Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 6
1.1. Размножение растений in vivo и in vitro: биотехнологические аспекты 6
1.1.1. Размножений растений in vivo: формирование зиготических и соматических зародышей 6
1.1.2. Размножение растений in vitro: гистогенез, органогенез, соматический
эмбриогенез 11
1.1.3. Особенности размножения женьшеня in vivo и in vitro 16
1.2. Инициация и механизмы регуляция морфогенеза in vitro 24
1.2.1. Влияние внешних факторов и условий культивирования на морфогенез 24
1.2.2. Гормональная регуляция морфогенеза 25
1.2.3. Генетический контроль морфогенеза 28
1.3. Агробактериальпая трансформация и функции гена rolC в трансформированных
клеточных культурах 33
Глава 2. Материал и методы 43
2.1. Материал
2.2. Методы 44
Глава 3. Результаты и обсуждение 51
3.1. Особенности системы размножения и формирования зародыша женьшеня 51
3.2. Морфология и гистология трансгенных линий женьшеня в зависимости от
уровня экспрессии гена rolC 67
3.3. Органогенез и соматический эмбриогенез в трансформированной геном клеточной линии женьшеня 2сЗ 88
Заключение 99
Выводы 101
Литература 102
- Размножений растений in vivo: формирование зиготических и соматических зародышей
- Материал
- Особенности системы размножения и формирования зародыша женьшеня
Введение к работе
Женьшень настоящий Panax ginseng C.A. Mey. является одним из наиболее ценных и известных лекарственных растений. Мировой объем производства и продажи препаратов женьшеня постоянно увеличивается, а проблема источника сырья становится все более актуальной. В основе биотехнологического получения различных растений, в том числе и женьшеня, лежат процессы органогенеза и соматического эмбриогенеза. Широко распространенные приемы, такие как использование экзогенных фитогормонов и индукция морфогенеза абиотическими факторами, далеко не всегда приводят к получению морфогенных структур или эмбриоидов, поскольку дифференциация клеток в культуре in vitro зависит не только от внешних стимулов, но во многом определяется генотипом и текущим состоянием клеток экспланта (Бутенко, 1964; Лутова, 1994; Wang, Bhalla, 2004). Поэтому многочисленные исследования направлены на изучение состояния тотипотентности клетки, в котором она может выбирать направление дальнейшей дифференциации. Каскады реакций, запускающие работу генов, контролирующих различные этапы морфогенеза как в интактном растении, так и в культуре ткани не всегда известны, а процесс развития клеток, тканей и органов трудно изменить (Mordhorst et al., 2002; Grop-Hardt, Laux, 2003). В связи с этим управление морфогенезом с помощью регуляции активности генов приобретает особое значение. Важное место в этих исследованиях занимает регуляция морфогенеза с помощью чужеродных генов, введенных в ДНК растений с помощью векторов.
Агробактерии широко используются для генетической трансформации растений. Гены rol содержатся в части плазмидной ДНК агробактерии (Т-ДНК) Agrobacterium rhizogenes (Spena et al., 1987). При взаимодействии агробактерии с растительной клеткой гены в составе Т-ДНК интегрируются в хромосомы. Трансформация генами семейства rol приводит к неорганизованному росту клеток с изменением программы развития, при этом сохраняется способность клеток к дифференцировке. Отдельные гены семейства rol могут индуцировать образование апикальных меристем побегов. Вероятно, гены rol обладают общим регуляторным действием, которое представляет интерес для биотехнологии. Один из этих генов - ген rolC - индуцировал в клеточном штамме женьшеня образование структур, морфология которых напоминала побеги, эмбриоиды и корни. Это говорит о том, что экспрессии одного встроенного гена оказалось достаточно для придания клеткам трансформированного каллуса состояния тотипотентности и возможности реализовать все имеющиеся пути развития, что делает ген rolC весьма перспективным при изучении регуляции морфогенеза.
Цель настоящего исследования - изучение процессов органогенеза и соматического эмбриогенеза в клеточных линиях женьшеня, интактных и трансформированных геном rolC, и создания на этой основе модельной системы для исследования регуляции морфогенеза.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1) Изучить особенности формирования и развития зародышей женьшеня в семени
интактных растений, описать их морфологию и гистологию до дессиминации.
2) Изучить морфологию и гистологию клеточных линий женьшеня,
трансформированных геном rolC.
Описать последовательность этапов органогенеза и соматического эмбриогенеза в трансформированной клеточной линии 2сЗ.
Провести молекулярный анализ трансгенных линий и оценить влияние экспрессии гена rolC на процессы дифференциации клеток женьшеня.
