конференциях (Владикавказ, 2003, 2006-2008, 2010-2013; Великие Луки, 2010; Махачкала, 2010, 2012; Краснодар, 2010; Ставрополь, 2010, 2011; Пенза, 2010; Саратов, 2010, 2012; Владивосток, 2010; Троицк, 2011; Курган, 2011; Беларусь, г.Горки, 2011; Тамбов, 2012; Чебоксары, 2012; Нальчик, 2012; Болгария, г.София, 2011; Польша, г.Пшемысль, 2011; Чехия, г.Прага, 2012; Великобритания, г.Лондон, 2012; США, Флорида, г.Тайтусвилл, 2012); Всероссийских конференциях (Владикавказ, 2010; Саратов, 2010; Астрахань, 2010); региональных и других научно-практических конференциях (Владикавказ, 2003-2005, 2008-2012; Магас, 2009); на Всероссийском совете молодых ученных и специалистов аграрных образовательных и научных учреждений (Москва, 2012), на расширенном заседании кафедры биотехнологии ФГБОУ ВПО «Горский ГАУ» (Владикавказ, 2013).
По итогам 2008 года автор стал действительным членом «Кадрового резерва – Профессиональная команда страны» с вручением рекомендательного письма. Результаты научных исследований по теме диссертационной работы были представлены на выставке достижений молодых ученых и специалистов РСО-Алания (Владикавказ, 2010); на выставке-семинаре Республиканского государственного унитарного предприятия «Инфоцентр» министерства сельского хозяйства РСО-Алания «Оборудование для производства комбикормов и кормовых добавок» (Владикавказ, 2010); на Дискуссионной площадке при поддержке политической партии «Единая Россия» по формированию «Народного бюджета» на секции: Наука. Молодые ученые. Инновации (Владикавказ, 2011).
Материалы диссертационных исследований вошли в конкурсную научную работу «Практические аспекты использования промышленных микроорганизмов в развитии агропромышленного комплекса», которая удостоена Диплома лауреата премии Главы Республики Северная Осетия-Алания в области науки и техники для молодых ученых и специалистов в 2010 году; в конкурсную работу «Выделение и идентификация технологически перспективных штаммов промышленных видов микроорганизмов с последующим депонированием в ВКПМ и практические аспекты их использования в развитии агропромышленного комплекса», представленную на соискание премии Президента Российской Федерации в области науки и инноваций для молодых ученых за 2010 год; представлены в межгосударственном региональном турнире, организованном Международной Академией Науки и Высшего образования (Великобритания) «Открытое Европейско-Азиатское первенство по научной аналитике» и «Национальное первенство по научной аналитике» в виде доклада, который удостоен Диплома «Sophist» (Лондон, 2012). Получена Благодарность за активное участие в работе VI Форума молодых ученых Северо-Кавказского федерального округа «Наука и образование на Юге России: проблемы, перспективы и вклад в развитие региона» (Нальчик, 2012), а также диплом II степени в номинации «Лучший инновационный проект» на выставке инновационных проектов молодых ученых Северного Кавказа (Нальчик, 2013).
Результаты работы вошли в отчеты по научно-исследовательской работе ФГБОУ ВПО «Горский ГАУ» за 2002-2012 гг. и используются в учебном процессе: при выполнении курсовых и выпускных квалификационных работ, при чтении лекций, проведении лабораторно-практических занятий и научных исследований в ФГБОУ ВПО «Горский ГАУ» (РСО-Алания), ФГБОУ ВПО «Ингушский ГУ» (республика Ингушетия). Практическое применение пробиотиков реализовано на ОАО птицефабрике «Михайловская» РСО-Алания, птицефабрике «Ингушетия» Республики Ингушетия, ООО Свинокомплексе «Кировский» РСО-Алания, что подтверждается актами внедрения.
