Введение к работе
Актуальность проблемы. Распространенность инфекционно-воспалительных заболеваний вирусной и бактериальной этиологии, трудности их специфической индикации (диагностики) обусловливают необходимость поиска и разработки новых методов, позволяющих выявить возбудитель и активность процесса. Среди заболеваний инфекционной природы туберкулез и вирусные гепатиты устойчиво занимают доминирующее положение (Онищенко Г.Г., 2010). По оценке, в мире ежегодно отмечается 1,5 миллионов клинических случаев гепатита А. [ (HebA_Rus.pdf)]. Гепатит А, проявляющийся нарастанием симптомов с начала заболевания, сейчас встречается в более позднем возрасте. Больные с бессимптомной формой заболевания, оставаясь нераспознанными, являются основным источником заболевания. В связи с тем, что они поступают в медицинские учреждения в более поздние сроки развития инфекции, антиген ВГА не всегда выявляется, поэтому наиболее достоверным маркером для постановки диагноза гепатита А является выявление иммуноглобулинов класса М (IgM). Разработка и внедрение в практику здравоохранения методов диагностики гепатита А является одним из актуальных направлений профилактики и лечения этой широко распространенной инфекции.
Около трети населения в мире инфицировано преимущественно микобактериями вида M. tuberculosis, в России инфицированность превышает 80 %, а по заболеваемости и числу больных туберкулезом Россия, по-прежнему, входит в число стран с самой неблагоприятной ситуацией по туберкулезу (WHO, 2008). Заболеваемость туберкулезом не зависит от социальной принадлежности и охватывает все слои современного общества. В общей системе мер борьбы с туберкулезом является современная и достоверная диагностика. Имеющиеся в настоящее время диагностические тесты не всегда отвечают предъявляемым требованиям. Многие из них весьма трудоемки и не всегда отличаются достоверностью. Особенностью туберкулеза, как одной из хронических инфекций, является преобладание латентных форм и случаев бактерионосительства. Традиционные методы диагностики туберкулеза, такие как рентгенография и бактериологический анализ мокроты, туберкулинодиагностика не всегда эффективны. Нередко для постановки окончательного диагноза требуется сравнение результатов, полученных разными методами. Развитие методов определения клеточного иммунитета напрямую связано с разработкой новых методов идентификации Т-клеточных компонентов крови (Pai M., 2006; Lalvani A., 2007, 2001; Bellete B., 2002; Clark S.A., 2007). Высокая разрешающая способность этих методов позволяет оценивать антиген-стимулированную продукцию цитокинов, что очень важно для оценки специфического иммунного ответа.
Таким образом, разработка новых технологий, в том числе на основе выявления Т-клеточных маркеров, является крайне важной для нашей страны
и в настоящее время входит в разряд наиболее актуальных проблем современной медицины.
Лейкоз крупного рогатого скота широко распространен по всему миру (Murakami K. et al., 2011; Acaite J. et al., 2007; Храмцов В.В. с соавт., 2005; Смирнов П.Н., 2007). В РФ, по данным Прихватиловой Л.Б. с соавт. (1998); Гулюкиной М.И. и соавт., (2003), лейкоз крупного рогатого скота занимает лидирующее место и составляет 57 % от других нозологий. 60 % инфицированных животных не имеют клинических признаков инфекции (Kettmann R. et al., 1994), и только выявление специфических антител серологическими методами или выявление провирусной ДНК с использованием молекулярно-биологических методов позволяет идентифицировать заболевание. Большинство структурных белков вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) проявляет иммуногенность, что позволяет с достаточной достоверностью выявлять антитела у инфицированных животных. C середины 70-х годов активно разрабатывались различные тест-системы для диагностики лейкоза крупного рогатого скота посредством ферментов с использованием цитопатогенных свойств вируса, а также для непосредственного обнаружения вирусного генома (Graves D.C. et al., 1977); с помощью полимеразной цепной реакции (Fechner H. et al., 1996; Бусол В.А. и др., 1999; Mullis K.B. et al., 1986; Naif H.M. et al., 1992; Kuckleb urg C.J. et al., 2003). В ГНЦ ВБ «Вектор» создание диагностических средств для выявления вирусных и бактериальных инфекций включает фундаментальные исследования вирусных белков и составляет одно из ведущих направлений деятельности центра. Высокая значимость для общественного здравоохранения и ветеринарии создания новых эффективных средств диагностики явилось основанием для проведения данной работы.
Цель исследования: разработка наборов и тест-систем, основанных на определении клеточного и гуморального иммунного ответа на антигены вирусного гепатита А, туберкулеза легких и вируса лейкоза для выявления этих заболеваний у человека и крупного рогатого скота. Задачи исследования:
-
Получить и охарактеризовать биоконъюгаты моноклональных антител к нативному антигену вируса гепатита А. Разработать и стандартизовать диагностические иммуноферментные тест-системы для выявления маркеров вирусного гепатита А.
-
Сконструировать рекомбинантные молекулы, несущие гены, кодирующие видоспецифичные высокоиммуногенные белки M. tuberculosis. Провести оценку полученных полипептидов на пригодность их для использования в диагностике туберкулеза у человека.
-
Разработать и стандартизовать диагностические тесты с использованием гибридных полипептидов и с применением методов определения способности клеток крови продуцировать IFN- для выявления туберкулеза человека.
4. На основе использования рекомбинантного белка р24 разработать диагностический набор для выявления вируса лейкоза КРС. Сравнить результаты анализа, полученные с использованием разработанного набора, с референс-тест-системами.
