Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы
1.1. Температура как экологический фактор 9
1.2. Стратегии температурных адаптации: пойкилотермия и гомойотермия 11
1.3 .Энергетический обмен тканей пойкилотермных и гомойо термних животных при гипотермии. 18
1.4.Свободнорадикальные процессы в тканях животных 23
1.5. Система антиоксидантной защиты клеток 34
1.6. Гипотермия в медицине и биологии 44
1.7. Сезонные изменения метаболизма амфибий. 48
ГЛАВА II. Экспериментальная часть
2.1. Обоснование выбора объекта исследования 53
2.2. Постановка экспериментов 53
2.2.1. Экспериментальные модели 53
2.2.2. Способы достижения состояний недельной гипотермии и самосогревания. 54
2.3. Препаративные методы исследования 54
2.3.1. Получение гомогенатов тканей 54
2.3.2. Получение сыворотки крови и гемолизата 55
2.4. Биохимические методы исследования 55
2.4.1. Определение суммарной антиокислительной активности 55
2.4.2. Определение антиоксидантной активности гидрофильных компонентов г. антиоксидантной системы 57
2.4.3. Определение активности каталазы 58
2.4.4: Определение содержания гемоглобина в гемолизате 60
2.4.5. Определение активности супероксиддисмутазы 61
Статистическая обработка экспериментальных данных 63
ГЛАВА III. Результаты эксперимента и их обсуждение
3.1. Исследование суммарной антиокислительной активности в тканях лягушки при недельной гипотермии и самосогревании 64
3.2. Исследование активности гидрофильных компонентов ан-тиоксидантной системы в тканях лягушки при недельной гипотермии и самосогревании 72
3.3. Исследование активности каталазы в тканях лягушки при недельной гипотермии и самосогревании 81
3.4. Исследование активности супероксиддисмутазы в тканях лягушки при недельной гипотермии и самосогревании 92
Заключение 101
Выводы 107
Литература 108
- Стратегии температурных адаптации: пойкилотермия и гомойотермия
- Система антиоксидантной защиты клеток
- Определение активности каталазы
- Исследование суммарной антиокислительной активности в тканях лягушки при недельной гипотермии и самосогревании
Введение к работе
Актуальность исследования. У аэробных; организмов митохондрии служат основным источником энергии.. Транспорт электронов по электрон-транспортной» цепи митохондрий, сопровождается генерацией супероксидного радикала на определенных ее участках. Малоактивный супероксидный радикал служит источником для генерации других более активных форм кислорода (АФК).
Резкие изменения физиологического состояния организма приводят к столь же резким изменениям энергетического обмена в клетках. При этом: происходит нарушение баланса между генерацией свободных, радикалов и активностью антиоксидантной; системы, а это приводит к интенсификации? свободнорадикальных процессов (СРП). В результате интенсивной генерации; свободных радикалов в= клетках происходит повреждение биомолекул (белков, нуклеиновых кислот, липидов), что приводит к: деструкции 1 клеточных структур и, даже, к гибели организма; [Соколовский,; 1988; Дубинина, 1989; Арчаков, Мохосоев, 1989].
Повреждающему действию > свободнорадикальных процессов противостоит антиоксидантная система, состоящая из водорастворимых и жирорастворимых антиоксидантов и ферментов антиоксидантной защиты, которая обеспечивает инактивацию АФК [Поберезкина, Осинская, 1989; Дубинина, 1992; Zwart et al., 1999].
Активность, и структура антиоксидантной системы в различных органах зависит от выполняемых ими физиологических функций, интенсивности в них энергетического обмена и других особенностей метабо-лизмаПозвоночные пойкилотермы эволюционно адаптированы к резким і из- -менениям температуры тела. В то же время известно, что интенсивность потребления кислорода организмом пойкилотермного животного существенно зависит от температуры тела [Зотин, 1988].Отсюда можно заключить, что интенсивность СРП может быстро изменяться вслед за энергетическим обменом. Это требует специальной адаптации для предотвращения вспышек СРП.
