Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из актуальных проблем при разработке высокочувствительных методов иммуноферментного анализа (ИФА) является обеспечение качества и стандартизации получения необходимых иммунохимических реагентов. Развитие молекулярной биологии и биотехнологии дало возможность получать методами генной инженерии рекомбинантные антигены, ферменты, антитела и их фрагменты, а также рекомбинантные конъюгаты ферментов с антигенами и антителами. Генноинженерные подходы имеют ряд существенных преимуществ по сравнению с выделением белков из природных источников и получением конъюгатов традиционными методами химического синтеза, К ним относятся высокий выход готового препарата, его стоимость, воспроизводимость и технологичность получения; полученные препараты, как правило, имеют гомогенный состав.
Разработка методов ИФА связана с необходимостью получения конъюгатов ферментов-маркеров с антигенами или антителами, в которых антиген или антитело сохраняет иммунологическую активность и не происходит инактивации фермента. Однако, все основные подходы, используемые для химического коньюгирования белков и гаптенов, приводят к частичной инактивации ферментов и гетерогенности конъюгатов, что оказывает влияние на специфичность и чувствительность иммуноферментного анализа. С помощью методов генной инженерии можно получать рекомбинантные конъюгаты с белковыми антигенами или антителами, которые имеют ряд преимуществ, а именно, они гомогенны по составу, имеют стехиометрию 1:1 и сохраняют функциональную активность как белка-маркера, так и антигена.
Рекомбинантные конъюгаты представляют собой химерные белки, в которых объединены структурные части как фермента-маркера, так и антигена. Современные подходы биотехнологической науки практически решили проблему получения рекомбинантных ферментов, таких как щелочная фосфатаза, Р-галактозидаза, люцифераза, пероксидаза хрена (ПХ), использующихся в качестве маркеров в методах ИФЛ, и всевозможных антигенов белковой природы. Однако, получение рекомбинантных конъюгатов - задача довольно сложная и не тривиальная, поскольку на сегодняшний день невозможно достоверно предсказать С|рїіа>та»аш<ЖЄЙвК>кШ
коныогата. В результате возможна потеря функциональной активности как фермента-маркера, так и антигена из-за неправильного фолдинга двух составных частей химерного белка.
Ранее были получены рекомбинантные конъюгаты с бактериальными ферментами - р-галактозидазой и щелочной фосфатазой, которые могут быть легко экспрессированы в растворимой форме в клетках E.coli, а также с некоторыми другими ферментами. Основной проблемой, связанной с использованием (3-галактозидазы и щелочной фосфатазы в составе конъюгатов, является их тетрамерная и димерная структуры, соответственно, что приводит к существенному увеличению аффинности конъюгата по сравнению со свободным антигеном. Это особенно нежелательно при разработке конкурентных схем ИФА. В то же время пероксидаза хрена, которая является одним из наиболее широко применяемых ферментов-маркеров для ИФА, может быть экспрессирована в клетках E.coli только в форме тел включения, что до недавнего времени затрудняло получение активного фермента. Достижения последних лет в гетерологической экспрессиии гена ПХ в клетках E.coli, реактивации и рефолдинга рекомбииантной ПХ из тел включения дают возможность получения рекомбинантных конъюгатов с ПХ в качестве фермента-маркера для методов ИФА. Это открывает новые перспективы применения широко используемого фермента-маркера ПХ в конкурентных схемах ИФА с использованием генноинженерных конъюгатов, в частности, в иммунохимических методах определения белка, связывающего жирные кислоты, из сердца человека (с-БСЖК; ЬН-FABP - human Heart Fatty Acid-Binding Protein).
с-БСЖК не так давно был предложен в качестве нового маркера ранней диагностики, острого инфаркта миокарда (ОИМ) - одной из актуальных проблем современной кардиологии. Этот небольшой цитозолический белок с молекулярной массой около 15 кДа является представителем семейства внутриклеточных липид-связывающих белков, участвующих в метаболизме жирных кислот. В настоящее время известно 9 типов БСЖК, различающихся по тканевой экспрессии (из сердца, поджелудочной железы, мозга, печени и др.). Сердечный тип БСЖК в большом количестве содержится в сердечных мышцах (0,56 мг/г сердечной ткани) и является иммуволопгаески отличным от других типов БСЖК. Небольшие размеры белка
обуславливают его быстрое высвобождение из поврежденных кардиомиоцитов в кровоток. Было показано, что при повреждении миокарда, подобно миоглобину (Мг), концентрация с-БСЖК в крови значительно повышается в течение 3 часов после появления симптомов ОИМ и возвращается к нормальному уровню через 12-24 часа. Это, а также хорошая тканеспецифичность в сравнении с Мг делают с-БСЖК перспективным маркером ранней диагностики ОИМ.
