Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Оптимизация применения регуляторов роста и развития растений в биотехнологиях in vitro Нам Ирина Ян-Гуковна

Оптимизация применения регуляторов роста и развития растений в биотехнологиях in vitro
<
Оптимизация применения регуляторов роста и развития растений в биотехнологиях in vitro Оптимизация применения регуляторов роста и развития растений в биотехнологиях in vitro Оптимизация применения регуляторов роста и развития растений в биотехнологиях in vitro Оптимизация применения регуляторов роста и развития растений в биотехнологиях in vitro Оптимизация применения регуляторов роста и развития растений в биотехнологиях in vitro Оптимизация применения регуляторов роста и развития растений в биотехнологиях in vitro Оптимизация применения регуляторов роста и развития растений в биотехнологиях in vitro Оптимизация применения регуляторов роста и развития растений в биотехнологиях in vitro Оптимизация применения регуляторов роста и развития растений в биотехнологиях in vitro Оптимизация применения регуляторов роста и развития растений в биотехнологиях in vitro Оптимизация применения регуляторов роста и развития растений в биотехнологиях in vitro Оптимизация применения регуляторов роста и развития растений в биотехнологиях in vitro
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Нам Ирина Ян-Гуковна. Оптимизация применения регуляторов роста и развития растений в биотехнологиях in vitro : Дис. ... д-ра биол. наук : 03.00.23 : М., 2004 312 c. РГБ ОД, 71:05-3/149

Содержание к диссертации

Введение

. Литературный обзор 17

1.1. Применение регуляторов роста и развития растений в современной биотехнологии 17

1.1.1. Применение регуляторов роста и развития растений при клональном микроразмножении 20

1.1.2. Гормональная регуляция регенерации растений плодово-ягодных культур in vitro 28

1.1.3. Генетическая трансформация плодово-ягодных культур 40

1.1.4. Использование метода эмбриокультуры in vitro в селекционном процессе 47

1.2.1. Молекулярно-генетическое маркирование растений методом ISSR-PCR 49

1.3. Применение модельных систем на основе изолированных органов in vitro для исследования действия регуляторов роста и развития растений при созревании и прорастании семян 53

1.3.1. Гормональная регуляция созревания семян in vivo 56

1.3.2. Влияние фитогормонов на рост и развитие зародышей в культуре in vitro 60

1.3.3. Гормональная регуляция прорастания семян 63

1.3.4. Изолированные семядоли как модельная система для изучения действия фитогормонов 66

1.3.4. Изучение молекулярных механизмов действия фитогормонов на модельных системах на основе изолированных органов растений 68

1.4.1. Регуляция роста и развития растений с помощью фитогормонов и синтетических регуляторов роста 71

1.4.2. Применение фитогормонов и синтетических регуляторов роста на огурце 71

1.4.2.1. Применение фитогормонов на огурце в открытом и закрытом грунте 72

1.4.2.2. Применение на огурце регуляторов роста растений негормональной природы 75

1.4.3. Применение препаратов из эндофитных симбионтных грибов 78

1.4.4. Применение регуляторов роста, синтезированных < на основе фурфурола 84

2. Объекты и методы исследований 91

2.1. Характеристика объектов исследования 91

2.1.1. Биологическая характеристика огурца 91

2.1.2. Биологическая характеристика малины 95

2.1.3. Биологическая характеристика люпина 99

2.2. Методы исследования 101

2.2.1. Культивирование малины in vitro 102

2.2.2. Регенерация и генетическая трансформация растений малины 104

2.2.3. Молекулярно-генетический анализ методом ISSR 105

2.2.4. Отбор растительного материала люпина желтого 106

2.2.5. Анализ фитогормонов в тканях люпина желтого 107

2.2.6. Культивирование зародышей незрелых семян люпина in vitro 107 * 2.2.7. Технология выращивания огурца в защищенном грунте 108

3. Результаты и их обсуждение 112

3.1. Оптимизация применения регуляторов роста и развития растений при культивировании in vitro малины 112

3.1.1. Разработка методов клонального микроразмножения

ремонтантной малины 114

3.1.1.1. Применение регуляторов роста на этапе введения ремонтантной малины в культуру in vitro 115