Действительно, несмотря на то, что пойкилотермы характеризуются более низким уровнем поглощения1 кислорода по сравнению с гомойотерма-мщ в клетках тканей пойкилотермных животных имеется достаточно мощная? антиокислительная- система* защиты- от свободнорадикальных процессов-[Ахмеров и др., 1995; Савина и др., 1997; Carey et al.,2000]:
В связи с этим изучение механизмов регуляции* уровня СРП1 в тканях пойкилотермных животных при, резких изменениях температуры тела представляет значительный* теоретический ш практический^ интерес. В' настоящей работе предпринято; исследование реакциш антиокислительной системы в тканях озерной лягушки; при гипотермии и последующем* самосогревании в летний и осенний сезоны года..
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение активности компонентов антиоксидантнои системы в* тканях различных органові (мозг, печень, почки, миокард, икроножная мышца и* кровь) озерных лягушек (Rana ridibunda) при недельной гипотермии;(4-5С)> с последующим самосогреванием (до 18-20?С) в разные сезоны года (летом и ? осенью);
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Исследовать изменение суммарной антиокислительной активности: в указанных тканях при гипотермии и самосогревании в различные сезоны, года.,
Исследовать изменение активности гидрофильных компонентов антиоксидантнои защиты в тканях лягушки\ при: гипотермии и«самосогревании: в различные сезоны года.
3; Изучить изменение активности? антиоксидантных ферментов супер-оксиддисмутазы; и каталазы в тканях лягушки прш гипотермии» т самосогревании в различные сезоны года.
Основные положения; выносимые на защиту.
1. Суммарная антиокислительная з активность, активность * гидрофильных компонентов антиокислительной системы и их реакция на изменение
7 температуры тела в разные сезоны года в тканях озерной лягушки отражают специфику физиологии и особенности метаболизма в них.
В тканях органов, составляющих «ядро» тела лягушки (мозг, печень, почка, миокард), гипотермия в летний сезон-повышает активность каталазы и-супероксиддисмутазы вследствие резистивной стратегии адаптации в этот сезон года. В: этих же тканях у осенних лягушек гипотермия вызывает снижение активности этих ферментов вследствие смены адаптивной стратегии на толерантную.
Однонаправленное изменение активности каталазы и супероксиддисмутазы (СОД) при' гипотермии в ткани і икроножной мышцы и эритроцитах летом и осенью обусловлено тем, что обе ткани можно рассматривать как. периферические и, следовательно, более пойкилотермные.
Обратимость изменений активности каталазы.и СОД в цикле «гипотермия-самосогревание» указывает на то, что в основе регуляции активности этих ферментов лежат механизмы срочной адаптации.
Научная новизна. В настоящей работе впервые проведены систематические исследования активности как компонентов антиокислительной системы, так и ферментов антирадикальной защиты в тканях озернош лягушки в различные сезоны года при гипотермии и самосогревании.
Впервые обнаружено различие в реакции ферментов антиокислительной защиты при гипотермии и; самосогревании в летний и осенний- сезоны года, что указывает на смену стратегии! температурной адаптации при подготовке к гипобиозу.
Теоретическая и практическая значимость.. Полученные данные представляют интерес для понимания механизмов взаимодействия антиокси-дантной системы и свободнорадикальных процессов, и формирования адаптационных механизмов у пойкилотермных организмов при холодовом: воздействии и последующем самосогревании в различные сезоны года, когда животное находится в различных физиологических состояниях.
Открытие механизмов взаимодействия антиоксидантной системы и с
8 свободнорадикальных процессов у пойкилотермов открывает перспективы моделирования и использования методов предотвращения негативных эффектов свободнорадикальных процессов в медицинской практике, при лечебных гипотермических процедурах как хирургического, так и терапевтического лечения и трансплантологии.
Материалы, полученные при выполнении данной диссертации, используются в учебном процессе, осуществляемом кафедрой биохимии Дагестанского госуниверситета, при чтении ряда спецкурсов, а методические элементы работы при проведении больших практикумов.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 6-ой Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 20-24 мая 2002), на XVII научно-практической конференции по охране природы Дагестана (Махачкала, 2003).
Публикации. По материалам данного исследования опубликовано 5 работ.
Стратегии температурных адаптации: пойкилотермия и гомойотермия
Температурные воздействия являются важнейшим элементом сложных климатических и погодных влияний на все без исключения организмы. Поэтому у разных животных выработались различные стратегии температурных адаптации.
