Введение к работе
І.
Актуальность темы. Повышение эффективности животноводства на современном этапе связано с разработкой новых биологических приемов, направленных на изменение генома сельскохозяйственных животных. По характеру локализации трансгена в организме животных трансгенные индивидуумы могут быть подразделены на два типа: генеративные и соматические. В зависимости от целей эксперимента, научный и практический интерес представляет получение обоих типов трансгенных животных.
Перспективным приемом соматического переноса генов является использование ретровирусньгх векторов [Титова В.А..,2001, Волкова Н.A.,2002J. Их способность переносить чужеродные гены и стабильно интегрировать их в геном делящихся клеток, например, в секреторные клетки молочной железы, позволят экспрессировать рекомбинангный продукт с молоком. Это делает возможным получение белков, имеющих фармакологическое значение. Молочная железа трансгенных животных является идеальным источником производства рекомбикантных белков. Кроме того, молоко, содержащее рехомбкнантные белки, имеет высокий гигиенический стандарт и может быть легко извлечено с использованием имеющихся технологий [Зиновьева Н.А. и Др.,2001].
По сравнению с бактериальными и примитивными эукариотическимн системами в молочной железе трансгенных животных выполняются большинство постгрансляционных модификаций рекомбннантных белков (гидроксилированне, гликозилирование, у-карбоксилирование), происходит правильная складчатость белков, требующаяся для проявления их биологической активности. Актуальным является проведение исследований по изучению закономерностей и оптимизации экспрессии рекомбннантных белков в молоке трансгенных сельскохозяйственных животных. Изучение факторов, влияющих на уровень синтеза рекомбннантных белков с молоком трансгенных коз и овец позволит повысить эффективность трансгенных технологий в животно во детве.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение закономерностей и оптимизация экспрессии рекомбикантных белков в молоке соматических и генеративных трансгенных животных.
Для достижения цели были поставлены н решены следующие задачи:
1. Получить соматических трансгенных коз методом инъекции клеток-
упаковщиц, продуцирующих генные конструкции эритропоэтина и
гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека.
2. Изучить эффективность трансформации клеток вымени коз на уровне ДНК.
-
Выполнить анализ экспрессии рекомбинантного эритропоэтина (ЭПО) и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) в молоке коз в ходе лактацни.
-
Дать сравнительную оценку эффективности экспрессии рекомбннантных белков в молоке коз в зависимости от стадии введения клеток-упаковщиц, периода лактации и генной конструкции (ЭПД Г-КСФУ
ЙЕЙЗЗП
5. Выполнить исследования молочной продуктивности, состава молока и
активности рекомбинантного химозина в молоке трансгенных овец при
нормальной и индуцированной лактации.
6. Изучить структуру тканей вымени трансгенных овец и коз по сравнению с
контрольными.
Научная новизна.
Впервые изучена эффективность использования ретровирусных векторов, содержащих гены гранулоцнтарного колониестимулнрующего фактора и эритропоэтина человека, выявлена локальная трансформация клеток молочной железы коз. Исследована динамика экспрессии рекомбинантного эритропоэтина и гранулоцнтарного колониестимулнрующего фактора человека в молоке опытных животных в течение лактации. Установлено влияние лактации, времени введення генных конструкций в молочную железу животных на уровень экспрессии рекомбмнантных белков с молоком. Изучена продуктивность и уровень синтеза рекомбинантного химозина с молоком трансгенных овец при нормальной и индуцированной лактации.
Практическая значимость. Показана возможность использования ретро вирусных векторов для получения соматически трансгенных коз-продуцентов рекомбинантных белков. Изучены факторы, влияющие на уровень экспрессии рекомбинантных белков с молоком. Показана возможность использования индуцированной лактации для повышения молочной продуктивности, получения большего количества рекомбинантного химозина с молоком трансгенных овец. Основные положения, выносимые на защиту.
Получены соматически трансгенные козы- продуценты эритропоэтина и гранулоцитарного колониестнмулирующего фактора человека. Установлен уровень и характер синтеза рекомбинантных белков в молоке трансгенных коз в ходе лактации.
Выявлены факторы, влияющие на эффективность получения соматических трансгенных коз.
Изучена молочная продуктивность и активность химозина в молоке трансгенных овец при нормальной и индуцированной лактации. Апробация работы.
Материалы диссертации были доложены на конференции молодых ученых ВИЖа (2001); на международной научной конференции «Актуальные проблемы ДНК-технологнЙ и клеточной инженерии сельскохозяйственных животных» (2002); на конференциях отдела биотехнологии ВИЖа (2001,2002).
Публикации результатов исследования.
По материалам диссертации опубликовано 4 работы.
Структура и объем работы.