3.1.1.2. Этап размножения пробирочных растений ремонтантных форм малины. 128

3.1.1.3. Укоренение пробирочных растений ремонтантной малины 136

3.1.1.4. Адаптация укорененных пробирочных растений к внешним условиям 143

3.1.1.5. Общая характеристика генетического разнообразия образцов ремонтантной малины при их размножении в культуре in vitro 146

3.1.1.6. Описание сортов ремонтантной малины, полученных с помощью биотехнологических подходов 152

3.1.1.7. Хранение образцов ремонтантной малины in vitro 160

3.1.2. Регенерация растений ремонтантной малины in vitro 168

3.1.3. Разработка метода генетической трансформации ремонтантных форм малины 183

3.1.4. Разработка метода молекулярно-генетического

анализа малины методом ISSR-PCR 198

3.2. Исследование гормональной регуляции процессов, протека ющих на разных этапах онтогенеза растений люпина 210

3.2.1. Создание модельной системы на основе зародышей из созревающих семян люпина желтого 211

3.2.2. Создание модельной системы на основе семядолей проростков люпина желтого 222

3.2.3. Изучение механизма действия фитогормонов на модельных системах изолированных органов люпина 227

3.3.1. Разработка метода применения РРР для повышения продуктивности огурца при возделывании в защищенном грунте 231

3.3.1.1. Определение диапазона оптимальных концентраций РРР при их воздействии на прорастание семян 233

3.3.1.2. Влияние регуляторов роста растений на появление и развитие всходов огурца в опытах в защищенном грунте 248

3.3.1.3. Влияние регуляторов роста и развития растений на цветение растений огурца в условиях защищенного грунта 260

3.3.1.5. Влияние регуляторов роста и развития растений на продуктивность растений огурца 263

3.3.1.6. Влияние препарата Кавказ на урожайность огурца в производственных опытах в защищенном грунте 268

Заключение 272

Выводы 276

Практические рекомендации 278

Список литературы 279

Введение к работе

Исследование влияния регуляторов роста и развития на жизнедеятельность растений является важнейшим направлением современной биотехнологии. Интерес к нему связан как с теоретической значимостью проблемы, так и с возможностью практического использования результатов в селекции и технологии.

Регуляторы роста представлены широким спектром природных и синтетических веществ, оказывающих воздействие на все этапы онтогенеза растений (Муромцев Г.С. и др., 1987). Среди них особое место занимают природные фитогормоны и их синтетические аналоги (Кулаева О.Н., 1973, 1982; Кефели В.И., 1974, 1989), направленно регулирующие процессы, протекающие в растениях, что позволяет использовать их в биотехнологиях in vitro (Муромцев Г.С. и др., 1987; Шевелуха B.C., 1992).

Важное значение среди биотехнологических подходов имеют кло-нальное микроразмножение и регенерация in vitro, которые разработаны для многих видов культурных растений (Бутенко Р.Г., 2001). Однако для сложно размножаемых культур актуальным остается поиск эффективных регуляторов роста для разработки технологий их размножения и регенерации in vitro.

Фундаментальной основой для поиска новых физиологически активных веществ и разработки методов их применения является изучение механизмов действия регуляторов роста на различных уровнях. Большие возможности в этом отношении дают модельные системы in vitro, включая изолированные органы, ткани, а также бесклеточные системы (Третьяков Н.Н. и др., 1998; Глазко В.И., Глазко В.Г., 2003). Разработка модельных систем включает изучение физиологических процессов, характерных для данного органа, исследование специфичности их гормональной регуляции и чувствительности по отношению к различным гормонам, взаимодействие разных типов фитогормонов и т.д. Особый интерес представляют системы, позволяющие изучать действие регуляторов роста на молекулярном уровне, в том числе на уровне транскрипции и регуляции экспрессии отдельных генов и генетических программ. Разработка таких модельных систем на разных культурах способствует расширению наших представлений о молекулярном механизме действия фитогормонов на процессы, протекающие на разных этапах онтогенеза, и в конечном счете, дальнейшему развитию теории гормональной регуляции жизнедеятельности растений.