Исследование температурных адаптации у животных выявило три ос 12 новные стратегии терморегуляции: пойкилотермия; гомойотермия и гетеро-термия [Слоним, 1986]. Пойкилотермия означает вариации температуры тела, вслед за измене-ниями-температурывнешнейсреды. В-отсутствие специальных механизмов,-при снижении температуры тела вслед за температурой окружающей среды могло бы приводить к замедлению химических и физических процессов, а это должно было бы приводить к соответствующему изменению и физиологической активности, и животное не могло бы адекватно реагировать на изменения окружающей: среды. Поэтому у пойкилотермов в ходе эволюции сложились специальные механизмы температурной;компенсации [Майстрах, 1981; Слоним, 1986; Хочачка, Сомеро, 1988]. Суть температурной компенсации заключается в поддержании на постоянном: уровне физиологической активности в широком диапазоне температур тела [Слоним, 1986]. В- основе г температурной компенсации: физиологических функций лежат особенности температурной зависимости кинетических характеристик ферментов. Несмотря» на ингибирующее действие снижения температуры тела, ферментативный аппарат клетки сохраняет функциональную активность и способность, снабжать, процессы веществом и энергией. У пойкилотермов температура тела может изменяться в течение суток на:10-15С. При этом скорость физиологических процессов изменяется несущественно. То есть благодаря такой температурной-компенсации интенсивность метаболизма у них сравнительно мало зависит от температуры окружающей среды [Хочачка, Сомеро, 1988]; Изучение молекулярных основ температурной компенсации у пойкилотермов показало, что с увеличением температуры сродство фермента к; субстрату у ряда ключевых ферментов энергетического обмена уменьшается. Это явление получило название положительной модуляции [Хочачка, Соме-ро, 1977]; Положительная модуляция приводит к уменьшению зависимости скорости реакции от температуры, что соответствует температурной, компенса 13 ции. Тем не менее, температурный уровень жизнедеятельности холоднокровных организмов далеко не безразличен для их организма и имеет границы- оптимальности. Следовательно, должны- существовать и какие-то температурные механизмы, обеспечивающие эту оптимальность. Холоднокровные организмы способны к температурной коррекции, которая выражается в изменении газообмена и І повышении двигательной активности [Слоним, 1986]. Произвольные движения рассматривают как вспомогательный аккомпанемент механизма терморегуляции. Изучение этого вопроса было начато еще в 60-х годах на озерных лягушках. Оказалось, что в температурных диапазонах оптимальной жизнедеятельности амфибий (от 20; до 16С) какие-либо термогенные реакции не возникали. Но периодически отмечались кратковременные (1-1,5 с), спонтанные возбуждения (вздрагивания). Снижение ректальной температуры до 15-20С и ниже вызывало значительное уреже-ние сердечных сокращений, а продолжительность «спонтанных» возбуждений возрастала до 30-50 с. Согревание лягушек сопровождалось фактически зеркальным изменением всех указанных сдвигов в обратной последовательности [Ларин, Тимофеев, 1969]. При изучении влияния-более глубокого охлаждения, сопровождающегося замерзанием тела амфибий, были выявлены совершенно иные термогенные реакции, которые характеризовались фибриллярным, тремором мышечной ткани. Эти фибрилляции не воспроизводились рефлекторно, развивались! совершенно «спонтанно» и продолжались 5-10 мин. После каждого последующего «приступа» подобных фибрилляций не только кожа, но и мышечная ткань становилась все более ригидной. В конечном счете, термогенные возможности исчерпывались, наступал необратимый процесс замерзания ткани. Установлено, что продолжительные фибрилляции мышечной ткани возникают независимо от центральной нервной системы (ЦНС) и, по-видимому, служат периферической защитной реакцией от замерзания самой мышечной ткани и возникают по механизму аксон-рефлекс [Тимофеев, Про-копьева, 1997]. Исследование механизмов температурной компенсации у пойкило-термных животных показало следующее: 1. при; акклимации к различным температурам окружающей среды наблюдается изменение изоферментного спектра; 2. некоторые ферменты приобретают специфические температурные зависимости активности [Хочачка, Сомеро, 1988]. Компенсаторные изменения характерны для ферментов, связанных с выработкой энергии; ферменты, участвующие в деградации; метаболитов, часто не обнаруживают компенсаторных изменений, а иногда их активность изменяется в противоположном направлении [Проссер, 1977]. Ферментативная активность регулируется: Г. изменением концентрации t существующих ферментов (количественная стратегия); 2. изменением самого набора ферментов, имеющихся в данной системе (качественная стратегия); 3. модуляцией активности1 существующих ферментов (модуляционная стратегия) [Хочачка, Сомеро, 1988]. Так, А.А. Никитина и Н.М. Тимофеева выяснили, что щелочная фосфатаза существует в двух формах - мембранной и растворимой, что обеспечивает успешное протекание жизненно важных процессов \ при всех изменения температуры среды обитания. При чем эти формы фермента отличаются не; только локализацией, но и многими другими характеристиками, в частности существенной разницей температурных максимумов активности, а также кинетических констант ( Кт и Vmax) [Никитина, Тимофеева, 1997].