Клинические изучения требуют значительных количеств человеческого с-БСЖК для использования его в качестве белкового стандарта. Гетерологическая экспрессия данного белка имеет очевидные преимущества по сравнению с выделением его из тканей. Это касается выхода готового препарата, его стоимости, имеющегося в распоряжении материала, отсутствия загрязнения другими белками, а также юридических и морально-нравственных аспектов.
Цель исследования. Целью настоящей работы явилось получение рекомбинантного конъюгата на основе ПХ для ИФА, его применение в тест-системе для количественного определения с-БСЖК в сыворотке/плазме крови и установление диагностического значения теста на с-БСЖК в ранней диагностике ОИМ.
Задачи исследования.
1. Разработать методы получения рекомбинантных иммунохимических
реагентов, необходимых для ИФА: рекомбинантного с-БСЖК и рекомбинантного
конъюгата пероксидазы хрена с с-БСЖК (ПХ-БСЖК).
2. Разработать метод получения аффинно очищенных поликлональных антител,
специфичных к с-БСЖК на основе сорбентов с иммобилизованным рекомбинантным
с-БСЖК.
-
Провести сравнение иммунохимических свойств коньюгатов ПХ-БСЖК, полученных методами генной инженерии и химического синтеза.
-
Разработать тест-систему для количественного определения с-БСЖК в сыворотке и плазме крови на основе твердофазного конкурентного ИФА. Изучить стабильность всех компонентов, входящих в состав тест-системы.
-
Установить диагностическое значение разработанного теста определения с-БСЖК в ранней диагностике ОИМ.
Научная новизна. В результате выполнения данной работы впервые был получен рекомбинантный коныогат пероксидазы хрена с белковым антигеном (с-БСЖК), который был зкепрессирован в клетках Kcoli. Введение 6xHis в С-концевую область ПХ позволило оптимизировать процедуру рефолдинга и схему очистки рекомбинантной ПХ, давая возможность получать фермент с высоким выходом из разбавленных растворов рефолдинг среды. Рекомбинантный коныогат ПХ-БСЖК сохраняет функциональные свойства как фермента (удельная активность конъюгата сравнима с удельными активностями рекомбинантной и растительной ПХ), так и иммунологические свойства антигена (с-БСЖК). Было показано, что рекомбинаптный коныогат, имеющий гомогенный состав, стехиометрию 1:1 и удельную активность в два раза выше по сравнению с конъюгатом, полученным традиционным методом химического синтеза, имеет преимущества при использовании в конкурентной схеме И ФА.
Впервые предложена конкурентная схема иммуноферментного анализа для определения концентрации с-БСЖК, которая имеет преимущества по сравнению с существующими "сэндвич" методами ИФА. Широкий диапазон определяемых концентраций избавляет от необходимости предварительного разбавления анализируемых образцов, а также уменьшается общее время анализа вследствие только одной инкубации образцов и конъюгата с антителами.
Практическая значимость работы. В ходе работы были разработаны методы получения рекомбинантных иммунохимических реагентов, предложен метод аффинной очистки поликлональных антител, специфичных к с-БСЖК.
На основе полученных реагентов был разработан и оптимизирован метод твердофазного конкурентного ИФА для количественного определения с-БСЖК в сыворотке/плазме крови с использованием рекомбинантного с-БСЖК и рекомбинантного конъюгата ПХ-БСЖК. Данная тест-система характеризуется высокой чувствительностью (1,5 нг/мл) и специфичностью, имеет широкий диапазон определяемых концентраций (1,5-500 нг/мл) и позволяет количественно определять с-БСЖК в крови в течение 1 часа.
В проведенном исследовании показана возможность определения содержания с-БСЖК с помощью конкурентного метода ИФА в сыворотке крови практически
здоровых людей и пациентов с диагнозом острый коронарный синдром (ОКС). На основе полученных данных было показано, что разработанная тест-система обладает высокой чувствительностью и специфичностью для ранней диагностики ОИМ.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Международной конференции "Biocatalysis-2000" (Москва, 2000), Международной научной конференции "Biosensors for Environmental Monitoring" (Иркутск, 2000), IV Международном симпозиуме "Plant Peroxidase: Biochemistry and Physiology" (Murcia, Spain, 2002), II Московском международном Конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2003).
Публикации, По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы.
Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (4 главы), экспериментальной части, описывающей материалы и методы исследования, результатов и их обсуждения (3 главы), выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 125 страницах, содержит 35 рисунков и 11 таблиц. Список литературы включает 183 ссылки.