Создание теории гормональной регуляции у растений стало возможным благодаря накоплению большого количества данных о воздействии фитогормонов на рост и развитие различных видов растений, в то же время для многих представителей обширной группы синтетических регуляторов роста изучено лишь их влияние на продуктивность отдельных сельскохозяйственных культур (Муромцев Г.С. и др., 1979; 1984; Никелл Л.Дж., 1984; Шевелуха B.C. и др., 1998). Поэтому их применение на других видах растений с целью повышения продуктивности растений и ее стабилизации, например, на огурце при возделывании в защищенном грунте, требует дальнейшего изучения.

Исследования, результаты которых представлены в данной работе, были проведены в период с 1978 по 2004 гг. на ремонтантной малине, огурце в защищенном грунте и люпине желтом - культурах разных семейств, сильно различающихся в физиологическом отношении, а также по степени изученности и проблемам, которые решались с применением регуляторов роста.

В настоящей работе были использованы ремонтантные формы малины селекции чл.-корр. РАСХН И.В. Казакова, полученные при межвидовой гибридизации малины красной, замечательной, черной, боярышниколист-ной, душистой и поленики. На Кокинском опорном пункте ВСТИСП (Брянская обл.) собрана многочисленная коллекция ремонтантных сортов и форм, здесь создан самый крупный в стране гибридный фонд. В гибридном питомнике было оценено около 120 тысяч гибридов, при этом отобрано более 250 образцов, превосходящих районированный ремонтантный сорт Бабье лето. Однако ремонтантные формы имеют существенные особенности в развитии (Казаков И.В., 1994), резко замедляющие их вегетативное размножение. Главной отличием этих генотипов является плодоношение на побегах первого года, в связи с чем вегетативные почки рано дифференцируются по цветковому типу. Распределение питательных веществ также подчинено раннему плодоношению, поэтому ассимиляты преимущественно потребляются растущими побегами и плодоэлементами. Это вызывает существенное уменьшение образования корневых отпрысков, замедление вегетативного размножения и, следовательно, селекционного процесса в целом. Для ускорения создания новых ремонтантных сортов малины актуальной была разработка биотехнологических приемов размножения элитных ремонтантных форм, в частности методов их кло-нального микроразмножения и регенерации растений in vitro.

В работе мы использовали результаты отечественных и зарубежных исследователей, ранее разработавших методы клонального микроразмножения in vitro для растений рода Rubus: малины красной, черной, ежевики (Коротаева М.С. и др., 1975; Высоцкий В.А., 1984, 1998; Туровская Н.И., 1990; Fiola J.A. et al., 1990; Graham J. et al., 1997). Так, при микроразмножении этих видов растений на этапах введения эксплантов in vitro и собственно размножения пробирочных растений применяются цитокинины пуринового ряда - 6-БАП, реже кинетин и зеатин, а на этапе индукции ризо-генеза - ауксины ИУК, ИМК или НУК. Для регенерации in vitro растений разных видов из эксплантов различного типа — листовых пластинок, дисков и черешков, семядолей, зародышей и других органов, используются сочетания различных цитокининов и ауксинов. Из цитокининов наиболее эффективным для индукции регенерации является 6-БАП, а в качестве ауксинов чаще всего упоминаются ИУК, ИМК, реже 2,4-D. В ряде работ по регенерации растений плодовых культур авторы индуцируют стеблевой морфогенез на семядолях и листовых дисках с помощью тидиазурона - ци-токинина ряда дифенилмочевины.

В начальный период нашей работы литературных данных о размножении и регенерации in vitro ремонтантной малины не было. Разработку методов клонального микроразмножения и регенерации in vitro ремонтантных форм малины мы начали с изучения эффективности применения при их культивировании традиционно используемых фитогормонов 6-БАП и ауксинов ИУК и ИМК.

Основные сложности при разработке метода клонального микроразмножения наблюдались на этапе введения образцов ремонтантной малины в культуру in vitro, что было связано с биологическими особенностями этих форм — с ранним плодоношением растений, формированием ягод на побегах текущего года. В связи с этим были ограничены как сроки вычленения апексов для культивирования in vitro, так и количество исходного материала - всего по 6 -15 эксплантов на образец. Малое количество исходного материала объективно не позволяло проводить опыты по оптимизации питательных сред, особенно на этапе введения материала в культуру in vitro. Кроме того, оптимизировать гормональный состав питательных сред на других этапах микроразмножения также было сложно из-за большого генетического разнообразия размножаемых форм - с 1993 по 2004 гг. нами было введено в культуру более 145 гибридных образцов, размножено и передано селекционерам более 15 тысяч растений 130 генотипов. То есть, необходимо было разработать универсальные среды, эффективные для большинства образцов, но, возможно, не оптимальные для отдельных генотипов. При недостаточной активности традиционно используемых фитогормонов на разных этапах этой работы важно было исследовать возможность применения новых регуляторов роста, ранее не использованных для ремонтантной малины.