Система антиоксидантной защиты клеток
В ходе эволюции в организме образовалась сложная;многокомпонентная антиоксидантная система (AOG), которая препятствует проявлению повреждающего действия свободных радикалов и перекисных соединений, обеспечивая связывание и модификацию радикалов, предупреждая образование или разрушение перекисей [Соколовский, 1988].
Защита организма осуществляется двумя путями: 1. снижением образования АФК - путем уменьшения Ог в клетке или более быстрого использования дыхательной цепью; Т. функционированием АОС [Скулачев, 1996; Кулинский, 1999]; АОС — это сложная многокомпонентная система, которая- состоит из ферментативной и неферментативной частей. В состав ферментативной части АОС входят ферменты, которые представляют собой 3 линии защиты [Кулинский\ 1999]: 1. супероксиддисмутаза (СОД); 2. селеновая глутатионпероксидаза (ГПО) и каталаза; 3. ГПО и глутатионтрансфераза. СОД (КФ 1.15.1.11) является единственным? среди известных антиок-сидантных ферментов, непосредственно І обеспечивающий і обрыв цепей кислород— зависимых реакций в клетках аэробных организмов. Она осуществляет рекомбинацию радикалов 0\ с образованием Н2О2 и триплетного Ог Существует, несколько , изоформ СОД с широким диапазоном действия рН фермента — от 4,8 до 10,2, что свидетельствует о его важной роли у аэробных организмов [Дубинина 1989; Поберезкина, Осинская 1989]; 1. Си,Еп-СОД чувствительная; к цианиду, локализована в основном в ци-тозоле и в небольших количествах в межмембранном пространстве митохондрий. . В цитоплазме эукариот эти ферменты; присутствуют в виде димеров. Каждая субъединица содержит атом меди иатом цинка. Причем, главное значение здесь имеют атомы; меди, в то время как атомы. цинка играют стабилизирующую роль [Desideri, Falconi; 2003]; 2. Mn-СОД- цианидрезистентная, содержащаяся в основном в митохонд-риальном матриксе и бактериях и играющая главную роль в первой линии защиты [Поберезкина, Осинская, 1989; Зенков; Меньшикова, 1993; Fridovich, 1995; Okado, Fridovich, 2001]. 3. Этот фермент с молекулярным весом 40.000 содержит два атома Мп (III).. Ионы Мп в молекуле СОД і в ходе катализа реакции совершают переходы между состояниями окисления Мп (II) и Мп (III) [Мецлер, 1980; Borgstahl et all, 1992; Sun, 2001]. 4. Существует также Fe-СОД; которая была обнаружена у микроорганизмов. Fe-СОД состоит из разноидентичных субъединиц с молекулярным весом — 35.000.и.содержитодин атом;Ре-на мо л екулу.-Металлы выполняют основную каталитическую функцию, последовательно восстанавливаясь : и окисляясь в активном центре фермента [Мецлер, 1980; Beiluo, Kaixian, 1993]; Супероксиддисмутаза содержится во всех тканях. СОД обнаружена также во внеклеточном пространстве. Внеклеточная экстрацеллюлярная СОД обнаружена в плазме, лимфе, синовиальной? жидкости, моче,, в пищеварительных секретах (соке поджелудочной железы, двенадцатиперстной» кишке, желчи) [Переслегина, 1990;. Дубинина и др., 1992; Зенков, Меньшикова, 1993]. Синергистом СОД в клетке является каталаза; препятствующая накоплению продукта супероксиддисмутазной реакции - перекиси водорода- ингибитора СОД [Поберезкина, Осинская, 1989]. Каталаза (КФ 1.11.16) — гемсодержащий фермент, локализованный преимущественно в клетках, богатых пероксисомами. Каталаза - основной; фермент, расщепляющий; Н2О2 в пероксисомах [Абрамова; Оксенгенлер, 1985]. Он также обнаружен в митохондриях сердечных, клеток [Radi et al.,. 