Личный вклад автора. Личное участие автора диссертации охватывает выделение, определение видовой принадлежности, изучение важнейших производственно-ценных и антагонистических свойств местных штаммов лактобактерий, создание новых продуктов функционального питания, а также установление эффективности их использования в кормлении животных и птицы. Автором выполнен основной объем исследований, проведен анализ полученных данных, сформулированы основные положения диссертации, составляющие ее новизну и практическую значимость.
Публикация результатов исследований. Основные положения диссертации изложены в 97 научных работах, в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ – 24 работ. В журнале «Известия Горского ГАУ» опубликовано 12 работ, в журнале «Птицеводство» – 4 работы, в журнале «Молочная промышленность» – 3 работы, в журналах «Аграрная наука» и «Устойчивое развитие горных территорий» – по 2 работы, в журнале «Ветеринария» – 1 работа.
Получен 1 патент РФ №2480017 «Способ производства сметаны «Лакомка» и 2 положительных решения о выдаче патентов на изобретение.
Основные направления, выносимые на защиту:
выделение и селекция биологически активных производственно-ценных штаммов лактобактерий из различных природных субстратов;
идентификация штаммов молочнокислых бактерий селекции Горского ГАУ;
технологические свойства выделенных штаммов лактобактерий;
антагонистические свойства молочнокислых бактерий;
биотехнология новых продуктов функционального назначения на основе местных штаммов молочнокислых микроорганизмов;
результаты использования пробиотиков в кормлении свиней:
- динамика живой массы и приростов подопытных животных;
- морфологические и биохимические показатели крови;
- переваримость и использование питательных веществ рациона;
- экономическая эффективность использования пробиотических добавок при выращивании поросят;
результаты использования пробиотиков при выращивании цыплят:
- динамика живой массы и приростов подопытной птицы;
- сохранность поголовья цыплят-бройлеров;
- морфологические и биохимические показатели крови;
- переваримость и использование питательных веществ рациона;
- химический и аминокислотный состав мяса;
- микрофлора желудочно-кишечного тракта цыплят;
- экономическая эффективность использования пробиотических добавок при выращивании цыплят-бройлеров.
оценка цитогенетических эффектов молочнокислых бактерий в тест-системе Drosophila melanogaster.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований, их обсуждения, выводов и предложений производству. Список использованной литературы включает 500 наименований, в том числе 150 на иностранных языках. Работа изложена на 350 страницах машинописного текста, содержит 102 таблицы, 69 диаграмм, 11 фотографий, 1 рисунок и 8 приложений.
Распространение и селекция молочнокислых бактерий
По данным Л.А.Банниковой (1975), наиболее благоприятен для выделения молочнокислых бактерий период, начиная со второй половины мая по август. В это время молоко является наиболее оптимальной средой для роста молочнокислых бактерий. В это время из различных источников (молоко, молочные продукты, цветы, растения, ягоды, фрукты, овощи) может быть выделено максимальное количество молочнокислых бактерий с хорошими показателями. Однако следует отметить, что далеко не все выделенные штаммы являются стойкими. Часть из них снижает биохимическую активность при культивировании в стерильном обезжиренном молоке и выбраковывается. В связи с этим для отбора наиболее стойких штаммов вполне целесообразно проводить селекцию в указанное время года на стерильном обезжиренном молоке, полученном весной. Рассматривая источники выделения молочнокислых бактерий, Л.А.Банникова отмечает, что почва и корневая система растений из-за высокой обсемененности споровыми видами бактерий не всегда являются хорошими источниками выделения молочнокислых бактерий, даже при добавлении в питательную среду этилового спирта, в целях подавления роста посторонней микрофлоры, как рекомендует Е.И.Квасников (1952). Однако их необходимо использовать при поиске редких форм молочнокислых бактерий, а также их новых видов и разновидностей. В то же время В.М.Богданов и А.К.Максимова впервые показали, что почва и корневая система растений являются хорошими источниками выделения такого довольно редко встречающегося вида молочнокислых бактерий, как Str.diacetilactis.