В современной селекции широко используются методы генетической инженерии, позволяющей направленно создавать сорта, несущие новые, уникальные свойства. Однако для трансгеноза растений необходимо предварительно разработать высокоэффективный метод регенерации растений изучаемой культуры in vitro, а также выбрать способ трансформации растительных тканей и подобрать условия ее проведения. В литературных источниках в начале 90-х годов были данные о получении трансгенных растений малины и ежевики, однако с ремонтантными формами работа не проводилась, что явилось основанием для разработки методов регенерации и трансформации ремонтантных генотипов.

В современной биотехнологии в последние годы четко проявилась тенденция использования методов, подходов и достижений этой науки для проведения исследований в смежных областях биологии. Так, например, успехи генетической инженерии позволили разрабатывать модельные системы типа растение - агробактерия A. tumefaciens, которые применяются для изучения физиологических (гормональных) и молекулярных механизмов генетической трансформации, а также генетических систем, отвечающих за их взаимодействие (Лутова Л.А. и др., 2002).

Методы культивирования изолированных органов и тканей растений также широко используются в физиологии и молекулярной биологии растений. Так, при изучении регуляторов роста и развития растений особое внимание ученых привлекает их воздействие на растения на молекулярном уровне, например, влияние фитогормонов на экспрессию генов и генетических программ на уровне регуляции их транскрипции и трансляции (Ку-лаева О.Н., 1987, 1999; Холл A.M., 2002). Для этого требуется разработка модельных систем, отвечающих определенным требованиям. Создание модельных систем на основе культивируемых in vitro органов растений позволяет упростить регуляторные взаимодействия, вычленить и охарактеризовать отдельные процессы, и изучить влияние на них внешних факторов, в том числе фитогормонов.

Исследования гормональной регуляции процессов, протекающих на разных этапах онтогенеза люпина желтого, были начаты нами в 1978 году. На модельной системе цветочной кисти люпина изучена гормональная регуляция процесса опадения плодоэлементов и на этой основе был предложен препарат ингибиторного действия 2-аминоизомасляная кислота. Она является конкурентным ингибитором АЦК-синтазы - ключевого фермента биосинтеза этилена, и существенно подавляет опадение плодоэлементов, повышая тем самым продуктивность растений.

Изолированные семядоли проростков и незрелые зародыши люпина, культивируемые in vitro, также могут быть использованы в качестве модельных систем для изучения действия гормонов на этапах формирования и прорастания семян, в том числе на молекулярном уровне. Ранее на люпине желтом подобные исследования не проводились, и этой проблеме посвящена часть настоящей диссертации. 

Регуляторы роста широко используются при возделывании многих сельскохозяйственных культур, при этом они стимулируют рост и развитие растений, увеличивают их продуктивность и устойчивость. Для повышения урожайности огурца в защищенном грунте мы изучали действие ряда регуляторов негормональной природы из числа стимуляторов роста общего действия, которые в целом ускоряют рост, развитие и плодоношение растений. В настоящее время таких препаратов известно довольно много. Многие из них не являются аналогами фитогормонов или имеют весьма отдаленное сходство с ними. Механизмы и особенности их действия на растения изучены в недостаточной степени. Поэтому возникает задача исследования физиологических особенностей действия таких веществ на растения.

К эффективным, но малоизученным фиторегуляторам, созданным в последние десятилетия, относятся препараты эмистим, экост-ГФ, Краснодар-1 и Кавказ (Ненько Н.И., 1999; Ковалев В.М, 2003). Наряду с исследованием их действия на продуктивность и устойчивость растений огурца, важно изучить морфофизиологические показатели эффективности этих веществ, влияние на разные этапы онтогенеза. Целью настоящей работы является оптимизация применения регуляторов роста: а) при создании высокоэффективной системы клонального микроразмножения, регенерации и генетической трансформации in vitro растений ремонтантных форм малины; б) при разработке модельных систем для изучения молекулярных механизмов действия фитогормонов на разных этапах онтогенеза люпина; в) при разработке методов использования новых регуляторов роста и развития для увеличения продуктивности растений огурца.

