Содержание к диссертации
Введение
1. Межклеточная коммуникация у микроорганизмов 6
1.1. Бактерии ~ как мулыпиклеточные организмы 6
1.2 Исследования межклеточной коммуникации у микроорганизмов 12
1. 3 Язык, на котором микроорганизмы "разговаривают друг с другом " 15
2. Ауторегуляторы микроорганизмов 20
2.1 Общие понятия 20
2.2 Система ауторегуляции миксобактерий 21
2.3 Ауторегуляторные факторы а"і и d? 23
2.4 Эффекты кворума . 26
3. Сигнальные системы грам отрицательных бактерий с участием ацилированных лактонов гомосерина 29
3.1 Регуляция биолюминесценции у морских бактерий 29
3.2 " Quorum sensing" у Pseudomonas aeruginosa 33
3.3 " Quorum .sensing " у бактерий рода Erwinia 35
3.4 " Quorum sensing'' у клубеньковых бактерий рода Rhizobtum 36
3.5 Двухкомпонентные сигнальные системы 38
4. Сигнальные системы грамположительных бактерий 39
4.1 Феромоны компетентности в Streptococcus pneumoniae 39
4.2 Индукция компетентности и споруляции у Bacillus subtilis 42
4.3 Регуляция вирулентности у Staphylococcus aureus 44
4.4 Коньюгативный перенос плазмид у Enterococcus faecalis 45
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 58
Глава 1. Регуляция фенотипической изменчивости Bacillus cereus, шт. 504 .. 58
Глава 2. Функции факторов d| как ингибиторов спорового прорастания 76
Глава 3. Влияние ауторегуляторных факторов d| и d2 на рост микробных
популяций 80
Глава 4. Регуляция процессов цитодифференцировки сероокисляющих бактерий 94
Глава 5. Исследование некоторых аспектов механизма действия факторов анабиоза 114
ЗАКЛЮЧЕНИЕ , 138
ВЫВОДЫ 141
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 143
Введение к работе
ции бытовых отходов и относящиеся к группе бацилл с энтомопатогенными свойствами; и экстремофильные гал оалкалоф ильные сероокисляющие бактерии Thioalkalivibrio versutus, шт. AL2 и Thioalkallmicrobium aerophilum, шт. AL3, участвующие в промышленном процессе нефтепереработки на стадии очистки содового буфера от серосодержащих соединений.
Цель работы - изучить возможности использования ауторегуляторных факторов d| и d2 для направленной регуляции фенотипической диссоциации микроорганизмов, их роста и образования покоящихся форм на примере бактерий Bacillus cereus, Thioalkalivibrio versutus и Thioalkallmicrobium aerophilum.
Задачи исследования:
Разработать приемы регуляции популяционной вариабельности бактерий В, cereus с помощью факторов d і и 6г.
Исследовать участие факторов dj в процессах прорастания спор бактерий В. cereus.
Выявить наличие системы ауторегуляции, включающей факторы d| и d2, у гал оалкалоф ильных сероокисляющих бактерий для возможностей регуляции процессов роста этих промышленных штаммов.
Выявить условия образования покоящихся форм у неспорообразующих галоалкалофильных сероокисляющих бактерий для разработки способов их хранения ex situ.
Изучить возможные механизмы действия факторов d| - аутоиндукторов анабиоза в процессах развития покоящегося состояния бактерий.
Научная новизна.
1. Впервые показано, что создание дисбаланса внеклеточных факторов d]/d2
изменяет диссоциативный индекс в популяции прорастающих спор В. cereus,
Показано, что факторы d] имеют функции ингибиторов прорастания бактериальных спор.
У галоалкалофильных сероокисляющих бактерий Т. versutus, шт. AL2 и Т. aerophilum, шт. AL3 обнаружена система ауторегуляции, включающая факторы di — аутоиндукторы анабиоза, предположительно отнесенные к АОБ; и
4, Впервые у экстремофильных бактерий Г. versutus, шт. AL2 и Г.