1991 ], но не был обнаружен в митохондриях других тканей, включая скелетную мышцу [Phung et aL, 1994]. Найденкак у прокариот, так ,и у эукариот. Обладает, бифункциональной активностью и при высоких концентрациях может разлагать Н2Ог до Н20 и триплетного кислорода (каталазное действие),. а при низких концентрациях перекиси водорода катализируют окисление перекиси различных экзо - и эндогенных субстратов (т.е. оказывает перокси-дазное действие) [Мецлер,1980; Ленинджер, 1985; Абрамченко и др., 1995]. Каталаза? очень скоростной фермент. Одна ее, молекула разлагает 40.000 молекул Н2О2 в секунду. Она функционирует почти в 104 раз быстрее,, чем пероксидаза [Мецлер, 1980; Ленинджер, 1985]..Максимум ферментативной активности каталазы находится между 25 и 30 С. При увеличении температуры с 5 до 25С скорость ферментативной реакции возрастает в 1,5 раз [Комов, Шмелев, 1976]. Также как и для СОД, для каталазы характерно наличие изоформ. Так, в эритроцитах человека идентифицированы три формы каталазы [Комов, Рахманина, 1974]. Ферментами, которые последовательно восстанавливают 0\, Н2О2 и органические гидроперекиси, являются глутатионпероксидаза (ГПО) и глута-тионтрансфераза (ГТ) [Соколовский, 1988]. Глутатионпероксидазы катализируют реакцию между восстановленным глутатионом и гидроперекисями жирных кислот, обезвреживая последние путем их превращения в жирные оксикислоты: Кроме того, одна из глутатионпероксидаз (Se-зависимая) разрушает перекись водорода: Окисленный глутатион восстанавливается глутатионредуктазой с использованием NADPH, образующегося в пентозофосфатном цикле [Кулин-ский, 1999]. Хотя вклад каталазы и ГПО в восстановление Н202 одинаков, для клетки в целом ГПО значительно важнее. Это аргументируется следующими фактами: 1) каталаза сосредоточена в основном в пероксисомах, а ГПО обезвреживает Н202 в цитозоле и митохондриях [Панченко и др., 1981]; 2) сродство ГПО к Н202 выше, поэтому именно ГПО защищает от чаще возникающих низких концентраций Н202; 3) недостаточность или ингибирование ГПО (но не каталазы) приводят к увеличению пероксидации и повреждению клеток; 4) в некоторых тканях (сердце) каталаза почти отсутствует и тогда ГПО играет главную роль-в валовом метаболизме Н2О2 [Кулинский, Колесниченко, 1990]; Глутатионтрансферазы (ГТ) восстанавливают только гидроперекиси, но важно, что один, из изоферментов, находящихся в хроматине, восстанавливает гидроперекиси ДНК в ядре - играет роль фермента репарации. Восстановление ГПО и ГТ, гидропероксидов предупреждает прогресси-рование пероксидации и появление ее вторичных метаболитов [Панкин, 1984]. В общей глутатионпероксидазной активности в цитозоле основное значение имеет ГПО (68%), а в ядрах — ГТ (86%) [Колесниченко, Кулинский, 1989; Кулинский, Колесниченко, 1990]. Фосфолипидпероксидаза восстанавливает гидроперекиси жирных кислот в составе фосфолипидов [Кулинский, 1999]. Активность и стабильность каждого из ферментов антиоксидантной системы взаимозависимы [Дубинина; 1989]: известно, что супероксидный анион подавляет активность каталазы и глутатионпероксидазы, а пероксид; водорода вызывает фрагментацию СОД [Lee Mi Hye, Park Jeen-Woo, 1995] и инактивирует глутатионпероксидазу; образующийся, НО разрушает практически все белки [Дубинина, Шугалей, 1993].