При этом решались следующие задачи:

- разработка метода клонального микроразмножения ремонтантной малины: введение материала в культуру in vitro, оптимизация условий по-бего- и корнеобразования, разработка способов длительного хранения пробирочных растений;

- разработка системы регенерации растений ремонтантной малины из листовых дисков, а также метода молекулярно-генетического анализа на основе ISSR-PCR для изучения генетической стабильности регенерантов;

- разработка метода трансформации растений ремонтантной малины с использованием A. tumefaciens, доказательство его эффективности с помощью PCR и тест-системы на наличие лихеназной активности;

- разработка модельных систем для исследования молекулярных механизмов действия фитогормонов в онтогенезе на растениях люпина желтого с использованием прорастающих и созревающих семян;

- изучение эффективности новых синтетических регуляторов роста растений эмистим, экост-ГФ, Краснодар-1, Кавказ на разных этапах онтогенеза огурца и оптимизация их применения в условиях защищенного фунта для повышения продуктивности и устойчивости.

Научная новизна работы.

Впервые разработан метод клонального микроразмножения ремонтантной малины, при этом оптимизированы этапы введения материала в культуру in vitro, размножения и укоренения пробирочных растений и длительного сохранения клонов в пробирочных условиях.

Впервые показана способность регуляторов цитокининового действия структурного ряда дифенилмочевины - тидиазурона (TDZ) и N-(4-пиридил)-М-фенилмочевины (4-PU), индуцировать стеблевой морфогенез из цветочных почек, что позволило вводить в культуру in vitro новые формы ремонтантной малины в течение всего года.

Разработан метод регенерации растений из листовых дисков ремонтантной малины с применением 4-PU и TDZ, универсальный для различных генотипов. Стеблевой морфогенез наблюдается у всех исследованных форм - на уровне 3.3 - 96.0% в зависимости от генотипа.

Впервые разработан молекулярно-генетический метод анализа растений малины на основе ISSR-PCR. Показана генетическая однородность полученных регенерантов ремонтантной малины и их идентичность исходному образцу. Эффективность метода подтверждена путем проведения генетической паспортизации и построения дендрограмм генетического родства более 30 видов и сортообразцов малины.

Разработана система генетической трансформации ремонтантной малины методом кокультивирования листовых дисков с A. tumefaciens. Эффективность метода доказана с помощью PCR и тест-системы на наличие лихеназной активности.

Разработаны модельные системы с использованием семядолей прорастающих семян и незрелых зародышей люпина желтого, культивируемых in vitro, для изучения молекулярных механизмов гормональной регуляции процессов созревания и прорастания семян и экспрессии генов.

Впервые на люпине желтом показано, что АБК и 6-БАП влияют на РНК-полимеразную активность хроматина и степень его фосфорилирова-ния. Были выделены, частично очищены и охарактеризованы ядерные РНК-полимеразы I и II и показано, что с ними ассоциирована протеинкиназная активность, которая специфически активируется цитокининами с четко выраженной концентрационной зависимостью.

Впервые изучено физиологическое действие экологически чистых препаратов Кавказ, Краснодар-1, эмистим и экост-ГФ на разных этапах развития растений огурца в условиях защищенного грунта, показано их стимулирующее действие на рост, развитие и плодоношение растений. Определены оптимальные концентрации препаратов, повышающие продуктивность растений огурца в защищенном грунте на 9 - 17%.

Положения, выносимые на защиту:

1. Метод клонального микроразмножения in vitro ремонтантной малины с применением цитокининов TDZ и 4-PU для оптимизации этапов введения эксплантов в культуру in vitro и размножения пробирочных растений, обеспечивающий размножение образцов практически независимо от генотипа.

2. Системы регенерации ремонтантной малины из листовых дисков и ее трансформации методом кокультивирования с A. turn.

3. Метод молекулярно-генетического анализа малины для оценки генетической стабильности и однородности растений - регенерантов, а также для характеристики размножаемых ремонтантных форм.