Научная новизна
Впервые были получены и охарактеризованы биоконъюгаты крысиных моноклональных антител к нативному антигену вируса гепатита А. Разработаны и стандартизованы иммуноферментные тест-системы для выявления и дифференциальной диагностики вирусного гепатита А, обладающие высокой чувствительностью (85–95 %) и специфичностью (90– 100 %).
Впервые на основе плазмиды pGEX-2T сконструированы
рекомбинантные плазмиды, несущие гены, кодирующие видоспецифичные
высокоиммуногенные белки M. tuberculosis, такие как rESAT-6, rCFP10 и
rMPT64. Введение новых плазмид в экспрессирующий штамм E. coli BL21
позволило получить штаммы-продуценты рекомбинантных белков, несущих
в N-концевой части аминокислотную последовательность
глутатионтрансферазы (GST) в качестве белка-носителя. Полученные штаммы-продуценты обеспечивали продукцию слитных белков в растворимой форме.
Впервые полученные рекомбинантные белки – rESAT-6, rCFP10 и rMPT64 – можно использовать при разработке тест-систем нового поколения для диагностики туберкулеза.
При проведении иммуноферментного и функционального анализа (IFN--анализа, IFN--ELISPOT-теста) для выявления туберкулеза и подтверждения (опровержения) диагноза использованы рекомбинантные белки, содержащие на N-конце аминокислотную последовательность глутатионтрансферазы в качестве вспомогательного белка.
Сравнение с помощью расчетных программ, предсказывающих В-клеточные эпитопы антигенов, показало хорошее совпадение вторичных структур соответствующих районов природных и рекомбинантных белков, что позволило прийти к заключению о полноценном взаимодействии последних со специфическими иммуноглобулинами без отщепления GST-последовательности.
Впервые разработана схема диагностики лейкоза крупного рогатого скота на основе серологических методов – ИФА и РИД – с применением рекомбинантного антигена р24, которые использованы в ветеринарии на завершающих этапах оздоровления животных от лейкоза и в хозяйствах, где регистрируются единичные случаи инфекции ВЛКРС.
Практическая значимость работы
Получены и сконструированы опытные и экспериментально-производственные серии тест-систем, которые были аттестованы в отделе биологического и технического контроля НПО «Вектор» и испытаны в ГИСК им. Л.А. Тарасевича в 1990–1991 гг. На разработанную диагностическую тест-систему утверждена научно-техническая документация (ВФС 42-331ВС-
92), эксперименально-производственный регламент (ЭПР) 373-92. «Тест-система иммуноферментная для выявления иммуноглобулинов класса М к вирусу гепатита А «Вектогеп-А-IgM». Инструкция по применению «Тест-системы иммуноферментной для выявления иммуноглобулинов класса М к вирусу гепатита А «Вектогеп-А-IgM».
Разработана экспериментальная коммерческая тест-система для выявления ВГА двухстадийным вариантом, которая обладает 100 % чувствительностью и специфичностью и позволяет определять вирусный антиген в природных биологических объектах, в лизате инфицированных клеток. Применение крысиных моноклональных антител в диагностике позволяет значительно увеличить специфичность и чувствительность тест-систем.
Разработана и запатентована технология получения рекомбинантных видоспецифических белков rESAT-6, rCFP10 и rMPT64 M. tuberculosis для диагностики туберкулеза.
Разработанные методы иммунологического мониторинга туберкулезной инфекции, использующиe Т-клеточные технологии, позволяют усовершенствовать диагностику туберкулеза.
Создана схема комплексной диагностики ВЛКРС в хозяйствах на завершающих этапах оздоровления животных от лейкоза и в хозяйствах, где регистрируются единичные случаи инфекции ВЛКРС на основе иммуноферментного анализа (ИФА) и радиальной иммунодиффузии (РИД).
Положения, выносимые на защиту
-
Разработанные и стандартизованные компоненты диагностических иммуноферментных наборов для выявления маркеров вирусного гепатита А позволили создать высокоэффективные диагностические тест-системы.
-
Плазмиды pTSE6, pTB232 и pTB323 содержат гены, кодирующие рекомбинантные видоспецифичные высокоиммуногенные белки M. tuberculosis. При введении этих плазмид в клетки E. coli (BL21) обеспечивается продукция рекомбинантных белков rESAT-6, rCFP10 и rMPT64 в растворимой форме в количествах, достаточных для проведения диагностики туберкулеза.
-
Разработанная методика получения, выделения и очистки рекомбинантных белков rESAT-6, rCFP10 и rMPT64 в растворимой форме из штаммов-продуцентов, а также полученные рекомбинантные генетические конструкции на основе плазмиды pGEX-2T, включающие гены, кодирующие секретируемые белки M. tuberculosis, и экспрессирующий штамм BL21, могут быть представлены в виде технологической схемы для разработки лабораторного регламента по производству этих белков.
-
Рекомбинантные белки rESAT-6, rCFP10 и rMPT64 применимы в качестве компонентов в иммуноферментном анализе, -интерфероновом анализе и в -интерфероновом ELISPOT-тесте при диагностике туберкулеза без проведения протеолитического отщепления
аминокислотной последовательности белка-носителя от аминокислотной последовательности целевого белка. Исследование клинического материала позволило оценить возможности гибридных белков в диагностике туберкулеза. 5. Комплексная диагностика вируса лейкоза крупного рогатого скота с использованием серологических тестов (РИД, ИФА) позволяет с большей эффективностью проводить обследование хозяйств с различной степенью инфицированности лейкозом крупного рогатого скота.
Структура и объем диссертации