Определение активности каталазы
Результаты измерения суммарной антиокислительной: активности (АОА) BJ тканях і озерной лягушки в летний период приведены в табл.1 и рис.1. При температуре тела 23-25С у контрольных животных то есть у животных, находящихся при І температуре окружающей среды 25-27С, уровень суммарной; АОА заметно; различен в исследованных тканях. Наибольшая АОА обнаружена в миокарде, печени, икроножной мышце. В сыворотке крови, мозге и почке эта активность заметно ниже, чем у выше указанных органов. Чем обусловлены эти различия?
Основу АОА тканей составляют химические соединения, обладающие низким окислительно-восстановительным потенциалом (восстановители). Среди них наиболее важное значение имеют аскорбиновая кислота, тиоловые соединения (глутатион, SH - группы белков, цистеин), витамин Е, ряд пептидов (карнозин, гомокарнозин) и др. [Соколовский, 1988; Дубинина;.1992].
Соответствующие окислительно-восстановительные пары под действием ферментов или в результате прямого взаимодействия могут обмениваться г. восстановительными эквивалентами, образуя единый пул восстановительных; эквивалентов, находящихся в клетке. Величина суммарной АОА отражает, по сути, способность этих соединений взаимодействовать с радикалами линоле-новой кислоты, образующимися! при ее окислении активными формами кислорода, основным из которых является ОН - радикал - сильный окислитель [Арчаков, Мохосоев, 1989; Fridovich,1998; Chen, Schopher, 1999; Ни; 2001]!
Поскольку константы взаимодействия различных: компонентов АОС с ОН - радикалом различаются, то суммарная: АОА может зависеть не только от их общего количества; но и от соотношения«количеств различных восстановителей в клетке. Однако столь большие различия АОА в разных тканях, скорее всего, обусловлены различием (общей і концентрации восстановительных эквивалентов в исследованных тканях. Чем же определяется и от чего зависит концентрация восстановительных эквивалентов в тканях? Если предположить, что концентрация восстановительных эквивалентов коррелирует с уровнем интенсивности свободнорадикальных процессов в-ткани, то чем интенсивнее в ткани идут окислительные процессы, тем выше: должна быть концентрация: восстановительных эквивалентов, необходимых для предотвращения цепных реакций окислительного повреждения биомолекул (белков, липидов, нуклеиновых кислот). Но такому предположению противоречит тот факт, что суммарная АОА в икроножной мышце находится на уровне печени и миокарда, хотя, как известно в мышце интенсивность окислительных : процессов значительно ниже вследствие плохой васкуляризации; [Шмидт, Тевс, 1986] и, соответственно, низкой концентрации кислорода в клетках мышечной ткани. Исходно в клетках всегда высока концентрация восстановительных эквивалентов и значительно меньше окислителей [Сент-Дьёрди, 1960]: Поэтому можно» предположить, что уровень восстановительных эквивалентов в клетке отчасти зависит от интенсивности окислительных процессов: Так, чем выше скорость окислительных процессов в клетке, тем ниже должен быть, уровень восстановительных эквивалентов. С этим предположением согласуется тот факт, что в тканях мозге, почке ив сыворотке крови суммарная АОА ниже, действительно интенсивность окислительных.процессов в мозге и почке весьма высока, при чем за счет аэробного энергетического обмена. В сыворотке крови интенсивность СРП тоже может быть довольно высокой, так как кровь является как переносчиком кислорода, так и тканью; содержащей высокую концентрацию1 железа, который является промотором свободнорадикальных процессов [Козлов и др., 1987; Владимиров, 1989; Меныцикова, Зенков, 1997]. Используя последнее предположение в качестве рабочей гипотезы, перейдем к анализу результатов по влиянию недельной гипотермии на суммарную АОА в тканях озерной лягушки. Из табл. Г и--рис.1; видно, что недельная гипотермия привела к существенному увеличению АО As в мозге и почке. Исходя из выше высказанного предположения, это можно объяснить тем, что при низких температурах интенсивность окислительных процессов в мозге и-почке подавляется, а; уровень восстановленных эквивалентов соответственно возрастает. Уровень АОА в сыворотке крови не изменяется, возможно, потому, что этот уровень определяется не интенсивностью, метаболизма, асодержанием