аегорЫ1иту шт. AL3 показано образование покоящихся форм типа
цистоподобных рефрактерных клеток (ЦРК), контролируемое уровнем
внеклеточных факторов d|. Выявлены различия в жизнеспособности и
терморезистентности образующихся в разных условиях ЦРК.
5. Установлено, что микробные АОБ обладают свойствами структурных
модификаторов ферментов, обуславливающих их стабилизацию и изменение
каталитической активности, а также влияют на структуру моноламелярных
липосом,
Практическая ценность работы.
1. Разработаны приемы направленного изменения диссоциативной
способности бактерий В. cereus, шт. 504 (ВКМ), основанные на создании
дисбаланса внеклеточных факторов dt/d2, что позволяет быстро (в первом
пассаже) проявлять спектр диссоциантов для скрининга вариантов с желаемыми
свойствами или, напротив, стабилизировать определенный фенотип, особенно с
видоопределяющими признаками, для целей хранения микроорганизмов ex situ.
2. Разработаны приемы стимуляции роста сероокисляющих бактерий
(сокращение лаг-фазы, увеличение удельной скорости роста и численности
жизнеспособных клеток) с помощью искусственно создаваемого в среде
дисбаланса внеклеточных факторов d]/d2.
3. Для разработки способов хранения неспорообразующих
галоалкалофильных сероокисляющих бактерий подобраны условия образования
покоящихся форм в циклах развития их культур, в их автолизирующихся
клеточных суспензиях, а также под действием экзогенно вносимых химических
аналогов аутоиндукторов анабиоза - АОБ.
Апробация работы и публикации. Основные результаты исследований по теме диссертации докладывались на 4-х региональных, всероссийских и международных конференциях. По материалам диссертации опубликовано 11 работ: из них 5 статей и 6 тезисов.
Бактерии ~ как мулыпиклеточные организмы
Бактерии — как мультиклеточные организмы В самом общем виде живая клетка может быть описана как сложная система, ограниченная от внешней среды и в то же время неразрывно связанная с ней, получающая, обрабатывающая и использующая в процессе своей жизнедеятельности информацию об окружающем мире: живой и неживой природе [Билич с соавт., 1999]. Прокариотные микроорганизмы обладают удивительной способностью к сбалансированному росту, сохраняя достаточно стабильный общий химический состав, несмотря на отсутствие постоянства внутренней среды, характерного для многоклеточных организмов. В процессе роста ферментативный баланс прокариотной клетки подвержен широким в пределах нормы реакций вида изменениям, адекватным природе используемых источников энергии и конструктивных материалов, что обеспечивает оптимальную приспосабливаемость развивающейся культуры к окружающей среде. В связи с отсутствием выраженной специализации, каждая бактериальная особь выполняет сложные функции по обеспечению метаболических путей необходимыми субстратами в нужных соотношениях. В целях максимального приспособления одноклеточного организма к меняющимся условиям среды, возможности быстрого переключения путей метаболизма для обеспечения конкурентоспособности в природных биоценозах и высокой скорости размножения, клетки снабжены мощным аппаратом регуляции метаболических процессов, успешно изучаемым в настоящее время [Браунштейн, 1987; Гусев, Минеева, 1992; Плакунов, 2001].
