Введение к работе
Актуальность проблемы. Ухудшение экологической обстановки, приводящее к снижению защитных сил организма человека и всплеску заболеваний, связанных с нарушением бактериального баланса в желудочно-кишечном тракте, обусловливает постоянный интерес к изучению адаптационных механизмов молочнокислых бактерий (МКБ) [Lee et al., 2005; Rochat et al, 2005; Hatakka et al., 2008; Menghcri, 2008]. Выполняющие защитную и детоксицирующую функцию в организме человека, участвующие в симбиозах как с животными, так и с растениями, МКБ интенсивно используются в производствах про- и пребиотических продуктов; продуктов, нетрадиционно обогащенных молочнокислыми бактериями, например, таких как мороженое, соевый йогурт, шоколад, овощные лактоферментированные соки; натуральных пищевых консервантов; а также применяются в медицине как лечебные средства [Farnworth et al., 2007; Su et al., 2007; Ramchandran et al., 2008; Macfarlane et al., 2008]. Внимание исследователей к изучению способности МКБ переживать неблагоприятные условия вызвано как теоретическим интересом, так и необходимостью создания кисломолочных продуктов с жизнеспособными клетками МКБ, длительное время сохраняющими способность к пролиферации, а при попадании в желудочно-кишечный тракт быстро адаптирующимися и возобновляющими активный метаболизм.
В ответ на изменения условий окружающей среды, связанные с исчерпанием питательных веществ, источников энергии и пространства, или с воздействиями повреждающих факторов (ухудшением физико-химических условий, антимикробными агентами и т.д.), микроорганизмы включают ряд защитных механизмов для адаптации клеток в пределах нормы реакции вида или для его выживания в виде покоящихся форм (ПФ) в неростовых условиях [Woolin et al., 2001; Бухарин с соавт., 2005]. Свой вклад в адаптацию вносит внутрипопуляционная фенотипическая вариабельность, от которой зависит результативность симбиозов, замещение и поддержание продуктивных вариантов [Hallet et al., 1997; Головлев, 1998; Прозоров, 2000; Woude et al., 2004]. Согласно ряду гипотез, процесс диссоциации связан с состоянием покоя, при выходе из которого меняется соотношение диссоциантов в популяции [Дорошенко с соавт., 2002], и действием сигнальных молекул, контролирующих экспрессию генов стационарной фазы и
переход клеток в состояние покоя [Suh et al., 1999]. Среди внеклеточных метаболитов такими функциями обладают видонеспецифичные ауторегуляторы - аутоиндукторы анабиоза, выделенные и описанные для большого числа микроорганизмов, и представленные у ряда бактерий и дрожжей алкилоксибензолами (АОБ) [Бухарин с соавт., 2005; Эль-Регистан с соавт., 2006]. Изучение механизмов адаптации к неблагоприятным воздействиям, в том числе за счет внутрипопуляционных диссоциативных переходов, и использование выявленных закономерностей для направленной регуляции популяционной вариабельности МКБ представляют значительный интерес для микробиологии, биотехнологии производства про-, пребиотиков и медицины.
Цель работы: изучить закономерности регуляции адаптивных реакций молочнокислых бактерий; выявить особенности их внутрипопуляционной вариабельности; разработать приемы контроля диссоциативных переходов; выяснить роль алкилоксибензолов в регуляции стрессовых реакций МКБ.
Задачи исследования:
Изучить адаптационные ответы молочнокислых бактерий Lactobacillus plarttarum, Lactobacillus acidophilus ЛТ-41, Lactococcus lactis ТБ2 на стрессовые воздействия как «запрограммированные» в онтогенезе - исчерпание источников питания, так и «незапрограммированные» - действие антибиотиков.
Изучить закономерности фенотипической диссоциации МКБ, охарактеризовать выделенные диссоцианты по их колониально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам.
Разработать приемы контроля диссоциативных переходов бактерий.
Изучить роль АОБ в регуляции адаптивных реакций бактерий: контроле экспрессии стрессовых генов и повышении частоты диссоциативных переходов.
Разработать биотехнологические приемы получения овощных лактоферментированных напитков.
Научная новизна. 1. Впервые показано, что при возникновении неблагоприятных для роста условий молочнокислые бактерии L. plarttarum, L. acidophilus АТ-41, L. lactis ТБ2, как и другие неспорообразующие бактерии, образуют клетки, обладающие всеми признаками покоящихся форм. Установлено, что образование и свойства ПФ
молочнокислых бактерий зависят от условий роста культур (модификации сред) и их постстационарной инкубации. На моделях L. acidophilus и L. plantarum продемонстрирован внутривидовой полиморфизм покоящихся форм МКБ -образование как цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК), так и переживающих клеток L-типа. 2. Разработаны приемы регуляции внутрипопуляционной изменчивости промышленных штаммов L. acidophilus АТ-41 и L. lactis ТБ2. Найдены селективные условия для стабилизации развития недоминантных вариантов. Выделены и охарактеризованы колониально-морфологические варианты этих бактерий. 3. Обнаружена способность алкилоксибешолов контролировать включение защитных функций микроорганизмов путем индукции экспрессии стрессовых генов и повышения частоты виутрипопуляционных диссоциативных переходов, обусловливающих фенотипическую изменчивость бактерий. Установлена зависимость регуляторних эффектов АОБ от их структуры (длины алкильного радикала) и концентрации. 4. Выявлена регуляторная функция АОБ в контроле внутрипопуляционных диссоциативных переходов бактерий. Обнаружена зависимость частоты выщепления недоминантных вариантов от структуры и концентрации АОБ. 5. Выявлена роль длинноцепочечных АОБ как алармонов (сигналов тревоги) в активации стрессовых генов SOS-ответа и rpoS-регулона. 6. Продемонстрированы протекторные функции короткоцепочечных АОБ в защите клеток от УФ-облучения, что выражается в снижении уровня экспрессии генов SOS-отпета.
Практическая ценность. 1. Разработаны приемы получения суспензий длительно хранящихся, стрессоустойчивых цистоподобных покоящихся клеток МКБ. 2. Предложены способы: а) быстрого получения диссоциантов МКБ путем рассева на плотные среды ЦПК, обладающих нестабильным генотипом; б) направленного контроля диссоциативного спектра МКБ путем применения селективных условий для развития вариантов, различающихся ростовыми, физиолого-биохимическими признаками, антагонистической активностью и адгезивными свойствами. Выделенные диссоцианты могут быть рекомендованы для получения препаратов пробиотиков и пищевых продуктов. 3. С использованием диссоцианта L. acidophilus, имеющего ростовые и физиолого-биохимические преимущества, разработаны приемы
получения нового лактоферментированного продукта на основе овощного сока,
обладающего высокой пробиотическои потенцией. 4. Возможность направленной
регуляции экспрессии стрессовых генов может быть использована в целях генной
инженерии. 5. Показанные антимутагенные и протекторные свойства
короткоцепочечных АОБ в отношении повреждающих агентов различной природы могут быть использованы в биотехнологических процессах и медицинской практике.
Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на Всероссийской молодежной школе-конференции (ИНМИ, Москва, 2005); Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 2007); Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Москва, 2008); Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2008). По материалам диссертации опубликовано 8 работ: из них 4 статьи в рецензируемых журналах, утвержденных в перечне ВАК; 4 тезиса.
Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 152 страницах и состоит из введения, обзора литературы (Глава 1), экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 235 публикаций отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 19 таблицами и 21 рисунком.