При поиске новых штаммов Str.diacetilactis наиболее целесообразно использовать корневую систему растений, почву, прилегающую к корневой сие 25 теме, а также цветы, и другие органы растения, фрукты, овощи и т.д. (Л.А.Луковникова, 1965; З.П.Чужова, 1970).
При выделении мезофильных молочнокислых стрептококков для кисломолочных продуктов в ВНИМИ предпочтение отдают самоквасной сметане хорошего качества и цветам (полевым, лесным и садовым); реже используют сметану, выработанную на чистых культурах (Л.А.Банникова, 1970). Кефирные грибки также могут служить источником выделения как мезофильных молочнокислых стрептококков, так и других видов молочнокислых бактерий (В.М.Богданов, И.Н.Пятницына, 1959).
В Литовском филиале ВНИИМСа считают, что лучшими источниками выделения указанных микроорганизмов являются самоквасная сметана и цветы - клевера, ландыша, сирени и вишни (Р.ИТалачкене, 1970). На основании многолетней исследовательской работы автора по селекции микроорганизмов для выделения молочнокислых бактерий могут быть рекомендованы следующие источники: сырое молоко, кислосливочное масло, сыры, самоквасные кисломолочные продукты (сметана, варенец, ряженка, простокваша, кефир и т.д.), а также почва, растения, корневая система, цветы (полевые, лесные, садовые), овощи (свежие и квашеные), фрукты (свежие и высушенные). Для выделения ацидофильных палочек - фекалии человека и животных.
В настоящее время можно считать решенным вопрос об источниках выделения почти всех видов молочнокислых бактерий, применяемых в молочной промышленности. Исключение составляют культуры Str.cremoris и активные формы Lbm.acidophilum. Поэтому решение вопроса об источниках выделения и поиск новых штаммов, является актуальной задачей.
В России имеется уникальная коллекция штаммов Lbm.acidophilum, обладающих высокой энергией кислотообразования и антибиотической активностью. Этот вид молочнокислых бактерий используют с лечебно-профилактической целью, что выдвигает задачу пополнения коллекции активными штаммами Lbm.acidophilum и решение вопроса об источниках выделения этих культур.
Каталог культур лакто- и бифидобактерий, поддерживаемых в коллекции отдела микробиологии УП «БЕЛНИКТИММП», содержит описание более 1000 промышленных штаммов молочнокислых бактерий, а также бифидобактерий. (Сафроненко Л.В. и др., 2001).
Существуют определенные особенности селекции прозводственно-ценных штаммов некоторых видов молочнокислых микроорганизмов.
Раньше выделить Str.cremoris из различных природных источников было затруднено. Так, при выделении тысячи и более штаммов мезофильных стрептококков, не всегда удавалось получить даже единичные штаммы Str.cremoris. В связи с этим исследователи продолжали поиск новых источников выделения этого микроорганизма.
В условиях Литовской ССР установлено (И.Сухоцкене, 1964), что в холодный период года хвойные деревья являются хорошим источником выделения Str.cremoris. Позднее (Р.И.Талачкене, 1970) было сообщено, что культуры Str.cremoris более рационально выделять весной и летом из кисломолочных продуктов, особенно из высококачественной сметаны, а в зимний период — из хвойных растений.
В условиях Омской области была выделена и изучена новая разновидность Str.cremoris (Л.Луковникова, 1965), которая отличается способностью расти в среде с 4% NaCI, более высокой энергией кислотообразования и расположением клеток (диплококки, а не цепочки). Как сообщает Л.А.Луковникова, эта разновидность встречается главным образом на растениях.
Практическое использование молочнокислых бактерий
Молочнокислые бактерии, обитающие в различных природных и производственных субстратах, часто не занимают доминирующего положения, над ними превалируют другие микроорганизмы (обычно грамотрицательные палочковидные формы, плесневые грибы, дрожжи и др.). Поэтому для выделения лактобактерий необходимо использовать среды в должной мере обеспечивающие их питательные потребности.