В результате сложилось мнение, что коренным отличием сообщества растущих бактерий от многоклеточного организма, является самодостаточность бактериальной клетки и автономность ее поведения, мало зависящие от остальных особей. Однако, самодостаточность единичной бактериальной клетки - весьма относительна. Хорошо известны процессы образования специализированных структур как в пределах одной клетки (в пределах взаимодействия двух нуклеоидов под одной клеточной стенкой - споруляция у бацилл [Дуда, 1982; Errington, 1993]), так и требующие кооперации нескольких десятков клеток (образование гетероцист у цианобактерий [Костяев, 1986]) и даже многих тысячей особей (образование плодовых тел у миксомицетов и миксобактерий [Kaiser, 1986; Yarmolinskyu 1995; Dao et al., 2000], воздушного мицелия у актиномицетов [Каїакуцкий, Агре, 1977], явление биолюминисцен-ции у морских бактерий [Fuqua et al., 1994] и т.д.), что по сложности сопоставимо с морфогенетическими процессами у многоклеточных организмов. Бактериальную колонию также нельзя рассматривать как простое скопление клеток, так как между ними выявлена определенная иерархия [Павлова с соавт., 1990; Costerton, 1995; Новик, Высоцкий, 1995; Дуда с соавт., 1996]. Колонии практически всех прокариотических видов демонстрируют способность к клеточной специализации и многоклеточной организации. Эта способность показана и у бактерий в их природных местообитаниях, где они в основном существуют в виде био-пленок, цепочек, матов и микроколоний [Shapiro, 1995].
Накопление научных знаний о биологии бактерий в мировой литературе привело к появлению концепций, рассматривающих микробные популяции как своеобразные "суперорганизмы" [Бабский, 1989; Олескин, 1993; Bacteria as multicellular organisms I Eds. Shapiro, Dworkin, 1997]. Но еще задолго до этого в 50-х годах прошлого столетия корифей отечественной микробиологии академик Николай Дмитриевич Иерусалимский проанализировал три основные, господствовавшие на тот момент, теории физиологии, динамики роста и изменчивости бактериальных культур [Иерусалимский, 1946; Иерусалимский, 1952; Головлев, 1999а].
Общие понятия
Общие понятия Целый ряд монографий, а также специализированных обзоров и статей посвящен изучению низкомолекулярных ауторегуляторных метаболитов, синтезируемых организмами разных уровней развития (про- и эукариотами одно- и многоклеточными) [Stephens, 1986; Хохлов, 1988; Эль-Регистан, 1988; Vining, 1990; Fuqua et al., 1994; Kelt et al., 1995]. Микроорганизмы представляют собой благодарный объект для изучения регуляции различных типов биохимических реакций, протекающих в клетке, в силу их исключительного разнообразия, быстроты протекания процессов, возможности работать с большим количеством однородного материала, относительно легким получением и поддержанием разнообразных мутантов и др. [Единое, 1995]. Однако, выделение и очистка микробных ауторегуляторов ставит перед исследователем сложные проблемы: малое содержание сигнальных молекул в культуре (культуральной жидкости и клетках); их быстрое исчезновение в процессе метаболизма, вследствие высокой биологичесой активности; а также многообразие процессов, на которые иногда влияет один и тот же регулятор [Biochemistry of bacterial growth, 1982; Pape, Rehm, 1986; Единое, 1989]. Поэтому важнейшим этапом изучения аутобиорегуляторов, является само отнесение природного соединения к этой категории веществ. Изучаемое вещество должно быть получено в высокоочищенном состоянии, с дальнейшим подтверждением исследуемой биологической активности у аналогичного синтезированного образца. Кроме того, к категории ауторегуляторов следует относить лишь те природные биологически активные соединения, которые в обязательном порядке действуют на сам образующий их микроорганизм. При рассмотрении вопроса о том, насколько обосновано причисление изучаемого природного соединения к категории ауторегуляторов, обычно считают необходимым выполнение трех взаимосвязанных условий [Хохлов, 1988]: а) когда наблюдается подлежащее регулированию явление, всегда должен присутствовать предполагаемый регулятор; б) когда нет предполагаемого регулятора, подлежащее регулированию явление не наблюдается; в) если во втором случае внести извне предполагаемый регулятор, наблюдается регулируемый процесс. Учитывая все выше сказанное, полное определение ауторегуляторов или, так называемых, факторов ауторегуляции будет звучать так: это метаболиты, которые выделяются всеми или частью клеток микробной популяции, действуют на все или часть клеток популяции продуцента, не являются источниками конструктивного или энергетического метаболизмов, несут сигнальную функцию к изменению качественного состояния клеток популяции продуцента [Хохлов, 1988].