4. Модельные системы с использованием изолированных семядолей проростков и незрелых зародышей люпина желтого для исследования молекулярных механизмов действия фитогормонов и регуляции экспрессии генов.

5. Способы применения регуляторов роста краснодар-1, кавказ и эмистим в условиях интенсивной технологии выращивания огурца в за щищенном грунте для повышения продуктивности растений и ее стабили зации.

Практическая значимость работы. Применение предложенных методов и технологий размножения in vitro ремонтантной малины обеспечило сокращение на 4 - 5 лет сроков селекции от получения элитной формы до передачи сорта в систему сортоиспытания, что особенно важно для ремонтантных генотипов, которые отличаются низким коэффициентом вегетативного размножения. В период с 1993 г. по 2004 г. размножено и передано селекционерам более 130 образцов и на этой основе ими создано 8 новых высокоурожайных, устойчивых к болезням и вредителям сортов ремонтантной малины. Клональное микроразмножение необходимо также для организации массового производства посадочного материала новых перспективных сортов этой культуры.

Применение экологически чистых препаратов эмистим, Краснодар-1 и Кавказ повышает продуктивность растений огурца в условиях интенсивного производства в защищенном грунте на 9 - 17%.

Таким образом, настоящая работа затрагивает различные аспекты применения регуляторов роста и развития растений в биотехнологии:

1. Применение ранее не использовавшихся для ремонтантной малины регуляторов роста ряда дифенилмочевины привело к разработке технологии клонального микроразмножения и регенерации растений этой культуры in vitro, что позволило резко ускорить создание новых сортов. Разработка методов генетической инженерии на основе эффективной регенерации растений in vitro открывает новые перспективы в селекции этой культуры.

2. Решение технологических проблем при возделывании огурца в защищенном грунте оказалось возможным при использовании экологически чистых препаратов эмистим, Кавказ и Краснодар-1, повышающих продуктивность растений на 9-17%.

3. Для исследования механизма действия фитогормонов и регуляторов роста перспективно применение модельных систем, созданных на основе культивируемых in vitro изолированных зародышей и семядолей люпина желтого, что важно для развития гормональной теории регуляции жизнедеятельности растений. 

Применение регуляторов роста и развития растений в современной биотехнологии

Регуляторами роста и развития растений (РРР) называются природные и синтетические органические вещества, которые воздействуют на процессы роста и развития, протекающие на разных этапах онтогенеза растений (Муромцев Г.С., 1979; Шевелуха B.C. и др, 1998). Эти вещества имеют различную химическую природу и происхождение, применяются в очень низких концентрациях (Дерфлинг К., 1985). Обработка ими приводит к изменению структуры растений или процессов жизнедеятельности, что в ряде случаев может выражаться в увеличении продуктивности или качества урожая (Мельников Н.Н., Баскаков Ю.А., 1962; Жукова П.С., 1976; Ковалев В.М., 1997). При этом низкие дозы препаратов могут вызывать весьма существенные сдвиги в развитии растений, формировании генеративной сферы, распределении ассимилятов, преимущественному развитию того или иного органа (Калинин Ф.Л., 1984).

Особое место среди регуляторов роста и развития занимают фитогормоны — природные вещества и их синтетические аналоги (Кулаева О.Н., 1973; Гамбург К.З., 1976; Полевой В.В., 1982). С помощью фитогормонов в растительном организме осуществляется взаимодействие клеток, тканей и органов. Фитогормоны необходимы для запуска и регуляции морфогене-тических и физиологических программ (Кефели В.И., 1984). Фитогормоны действуют в очень низких концентрациях и являются сравнительно низкомолекулярными веществами (Гудвин Т., Мерсер Э., 1986).

В настоящее время к фитогормонам относят 5 типов веществ, которые условно подразделяют на гормоны стимулирующего действия: ауксины, гиббереллины, цитокинины (Кулаева О.Н., 1973; Гамбург К.З., 1976; Муромцев Г.С. и др., 1987), и ингибирующего действия: абсцизовая кислота и этилен (Yang S.F., 1974; Walton D.C., 1980; Кефели В.И. и др., 1989).