Среди различных групп микроорганизмов, молочнокислые бактерии с точки зрения потребности в различных питательных веществах, относятся к наиболее сложным организмам. Они отличаются высокой требовательностью к составу питательных сред, применяемых для их выделения и исследования. Для роста им необходимы азотистые вещества, углеводы, витамины, минеральные вещества и др.
При селекции молочнокислых бактерий из природных источников наиболее целесообразно использовать в качестве питательной среды стерильное обезжиренное молоко. При этом происходит естественный отбор тех видов молочнокислых бактерий, которые обладают достаточно выраженной биохимической активностью в молоке. В связи с этим, в качестве питательной среды для выделения чистой культуры лактобактерий мы брали стерильное молоко 0,5 % жирности, т.к. по сравнению с жирным молоком оно является более благоприятной средой для развития молочнокислых микроорганизмов и содержит все вышеперечисленные питательные вещества.
Выделение чистых культур молочнокислых бактерий производили общепринятым методом.
Для выделения культур молочнокислых микроорганизмов из разных природных субстратов, кусочки из проб субстратов измельчались в стерильных фарфоровых чашках, а затем из них делались посевы в стерильное обезжиренное молоко в пробирках бактериологической петлей. Чистоты культур достигали путем ежедневных пассажей (не менее 10 раз). Результаты первичного выделения культур молочнокислых микроорганизмов приведены в таблице 2.
Для выделения чистых культур лактобактерий использовали у растений кусочки листьев и стеблей, ягоды и срезы овощей. Из проб сырого молока и фекалий животных с помощью бактериологической петли также делали посев в стерильное молоко. Посевы термостатировали при температуре 30 и 37 С до образования сгустка. Перевивку обогащенной культуры проводили в стерильное молоко 0,5 % жирности до получения ровного плотного сгустка без разрыва. После каждого пересева содержимое пробирок поверяли на чистоту культуры.
Путем многократных пересевов нами были получены 40 чистых культур лактобактерий из 25 природных источников (таблица 2).
В процессе предварительных исследований из выделенных 40 культур нами были отобраны 12 штаммов молочнокислых микроорганизмов с наиболее стабильными технологическими свойствами в том числе: 6 штаммов, выделенных из образцов от растений (крапива, ромашка, огурец, кабачок, батат, гречиха сахалинская) и по 2 штамма из фекалий поросят, телят и овец.
Предварительное испытание выделенных культур местных штаммов молочнокислых микроорганизмов состояло из следующих операций: - термической обработки молока; - выдержки молока и испытания его на стерильность; - заквашивания молока отобранными культурами молочнокислых микроорга-низов; - термостатирования молока; - анализа готового кисломолочного продукта. Таблица 2
Качество кисломолочных продуктов зависит от многих факторов, в том числе и от качества молока и тепловой его обработки, которая является одним из важнейших условий получения микробиологически чистой продукции. В процессе стерилизации в молоке образуются свободные аминокислоты и муравьиная кислота, что оказывает благоприятное влияние на рост и размножение молочнокислых бактерий. Тепловая обработка молока преследует цель уничтожить технологически вредную и патогенную микрофлору.
В тоже время необходимо учитывать, что при нарушении режима стерилизации (высокая температура при длительной выдержке, о чем свидетельствует бурый цвет молока) в молоке могут образовываться белково-сахарные комплексы, в присутствии которых рост некоторых видов молочнокислых микроорганизмов затрудняется. Поэтому, стерилизацию молока проводили при ПО - 112С (0,5 атм.) в течение 40 мин в стеклянных бутылях, емкостью 0,5 л.
В связи с тем, что автоклавы не гарантируют получение стерильного молока, его выдерживали дополнительно в термостате при 30С не менее двух суток, после чего контролировали микроскопией. Отсутствие бактериальных клеток указывало на стерильность молока и его пригодность для приготовления кисломолочных продуктов.
