Введение к работе
Актуальності, темы.
Биотехнологическое производство биологически активных веществ связано с получением стабильных растительных штаммов-суперпродуцентов. В этой области биотехнология тесно связана с достижениями клеточной и генетической инженерии растений. Одним из перспективных направлении является исследование эффектов генов rol, участвующих в агробактернальиой колонизации растений за счет горизонтального переноса генетического материала (Combard, Baucher, 1988; Hasen et al., 1991; Levcsque et a!., 1988). Экспрессия генов rol из T- ДНК Agrobacterium rhizogenes в трансгенных растениях или клеточных культурах вызывает активацию вторичного метаболизма (Moyano et al., 1999). Расшифровка механизма этого процесса позволит использовать этот метод как поливалентный для получения штаммов-суперпродуцентов.
Поскольку вторичный метаболизм сопряжен со сложным механизмом защитных реакций растений, мы предполагаем, что совместная или индивидуальная экспрессия генов rolA, rolB и rolC способна в ряде случаев повысить устойчивость трансгенных клеток к негативным абиотическим факторам. Механизм ^/-индуцируемой активации биосинтеза вторичных метаболитов в настоящее время активно изучается. Известно, что индивидуальная экспрессия генов rolB и rolC активирует биосинтез аЕітрахинонов в культуре клеток марены сердцелистной (Rubia cordifolia L.) (Bulgakov et al., 2002), ценного лекарственного растения, экстракт которого используют для лечения почечнокаменной болезни и в качестве антиоксидантного и противомикробного препарата (Gilani et al, 1994, Pandey et al, 1994, Singh et al., 2004, Manojlovic et al, 2005). При этом изучение влияния экспрессии этих генов на устойчивость трансгенпых клеток растений к абиотическим стрессам осталось в тени.
В данной работе мы впервые исследовали совместное влияние генов rolA, rolB и rolC на биосинтез антрахинонов и экспрессию гена изохоризматсинтазы (гена ключевого фермента биосинтеза антрахинонов) в трансгенпых культурах марены. Кроме того, в рамках исследования совместного и индивидуального влияния генов rol на устойчивость трансгенпых клеток марены к стрессам мы изучали содержание активных форм кислорода в этих клетках, поскольку известно, что устойчивость растений к стрессам напрямую связана с НАДФН-оксидазной сигнальной системой (Yahrausefa/., 1995).
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является выявление взаимосвязи между содержанием активных форм кислорода в клетках rol-трапегенных культур марены сердцелистной, их устойчивостью к неблагоприятным абиотическим факторам и активацией вторичного метаболизма при совместном и индивидуальном действии агробактериальных онкогенов.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: 1. Получить трапегенную культуру марены экспрессирующую совместно гены rol А, rolBurolC — RABC,
-
Изучить совместное и индивидуальное влияние агробактериальных генов rol на ростовые и биосинтетические характеристики трансгенньгх клеточных культур марены сердцелистной.
-
Изучить совместное и индивидуальное влияние агробактериальных генов rol на содержание активных форм кислорода в клеточных культурах марены сердцелистной.
-
Изучить реакцию трансгенных культур на воздействие негативными абиотическими факторами.
-
Исследовать влияние экспрессии гена rolC на механизм регуляции окислительного взрыва.
Научная новизна. Впервые получена клеточная культура марены сердцелистной, экспрессирующая совместно гены rolA, rolBw rolCw изучено влияние генов rol на рост и биосинтез антрахинонов при их совместной экспрессии.
Впервые установлена положительная корреляция между экспрессией генов rolC и rolB и экспрессией гена ключевого фермента биосинтеза антрахинонов — изохоризматсинтазой при индивидуальной и совместной экспрессии этих трансгенов.
Впервые показано, что в клетках, экспрессирующих ген rolC, снижено содержание активных форм кислорода, что, по-видимому, повышает устойчивость лэ/С-культур к солевому и температурному стрессам. Показано, что в го/С-клетках снижен уровень экспрессии патогениндуцируемой изоформы гена НАДФН-оксидазы марены и значительно ингибирован регуляторный механизм этого фермента.
Практическая значимость. Установлено, что в культурах марены сердцелистной с высоким уровнем экспрессии гена rolC повышена устойчивость к абиотическим стрессам по сравнению с контрольной культурой: в 4 раза при солевом стрессе и при повышении температуры и в 6,2 раза при понижении температуры. Изучен возможный механизм, обеспечивающий га/С-опосредопатигое повышение устойчивости клеток.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Повышение содержания антрахинонов и экспрессия гена изохоризматсинтазы в rolC- и го/5-трансгенных линиях марены сердцелистной обнаруживают положительную корреляцию с уровнем экспрессии трансгенов.
-
Клеточные культуры марены, экспрессирующие ген rolC, обладают повышенной устойчивостью к неблагоприятным абиотическим факторам по сравнению с контрольной культурой.
-
Эффекты экспрессии генов rolC (повышение устойчивости к стрессам) И ГОІВ (активация биосинтеза антрахинонов) сохраняются и при их совместной экспрессии з культурах R ABC и RA4, но друг друга не усиливают.
4. С повышением уровня экспрессии гена rolC содержание активных форм
кислорода в трансгенных клетках снижается, а устойчивость к неблагоприятным
абиотическим факторам повышается. Возможно это связано с тем, что экспрессия
гена rolC вызывает понижение экспрессии генов НАДФН-оксидаз марены, а так же
оказывает ингибирующий эффект на систему регуляции патогениндуцируемой
формы НАДФН-оксидазы.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на 10-ой Пущинской школе-конференции молодых ученных "Биология — наука 21 века" (Пущино, 2006), на Международном симпозиуме по биоразнообразию и биологически-активным веществам растений (Taiwan-Russia Bilateral Symposium on Plant Biodiversity and Bioactive Natural Products) (Тайвань, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы, из них 2 статьи в журналах из списка ВАК.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 111 страницах, иллюстрирована 29 рисунками и 4 таблицами. Список литературы содержит 168 наименований.