Основные положения, выносимые на защиту:
Экспрессия гена rolC в трансгенных клеточных линиях женьшеня приводит к изменению программы развития клеток и вызывает разные типы дифференцировки клеток (гистогенез, ризогенез, геммогенез, соматический эмбриогенез).
Отдельный ген не растительного происхождения (ген rolC) способен индуцировать соматический эмбриогенез у растений женьшеня; этот процесс не является результатом мутации гена rolC, или следствием инсерционного Т-ДНК мутагенеза.
Начальные этапы развития соматического зародыша (эмбриоида) in vitro и полового зародыша in vivo у женьшеня протекают сходно.
В трансгенной линии 2сЗ развитие эмбриоидов осложняется процессом вторичного соматического эмбриогенеза и аномалиями развития, свидетельствующими о постоянном присутствии фактора, инициирующего образование дополнительных апикальных меристем и эмбриоидов.
Основная часть работы выполнена в лаборатории биотехнологии Биолого-почвенного института ДВО РАН под руководством академика Ю.Н. Журавлева, в рамках плановой тематики лаборатории. Исследования с помощью метода сканирующей электронной микроскопии проводили в лаборатории эмбриологии растений Ботанического института им. Комарова РАН г. Санкт-Петербург. Работа была частично поддержана грантами государственного научно-технического проекта "Биологическое разнообразие", РФФИ (03-04-48102) и средствами фонда US CRDF и Министерства Образования РФ (проект VL-003).
Основные результаты получены автором, молекулярно-генетические исследования проводились совместно с к.б.н. К.В. Киселевым (группа биоинженерии Биолого-почвенного института ДВО РАН).
Автор выражает искреннюю признательность академику РАН Ю.Н. Журавлеву и к.б.н. О.Г. Корень за руководство при выполнении работы; чл.-корр. РАН Т.Б. Батыгиной (БИН им. Комарова, СПб) за теплый прием в лаборатории эмбриологии растений, всестороннюю помощь и консультации в работе; чл.-корр., д.б.н. В.П. Булгакову (БПИ ДВО РАН) за рекомендации по подготовке рукописи работы и предоставление изучаемых клеточных линий; к.б.н. К.В. Киселеву (БПИ ДВО РАН) за помощь в проведении молекулярно-
генетических исследований; к.б.н. Т.И. Музарок, В.Н. Гапонову и Н.И. Гапоновой за помощь в поддержании коллекции растений женьшеня; к.б.н. А.Б. Холиной, к.б.н. Е.М. Саенко (БПИ ДВО РАН) за рекомендации по подготовке рукописи работы; к.б.н. Е.А. Брагиной, д.б.н. И.И. Шамрову, к.б.н. Е.В. Андроновой, к.б.н. Г.Е. Титовой (БИН им. Комарова, СПб) за консультации в работе и помощь в освоении метода сканирующей электронной микроскопии растений. Безмерно благодарна всем сотрудникам лаборатории биотехнологии БПИ ДВО РАН и лаборатории эмбриологии растений БИН им. Комарова, СПб за всемерное содействие в работе.
Размножений растений in vivo: формирование зиготических и соматических зародышей
Продолжительность жизни многоклеточного растения, как и всех живых организмов, ограничена. Для распространения и сохранения вида необходимо чередование поколений, осуществляемое с помощью процессов размножения и воспроизведения. Размножение многоклеточных растений осуществляется семенами и вегетативно. Такие процессы, как меиотическое клеточное деление, половая дифференциация и сингамия обеспечивают чередование гаметофитно-спорофитных поколений и адаптацию вида к меняющимся условиям внешней среды. Митотическое деление клеток, образование вегетативных отпрысков и формирование семян без полового процесса обеспечивают чередование спорофитных генераций и быстрое увеличение численности популяций, приспособленных к определенным условиям (Френкель, Галун, 1982; Грант, 1984).
У высших растений семенное размножение является наиболее распространенным способом воспроизведения (рис. 1). Большая часть жизненного цикла высших растений представлена диплоидной фазой - стадией спорофита. При этом размеры гаметофита сильно редуцированы. Формируясь после мейоза, гаметофиты имеют небольшие размеры и состоят из малого числа клеток. Процесс образования зародыша непосредственно зависит от успешного развития микро- и макроспор.
При микроспорогенезе процесс образования гамет происходит в пыльнике, археспоры (микроспороциты) проходят мейоз, образуя тетрады гаплоидных микроспор. В процессе созревания каждая микроспора делится путем митоза, в результате образуются два ядра: вегетативное и генеративное. Впоследствии генеративное ядро делится митотически, образуя две генеративные клетки - мужские гаметы (спермин). Мужские гаметы (или их предшественница - генеративная клетка) располагаются в толще цитоплазмы вегетативной клетки. По мере созревания вегетативная клетка, подобно семени, дегидратируется и накапливает запасные вещества, вокруг нее формируется сложноорганизованная оболочка пыльцевого зерна.