Регуляция биолюминесценции у морских бактерий
Феромоны компетентности в Streptococcus pneumoniae Компетентностью при генетической трансформации называется способность бактериальных клеток связывать и поглощать экзогенную ДНК с последующей рекомбинацией ее с хромосомой бактерии [Прозоров, 2001]. Большей частью компетентность - переходящее состояние, приобретаемое клетками растущей культуры в конце фазы экспоненциального роста; однако, у некоторых видов компетентность связана со стационарной фазой роста (гемофильные бактерии), либо вообще присуща клеткам в любой фазе роста и всегда выражена (гонококки) [Прозоров, 1988а; Прозоров, 1997]. Состояние компетентности регулируется множеством генов (у бацилл - не менее 40): ранние - "настраивают" клетку на приобретение компетентности; поздние -детерминируют механизмы связывания, поглощения, преобразования и рекомбинации ДНК [Lorenz, Wackemagel, 1994; Прозоров, 2001].
У разных видов стрептококков достаточно высока перекрестная гомология ДНК, которая допускает межвидовые скрещивания, В начале 60-х годов Р. Пакула, работающий со штаммом Chad is (5. gordonii), обнаружил, что внесение в культуру фазы экспоненциального роста фильтрата или перерастворенного сульфат аммонийного осадка среды, на которой росли бактерии, уже достигшие компетентности, вызывало появление компетентности у "незрелой" культуры \Pakula et al., 1962; Раки/а et al., 1963]. Изучение фактора, ответственного за этот эффект, привело к обнаружению вещества, оказавшегося пептидом, и, впоследствие, названного фактором компетентности [Dobrzanski, Osowiecku, 1967]. Через два года после открытия Пакулы Р.Хочкис и А.Томас выдели фактор компетентности у S.pneumoniae, который в концентрации 0,1мкг/мл сообщал компетентность 10 кл/мл. [Tomasz, Hoichkiss, 1964], Он являлся нижомолекулярным белком, чувствительным к трипсину, достаточно термостабильным, инактивирующемся при нагревании до 100(,С за 30 минут [Tomasz, Mosser, 1966]. В 70-80-х гг. работы с веществами, стимулирующими компетентность у разных видов стрептококков, продолжались. Было доказано, что действие фактора компетентности приводит к появлению в клетке ряда новых белков, изменяющих ориентацию всего метаболизма клетки [Raina, Ravin, 1980; Vijayakumar, Morrison, 1986]. В 90-х годах исследования вышли на новый уровень [Havarstein, Morrison, 1999]. Был описан механизм действия феромонов (вместо различных терминов "активатор", "фактор компетентности" стали употреблять сокращение CSP (competence simulating peptide), либо "феромон"), были секвенированы участки генома стрептококков с генами компетентности, синтезированы in vitro катионные пептиды, небольшой величины в точности соответствующие природным феромонам стрептококков (у S.pneumoniae - последовательность из 17 аминокислотных остатков: H-GIu-Met-Arg-Leu-Ser-Lys-Phe-Arg-Asp-Phe-IIe-Leu-Gln-Arg-Lys-Lys-OH [Havarstein et al., 1995]; у других стрептококков - от 14 до 23 остатков).
Сигналом для перехода клеток к состоянию компетентности является увеличение количества феромона в культуральной жидкости до пороговой концентрации. Когда число клеток в культуре достигло определенного уровня, наступает "ощущение кворума". Клетки, находящиеся в культуре, как бы сообщают друг Другу на "феромоновом языке": нас достаточно, чтобы переходить к другому состоянию, в данном случае, к состоянию компетентности. Целесообразность такого перехода, возможно, вызвана тем, что в культуре к этому моменту накапливается большое количество ДНК, вышедшей в процессе автолиза из клеток [Ween et al., 1999].
