Введение к работе
1- 1.1. Актуальность темы.
Одним из направлений в биотехнологии, интенсивно развивающихся в последнее годы, является создание трансгенных животных — продуцентов рекомбинантных белков фармакологического назначения. Учитывая сложность получения лекарственных препаратов белков из органов и биологических жидкостей человека ввиду их низкой кон центр ации,_а также ограниченного объема сырья и возможности переноса опасных инфекций, производство рекомбинантных белков с помощью трансгенных жнвотньгс имеет в настоящее время огромный коммерческий интерес. При этом наиболее интересным представляется получение биологически активных протеинов с молоком сельскохозяйственных животных. Экспрессия чужеродных белков в молочной железе трапегенных животных может достигать 1 г/л. Причем, выделение данных белков из молока становится возможным уже при их концентрации от 25 нг/мл (Vclander W. et al, 1992; Denman J. et al., 1991; Wright G. et al., 1991; van Gott et al, 1997; DiTulio P, ct al, 1995 а др.).
Однако, стоимость производства трансгенных животных на сегодняшний день остается высокой. Кроме того, экспрессирусмые уровни трансгена у крупных животных не всегда коррелируют с теми, которые были получены у лабораторных животных (Wall R. et al, 1991). Отрицательным моментом также является и то, что у крупных животных только 1% эмбрионов, микроиньенированных экзогенной ДНК, развивается в трансгенное животное, причем около 40% из них не экспрессируют трансген (Wilmutl.etal,1991;HennighausenL.etal, 1992). .
В рамках данной проблемы актуальным является разработка методов получения трансгенных животных, характеризующихся высокой эффективностью трансгенсза и низкими материальными затратами. Как перспективный в данном отношении метод рассматривают использование ретровирусных, векторов. По сравнению с другими типами векторов рстровирусы обладают уникальной способностью переносить чужеродные гены и стабильно интегрировать их в геном делящихся соматических клеток. На этом основано использование ретровирусных векторов для получения соматических трансгенных животных, т.е. животных с трансформацией отдельных органов (Брем Г. и др., 1995). Введение экзогенных генов в органы взрослых животных позволяет значительно сократить .сроки с момента введення генных конструкций до получения первых данных об уровне экспрессии чужеродных белков, что особенно важно для животных, характеризующихся большим генерационным интервалом (крупный рогатый скот, козы, свиньи). В связи с этим интересным представляется проведение
НЛУЧІ-!,М : >.' ;-.ОТГ.ИА МОСК. Г.ІЛїК.^О-. v^^rvw»
и».:. К. А. '-Ч--«wji-^'b . / j.
экспериментов по переносу экзогенной ДНК с помоїцью ретровирусных векторов в клетки молочной -железы сельскохозяйственных животных с целью получения продуцентов рекомбинантных белков.
І.З.Цель и задачи исследования.
Исходя из вышеизложенного, иелью диссертационной работы явилось изучение интеграции и экспрессии экгогеной ДНК в молочной железе соматических трзнсгашых животных, полученных с использованием ретровирусных векторов.
Для достижения указанной целя были поставлены следующие задачи:
-
Оценить используемые линии клеток-упаковщнц на наличие рекомбинантной вставки методом ПЦР;
-
Оценить эффективность использования ретровирусных векторов, содержащих гены гранулоцитарного колонисстимулирующего фактора к зритропоэтина человека, для осуществления переноса экзогенной ДНК в секреторные клетки вымени после введения клеток-упаковщиц в молочную железу крупного рогатого скота и свиней;
-
Изучить динамику экспрессии рекомбинантного гранулоцитарного колонисстимулирующего фактора (Г-КСФ) и эритропоэтнна человека в молоке коров и свиноматок в течение лактации;
-
Выявить факторы, влияющие на уровень экспрессии рекомбинантных белков в молоко;
-
Провести анализ распространения ретровирусных векторов в других органах к тканях опытных животных.
1.3 .Научная новизна.
8 ходе выполнения диссертационной работы впервые подробно была изучена эффективность использования ретровирусных векторов, содержащих гены гранулоцитарного колоннестимулирующего фактора и зритропоэтина человека, для осуществления локальной трансформации отдельных органов, в частности молочной железы коров и свиней. Была исследована динамика зкспрессии рекомбинантного зритропоэтина и гранулоцитарного колониестймулирующето фактора человека в молоке опытных живогных в течение лактации.
Выявлено влияние лактации, времени введения генных конструкций в молочную железу, возраста и вида животных на уровень экспрессии рекомбинантного белка в молоко.
Проведен анализ интеграции генных конструкций в органах и тканях коров и свиней после введения ретровирусных векторов в молочную железу.
1.4. Практическая значимость работы.
- Показана возможность использования ретровирусных векторов для
получения животных - продуцентов рскомбинантных белков.
Изучены факторы, влияющие на уровень экспрессии рекомбинантного белка в молоко.
1.5. Основные положения, выносимые на защиту:
Возможность доставки генных конструкций эритропоэтина и гранулоцитарного колони сстимулнрующего фактора в секреторные клетки вымени на основе использования ретровирусных векторных систем, вводимых п молочную железу.
Синтез рекомбинантного белка в молоко в течение лактации носит периодический характер.
Распространение ретровирусных векторов наблюдается как в месте инъекции, так и в других органах и тканях.
1.6.Апробация работы.
Материалы диссертации были представлены на международной конференции «ДНК-тсхкологни в клеточной инженерии и маркировании признаков сельскохозяйственных животных», ВИЖ, н.Дубровицы, 2001; конференции аспирантов и молодых ученых, ВИЖ, п.Дубровицы, 2001; международной научно-практической конференции «Повышение конкурентноспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», Быково, 2002, научных отчетах ВИЖа за 2000-2002.
1.7.11 ублнкацн я результатов исследовании.
По материалам диссертации опубликовано 4 работы.
1.8.Структура и объём работы.
Диссертация изложена на 100 страницах, содержит И таблиц, 17 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения, выводов, практических предложений. Список литературы включает 130 источников.