Материал
Объектом исследований были дикорастущие растения Panax ginseng из Синегорской, Хасанской и Сихотэ-алиньской популяций, собранные в течение трех сезонов август-сентябрь 1994-1996 годов и после сбора пересаженные в питомник с искусственным затемнением. Условия обитания растений в питомнике были приближены к естественным. Возраст найденных растений оценивался по стеблевым следам, остающимся на корневище вследствие ежегодного отмирания надземных побегов, и составлял от 2 до 25 лет. Растения из сихотэ-алиньской популяции в апреле 1997 года были перенесены в оранжерею в деревянные ящики.
Клеточные линии женьшеня Panax ginseng С.А. Меу.
В работе были использованы следующие клеточные культуры P. ginseng из коллекции лаборатории биотехнологии БПИ ДВО РАН:
1. Клеточный штамм женьшеня lc (G), получен в 1990 году (Bulgakov et al., 1991).
2. Трансформированные клеточные линии, получены в 1993 - 2000 гг. (Bulgakov et al., 1998; Булгаков и др., 2000) в лаборатории биотехнологии БПИ ДВО РАН: клеточная линия lc-rolC-vector (GV), первичные опухолевые линии lc-ro/C-II (II), lc-ro/C-III (III), lc-rolC-W (IV), lc-ro/C-V (V), rolC-ll (СИ), ro/C-III (CIII), R33, R2, 2c2 и клеточная линия 2сЗ, которая формирует эмбриоиды, полученная из линии II путем отбора в течение нескольких пассажей, из агрегатов не содержащих корней (Khodakovskaya et al., 1998).
Схема происхождения трансформированных клеточных линий представлена на рисунке 5.
Плазмиды
Для переноса чужеродного гена использовали вектор Agrobacterium tumefaciens GV3101, несущий бинарную векторную систему, состоящую из двух плазмид (рис. 6):
1. pMP90RK, vir-хелперная плазмида, осуществляющая перенос и встраивание Т ДНК в геном растения. Плазмида содержит vir-оперон, маркер устойчивости к гентамицину и последовательность, обеспечивающую репликацию.
2. Вторая плазмида использовалась в зависимости от цели исследования.
Применяли: а) pPCV002, плазмида, содержащая в составе Т-ДНК ген устойчивости к канамицину - nptll (неомицип-фосфотрансфераза) под контролем Nos промотора и Ocs терминатора. Т-ДНК фланкирована 25 п.н. повторами (BR и BL), содержит точку начала репликации (ori) и селективный маркер устойчивости к ампицилину.
б) pPCV002-CaMVC, плазмида отличается от pPCV002 наличием в составе Т-ДНК гена rolC под контролем 35S промотора и Nos терминатора и маркерный ген nptll.
Особенности системы размножения и формирования зародыша женьшеня
Морфогенетические потенции вида в культуре in vitro лимитируются особенностями воспроизведения данного растения в естественных условиях, т.е. его системой размножения. Генезис и структура зиготического и соматического зародышей таксоноспецифичны. В целом их развитие подчиняется общим закономерностям развития зародышей. Сравнительный анализ зиготических зародышей и соматических, развивающихся в естественных условиях и в культуре in vitro, позволяет говорить о паралелизме в их развитии, который проявляется в основных закономерностях морфогенеза. И зиготические, и соматические зародыши характеризуются меж- и внутривидовым полиморфизмом, а также различного рода аномалиями (Батыгина, 1999; Батыгина и др., 2004).
Несмотря на широкий интерес к женьшеню, процессы эмбриогенеза, а также система размножения данного вида изучены недостаточно. Семенное размножение у женьшеня является практически единственным путем воспроизведения этого вида, т.к. вегетативное размножение у него наблюдается крайне редко (Грушвицкий, 1961) и не имеет практического значения. Исследования последних лет показали, что система размножения женьшеня сложна и помимо амфимиксиса, включает и апомиктичное завязывание плодов (Корень, 1997; Koren et al., 1998). Однако, количественные данные об образовании апомиктичных зародышей, как и данные о соотношении участия опыления и апомиксиса в формировании семян, у данного вида практически отсутствуют.
Опыление и завязываемость семян женьшеня
Для выяснения потенций клеток в семязачатке женьшеня, в течение нескольких лет проводились тесты по завязываемости плодов при культивировании в оранжерее (табл. 3) и в питомниках (табл. 4, 5) при разных условиях опыта: принудительное самоопыление, принудительное перекрестное опыление и тесты на апомиксис с удалением пыльников па стадии бутонов и изоляцией отдельных цветков (апомиксис).