В подготовленное таким образом молоко вносили стерильно культуру местных штаммов молочнокислых бактерий в количестве 3 - 5 % от общего объема, в зависимости от времени года. Температура сквашивания молока зависит от температурного оптимума культур. Поэтому заквашенное молоко термостатировали до появления ровного плотного сгустка при температуре 30 - 37 С.
Из каждой испытуемой культуры местных штаммов молочнокислых микроорганизмов осуществляли посев в 6 бутылей со стерильным молоком: 3 бутыля инкубировали при температуре 30 С, а 3 бутыля - при температуре 37 С.
Идентификация молочнокислых бактерий
Из анализа материалов, приведенных в таблице 11, следует, что кислотность исходного сквашиваемого молока равна в среднем 18,7 Т, что свидетельствует о том, что молоко, которое было использовано в опыте, являлось свежим и пригодным для производства кисломолочных продуктов. Плотность - это масса молока при 20С, заключённая в единице объема (г/см3). По плотности судят о натуральности молока. Среднее значение плотности молока составляет 1,0288 г/см3 или 28,8 в градусах ареометра. Допустимое отклонение величины этого показателя в отдельных районах и в различные сезоны года — до 2А, что связано с неодинаковым химическим составом молока. Так, с увеличением содержания жира плотность молока понижается.
Наиболее постоянную плотность имеет нежирное молоко — 1,034 г/см3. При добавлении воды плотность молока уменьшается, в силу чего по величине плотности судят о фальсификации молока водой. Натуральное молоко имеет плотность в пределах от 1,027 до 1,032, а молоко разбавленное водой - ниже 1,027 г/см3.
На практике плотность выражают обычно в градусах ареометра. Градус ареометра — это число, показывающее сотые и тысячные доли плотности. Для получения градуса ареометра от величины плотности следует отбросить первые две цифры (1,0) и переставить запятую на 2 цифры вправо. Так, при истинной плотности молока 1,0275 плотность, выраженная в градусах ареометра, будет равна 27,5 (27,5 А).
Нами определение плотности молока осуществлялось ареометром при 20С. В случае отклонения от этой температуры пользовались температурной поправкой (к 20С). Это делается расчетным способом с коэффициентом поправки по формуле: p2o=pt + P(t-20C), где Р20- плотность молока при 20С р t - плотность исследуемого молока Р - коэффициент объёмного расширения молока (равен 0,0002 г/см3) В образцах молока, использованного нами при проведении исследований плотность (р2о) колебалась от 1,0295 до 1,0300 г/см3, при среднем значении р2о = 1,0298 г/см3 ±0,00008 г/см3.
Полученные нами результаты по определению плотности молока свидетельствуют, что использованное молоко являлось натуральным, не фальсифицированным и пригодным для использования при производстве кисломолочных продуктов. Его плотность 1,0298 г/см3 или 29,8 А.
Активность кислотообразования. Большое практическое значение при производстве кисломолочных продуктов имеет скорость образования сгустка. Интенсификация процесса сквашивания молока при производстве кисломолочных продуктов, ускорение созревания и улучшение качества молочных продуктов могут быть достигнуты лишь при использовании в производстве штаммов молочнокислых бактерий с повышенной биохимической активностью.
Высокая активность кислотообразования позволяет повысить производительность труда за единицу времени. Следовательно, важным было определить время, в течение которого испытуемые культуры молочнокислых бактерий сквашивают молоко.
При определении активности кислотообразования выделенных и испытуемых нами культур молочнокислых микроорганизмов в подготовленные по общепринятой методике образцы молока вносили 3 % закваски из соответствующей культуры микроорганизма и инкубировали в термостате при 37С до образования плотного ровного сгустка.
Результаты исследований по определению нами активности кислотообразования испытуемых культур лактобактерий приведены в таблице 12 и диаграмме 3.