Фитогормоны влияют на все процессы, происходящие в растениях: деление и растяжение клеток, их дифференциацию, рост, органогенез, цветение и плодоношение растений, покой почек и прорастание семян (Полевой В.В., 1989; Глазко В.И., Глазко Г.В., 2001). При этом определяющим фактором часто является не столько концентрация одного гормона, сколько баланс содержания в тканях различных фитогормонов.

Изучение воздействия фитогормонов на процессы, протекающие в растениях, является одним из основных направлений биотехнологии и имеет важное теоретическое значение (Шевелуха B.C. и др., 1998). Исследования, посвященные механизму действия фитогормонов, в том числе на молекулярном уровне, имеют фундаментальный характер и вносят вклад в развитие теории гормональной регуляции жизнедеятельности растений (Кулаева О.Н., 1982, 1999; Холл A.M. и др., 2002). Проведение этих работ требует использования методов биохимии, молекулярной биологии и молекулярной генетики, физиологии растений.

Важнейшим направлением современной биотехнологии, которое в значительной степени опирается на применение регуляторов роста, является культура клеток, тканей и органов растений in vitro (Бутенко Р.Г., 1964, 1979; Шевелуха B.C., 1998; Калашникова Е.А., 2001). Высокая специфичность действия фитогормонов в растениях позволяет широко использовать их для направленной регуляции развития растений в культуре in vitro, индуцируя с помощью гормонов разных классов деление клеток при каллусо-генезе или морфогенетические процессы, в частности, образование эм-бриоидов, побегов или корней. Используемые регуляторы роста определяют успешность введения в культуру in vitro новых видов и сортов растений, способность тканей растений к регенерации, скорость размножения (Катаева Н.В., 1981; Дорошенко Н.И., 1998). Поэтому совершенно обоснованы оптимизация применения фитогормонов в культуре in vitro, а также поиск новых регуляторов роста, что является весьма актуальной задачей и является составной частью современных наукоемких биотехнологий.

Характеристика объектов исследования

Огурец (Cucumis sativus L.) - однолетнее травянистое растение семейства тыквенных (Cucurbitaceae). В культуре огурец известен более 5000 лет, его родина - тропические районы Индии и Индокитая. Плод огурца употребляют в пищу в недозрелом состоянии зеленца (Брызгалов В.А. и др., 1983).

Плоды огурца обладают высокими вкусовыми и диетическими качествами. В плодах содержится 92-98% воды, 2-7% сухого вещества, 1-2,5% сахара, 0,6-1,1% белка. Количество минеральных солей калия, кальция, натрия, магния, а также иода составляет до 0,6 мг на 100 г плодов. Огурцы содержат редко встречающиеся в других овощах витамины группы В и С, различные протеиназы (Папонов А.Н., Захарченко Е.П., 1989). Плоды ароматны, вызывают аппетит, улучшают переваримость пищи, богатой белками.

Корневая система у огурца стержневая, от корневой шейки отходит основной, достаточно толстый - 5-8 мм - вертикальный корень. На глубине 5-10 см он разветвляется на более мелкие, горизонтально расположенные придаточные корни. Основная масса их размещается в слое 10-20 см. Корневая система обладает слабой регенерационной и усваивающей способностью. Она может поглощать питательные вещества лишь в легкодоступной форме и при достаточно высокой температуре.

Стебель огурца - ветвящаяся лиана. В зависимости от сорта и условий выращивания она сильно варьирует по длине (от 0,2-0,3 до 5-10 м). При выращивании в защищенном грунте широко применяется формирование растений. Его цель - максимально плотное их размещение на единице площади, эффективное использование фотосинтетической активности листьев. Некоторым сортам свойственно саморегулирование ветвления.

Листья огурца сердцевидные, угловато-сердцевидные, черешковые, расположены на стебле в очередном порядке (Болотских А.С., 1975).

Огурец в основном однодомное раздельнополое растение, на котором образуются мужские и женские цветки. Мужские расположены в пазухах листьев в виде многоцветковых соцветий (щитков). Женские образуются в узлах (1-2, реже 3-4 и более).

Огурец - перекрестноопыляемое растение. Пыльца липкая, склеенная в комочки, ветром не переносится. Опыление происходит при участии насекомых - пчел, шмелей, мух, бабочек, трипсов. У отдельных тепличных сортов плоды образуются без опыления, данное явление называется пар-тенокарпией.