Из анализа данных таблицы 12 и диаграммы 3, видно, что активность ки-слотобразования штаммов, выделенных из растений значительно выше (на 5,4 часа), чем у штаммов, полученных из фекалий животных. Активность кислотообразования лактобактерий
Проведенные исследования показали, что из штаммов, выделенных из растений, наибольшей активностью кислотообразования обладает штамм Рю, сквашивавший молоко в течение 4 часов, а из штаммов, выделенных из фекалий животных - штамм Cs (9 часов), что послужило предпосылкой для их более глубокого изучения и испытания на животных.
При определении видовой принадлежности штамм С5 был идентифицирован как Lactobacillus casei, а штамм Р10 - как Enterococcus durans. Видовая принадлежность указанных штаммов подтверждена в ВКПМ (Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов). Необходимо отметить, что наряду с активными кислотообразователями имеются штаммы (Оі и Сг), обладающие низкой активностью кислотообразова-ния, которые сквашивают молоко в течение 14 часов.
Изменение кислотности сквашиваемого молока через каждый час. По накоплению кислоты можно судить об интенсивности развития молочнокислых бактерий за определенный промежуток времени. Данные, полученные нами при определении скорости образования сгустка и почасового повышения кислотности приведены в таблице 13, из анализа которой следует, что в среднем кислотность сквашиваемого молока каждый час возрастала на 4,6 Т. Следует также отметить, что кислотность молока, сквашиваемого штаммами, выделенными из растений, каждый час возрастала на 5,7 Т, а штаммами, выделенными из фекалий животных - на 3,4 Т.
Предельная кислотность. Важное технологическое значение имеет определение предельной кислотности в сквашенном молоке, т.к. от этого показателя зависят качество и условия хранения готового продукта, а также частота перевивок. Так, молочнокислые бактерии, являющиеся наиболее сильными кислотообразователями, необходимо перевивать чаще, чем бактерии со слабой кислотообразующей способностью. Результаты представлены в таблице 14, диаграмме 4 и приложениях 6 и 7.
Микробиологические показатели образцов молока, сквашеных разными культурами местных штаммов лактобактерий
При органолептической оценке качества молока нами было установленно, что все использованные партии обезжиренного молока соответствовали требованиям ГОСТа и характеризовавлись: плотностью — 1,0298 г/см3, кислотностью - 18,7 Т, жирностью - 0,5 %, содержанием сухих веществ - 8,44 %.
Результаты проведенных физико-химических исследований показали, что активность кислотообразования местных штаммов лактобакетрий варьрирует от 4 до 14 часов. Наиболее активными кислотообразователями являются штаммы Pi о, Р21, Pi, Рб и Р20 сквашивавшие молоко в течение 4, 5, 6, 6 и 7 часов, наименее активными являются штаммы Cs, Ргг, К5, Кг, О5, Oi и Сг, сквашивавшие молоко в течение 9, 10,10,11,12,14 и 14 часов, соответственно.
Необходимо отметить, что по сравнению со штаммами, выделенными из фекалий животных, штаммы, выделенные из растений, обладают более высокой активностью кислотообразования, в среднем 6,3 ч. против 11,7 ч.
В среднем кислотность сквашиваемого молока каждый час возрастала на 4.6 Т, причем у штаммов, выделенных из растений, кислотность возрастала на 5.6 Т, а из фекалий животных - на 3,4 Т. Наибольшей активностью обладает штамм Pio, его кислотность каждый час возрастала на 11,9 Т. Из 12 штаммов, отобранных нами для проведения исследований, наибольшей предельной кислотностью обладают штаммы, выделенные из фекалий телят и поросят (200,7 - 318,7Т), в то время как штаммы, выделенные из растений обладают более низкой предельной кислотностью (72,4 — 112,1Т). Наибольшей предельной кислотностью обладает штамм Сг (318,7Т).