Плод огурца - многосеменная ягода длиной от 5 до 70 см. В пищу употребляют недозрелые плоды - зеленцы, в возрасте 8-12 дней. Зеленцы варьируют по размеру, форме, окраске поверхности, опушенности. Количество собранных с растения зеленцов колеблется от 30 до 100 штук и связано с закономерностями формирования растения, площадью ассимиляционного аппарата и сортовыми особенностями.

Семена огурцов удлиненно-эллиптической формы, беловато-кремовой окраски. Масса 1000 семян равна 30-35 г (28-30 шт. в 1 г). Срок хранения семян при оптимальных условиях до 10 и более лет.

Семена огурца начинают прорастать при 12 -13 С, но наиболее благоприятной для прорастания является температура 25 - 30 С. Последующий рост и развитие проходят при температуре выше 15 С: растения огурца относительно медленно растут в первые две декады (период выращивания рассады), затем темпы роста резко возрастают, а с началом плодоношения снижаются.

Оптимизация применения регуляторов роста и развития растений при культивировании in vitro малины

В мировой и отечественной практике для селекционно-генетических исследований и ускорения создания новых высокопродуктивных и устойчивых сортов растений широко используются биотехнологические подходы, основанные на культивировании растений in vitro (Бу-тенко Р.Г., 1979; Дорошенко Н.П., 1999; Шевелуха B.C., 2002). Эти методы могут применяться не только для создания, но и для размножения новых сортов различных культур при их внедрении в производство (Вовк В.В., 2000; Джигадло М.И., 2003).

Одной из основных задач настоящей работы является разработка метода клонального микроразмножения ремонтантной малины с целью ускорения создания новых сортов и их массового размножения.

В начале 90-х годов, когда эта работа только планировалась, в литературе имелись данные о клональном микроразмножении неремонтантных сортов малины красной, черной и ежевики (Высоцкий В.А., 1986; Fiola J.A., Swartz H.J., 1986, 1990). Сведений о культивировании in vitro растений ремонтантной малины в литературе не было.

Поскольку успех клонального микроразмножения и регенерации в значительной степени зависит от генотипа размножаемого вида или сорта растений, то при разработке этих методов для ремонтантной малины возникли сложности, связанные с генетическими и физиологическими особенностями ее развития и плодоношения.

Ремонтантные гибриды малины характеризуются ранним плодоношением, ягоды формируются на побегах текущего года, и это определяет специфику культуры. Поскольку метаболизм растений направлен на развитие генеративной сферы, то основной объем ассимилятов потребляется молодыми растущими побегами и развивающимися плодоэлементами, в результате чего образование корневых отпрысков резко уменьшается. Это затрудняет вегетативное размножение ремонтантных образцов, значительно удлиняет период от выделения гибридов в элиту до передачи в сортоиспытание и ограничивает использование перспективных образцов в качестве родительских форм в селекции, уменьшая количество и объем комбинаций при скрещивании. Разработка метода клонального микроразмножения элитных форм ремонтантной малины позволяет снять эти ограничения и существенно сократить сроки выведения новых сортов.

При разработке методов культивирования растений in vitro основным оптимизируемым параметром является содержание фитогормонов в среде, их концентрации и комбинации. Для размножения большинства изученных видов растений чаще всего используется цитокинин 6-БАП в концентрации 0.5 - 10 мг/л, который индуцирует формирование первичного побега из различного типа эксплантов, а также образование адвентивных или пазушных побегов. Иногда для сложноразмножаемых культур применяют другие цитокинины, например, для рододендронов используется зеатин (8 мг/л) в сочетании с ИУК (2 мг/л). Укоренение пробирочных растений обычно проводят в присутствии ауксинов ИУК, ИМК или НУК в концентрации 0.1 -2.0 мг/л.

Для регенерации растений большинства изученных видов чаще всего используют сочетание цитокинина 6-БАП и ауксинов ИМК, ИУК или 2,4-Д, а в отдельных работах для получения регенерантов плодовых культур был использован тидиазурон.

При разработке методов клонального микроразмножения и регенерации ремонтантных форм малины в первую очередь были изучены традиционно используемые фитогормоны, при недостаточной их эффективности испытывались другие регуляторы роста.

Похожие диссертации на Оптимизация применения регуляторов роста и развития растений в биотехнологиях in vitro