Нужно также отметить, что среди штаммов, выделенных из фекалий животных встречаются как активные кислотообразователи, так и малоактивные, так например, штаммы О і и О5, выделенные из фекалий овец, отличаются невысокой предельной кислотностью (76,1 и 82,7 Т). Наши исследования показали, что у палочковидных бактерий (штаммы Сг и С5) предельная кислотность значительно выше, чем у кокковидных и достигает 318,7 и 235,5 Т. Содержание сухого вещества в среднем — 10,15 %, что больше, чем в молоке на 1,71%, что обусловливается накоплением молочнокислыми микроорганизмами биомассы.
Содержание жира в сквашенном молоке в среднем составляет 0,15 %, что на 0,35 % меньше, чем в молоке. Это свидетельствует о том, что молочнокислые бактерии обладают липолитическими свойствами, т.е. используют жир в качестве питательного вещества в процессе своего роста и размножения.
Молочнокислые бактерии относятся к микроорганизмам, для роста которых необходимы углеводы, азотистые вещества. и витамины. На их развитие существенно влияют и различные микроэлементы, присутствующие в среде.
По данным Л.А.Банниковой (1975) при использовании обезжиренного молока в качестве среды для роста молочнокислых бактерий потребность их в углеводном и азотистом питании, витаминах и других питательных веществах в значительной мере удовлетворяется. В обезжиренном молоке и обычных питательных средах урожай молочнокислых бактерий составляет 1,0 109 - 2,0 109 клеток в 1 мл.
При изучении данного показателя в качестве питательной среды мы использовали молоко 0,5 % жирности. Количество микроорганизмов в 1 мл сквашенного молока в среднем составило 1,0 109 - 1,0 1010 клеток. Столь высокая популяция клеток в 1 мл продукта позволяет судить о том, что молоко взятое нами в качестве питательной среды, является благоприятной средой для развития молочнокислых бактерий.
Антагонистическая активность местных штаммов лактобактерий по отношению к условно патогенным микроорганизмам достаточно высокая, об этом свидетельствует высокая зона стерильности — до 25-30 мм по отношению к тест-культурам у штаммов Рю, Рго Ргг» С5, Os, Кг, К5. Полученные результаты свидетельствуют о лечебно-профилактических свойствах молока, сквашенного данными штаммами молочнокислых микроорганизмов. Полученные нами результаты при изучении морфологических и культу-ралтьных свойств местных штаммов лактобактерий совпадают с литературными данными, согласно которым встречаются подвижные формы лактобактерий. Молочнокислые бактерии положительно окрашиваются по Граму, не образуют спор, по форме - кокковидные или палочковидные. Размеры их варьируют у отдельных видов: от 0,6 до 0,9 мкм у кокковидных форм и 0,9-1,0 до 2,6-2,8 мкм у палочковидных.
Колонии точечные, реже мелкого размера, белого цвета, мягкой консистенции, форма округлая, выпуклая, край - гладкий, структура — мелкозернистая.
Проведенные физиолого-биохимические исследования позволяют отнести штамм Р10 к Enterococcus durans, а С5 - к Lactobacillus casei.
Клетки Enterococcus durans крупные, имеют вид цепочек разной длины, характеризуются высокой активностью и пределом кислотообразования 112,1 Т, высокой резистентностью к хлористому натрию и желчи, терморезистентностью и оптимальной температурой роста 37-40 С, на поверхности плотной питательной среды образуют точечные колонии, сбраживают лактозу до молочной кислоты.
Клетки Lactobacillus casei представляют собой палочки средней длины, образуя короткие и длинные цепочеки, устойчивы к желчи и хлористому натрию, обладают низкой терморезистентностью, на поверхности плотной питательной среды образуют мелкие колонии, они способны сбраживать лактозу, глюкозу, мальтозу и маннит. Предельная кислотность достигает 235 Т, оптимальная температура роста 30 С.
Молочнокислые бактерии сравнительно давно используют при выращивании молодняка животных и птиц. Известно, что они преобладают в нормальной микрофлоре пищеварительного тракта молодняка и обладают рядом ценных свойств: угнетают рост патогенных бактерий, активизируют иммунологические реакции животного, нормализуют обмен веществ и т.д.