кислорода и железа. В тоже время в печени недельная гипотермия вызвала заметное снижение АОА по сравнению с контролем. Это уменьшение можно объяснить тем,. что уровень метаболизма снижен, и снижается не: только- аэробный, но и анаэробный метаболизм. Изменения в икроножной мышце и t миокарде невелики и противоположны по направлению. Эти различия можно объяснить различным соотношением аэробного и анаэробного s метаболизмов в І ЭТИХ тканях: в миокарде уровень аэробного метаболизма выше, чем в икроножной мышце [Бобырев и др.,,1994]; После самосогревания, за короткое время (15-20; минут) суммарная АОА в мозге практически не изменилась по сравнению с недельной гипотермией., В печени величина суммарной АОА увеличилась, стремясь к контролю, в. почке наоборот она снижается, также стремясь к уровню контроля. В икроножной » мышце ис миокарде изменения статистически; недостоверны і по сравнению с недельной? гипотермией, в; то время как в; сыворотке крови; суммарная АОА заметно возросла;,
Исследование суммарной антиокислительной активности в тканях лягушки при недельной гипотермии и самосогревании
Каталаза в клетках мозга локализована экстрамитохондриально [Zhouz, Kang,2000]; тем не менее; она защищает митохондриальнуюДНК от образования однонитчатых разрывов: Известно, что супероксидные радикалы генерируются і в клетках мозга внутримитохондриально, там же, следовательно, происходит образование НгОг, однако митохондриальная деградация ЩОг осуществляется главным \ образом. вследствие: активности глутатионперокси-дазы, а также неспецифического катализа ионами металлов і переменной! валентности [Warner et ah, 2004].
Поскольку роль каталазы в разных тканях неодинакова; то и изменение; её активности І отражает различные изменения, происходящие в различных звеньях метаболизма клеток при изменении физиологического состояния животного.
Можно предположить, что изменение активности фермента; в печени, определяющаяся активностью пероксидациш при гипотермии-самосогревании, обусловлено изменением интенсивности окисления жирных кислот, в пероксисомах, в то времякак изменение активности каталазы в мозге обусловлено изменением активности» катехоламинэргической-синаптической передачи [Cadenas, Davies, 2000].1
Недельная гипотермия увеличивает активность каталазы в мозге, печени, почке и миокарде (табл.5, рис.7). Поскольку гипотермия подавляет обменные процессы во всех тканях, то увеличение активности каталазы невозможно объяснить увеличением образования Н2С 2. Трудно объяснить увеличение активности этого фермента и синтезом этого фермента de novo, так как. при низкой температуре все процессы биосинтеза биополимеров подавлены [Storey, 1996; Storey, 2001; Boutilier, 2001]. Таким образом, остаётся одна возможность — повышение активности тех молекул, которые уже имеются в клетке. Но тогда это означает, что не все молекулы каталазы, присутствующие в клетке, активны при высокой температуре ткани. Часть из них, видимо, находится в неактивной форме. В связи с этим интересно отметить, что увеличение активности каталазы происходит как в мозге, так и в печени, хотя роль и локализация этого фермента в этих тканях различная, а количество фермента (активность) в мозге почти в 1000 раз меньше, чем в печени. Увеличение активности в этих тканях при недельной гипотермии тоже примерно одинаково и составляет 20j 38, 33, 25% в мозге, печени; почке и миокарде соответственно. Одной из возможных причин является изменение окислительно-восстановительного статуса фермента, поскольку окислительные процессы тормозятся, то уровень восстановителей должен расти. Если при этом восстанавливаются важные для катализа сульфгидрильные группы, то активность фермента должна увеличиваться. Однако согласно нашим данным, суммарная АОА в печени, например, снижается при гипотермии на 40%), в то время как. активность каталазы при недельной- гипотермии возрастает на 38%. Следовательно, необходимо искать другие.механизмы обратимой инактивации активности каталазы.
В отличие от перечисленных выше тканей активность каталазы в икроножной мышце и без того низкая, ещё больше снижается; (в 5,5 раз) при гипотермии (табл.5, рис.7). В.икроножной-мышце, вследствие отсутствия пе-роксисом, образование перекиси может происходить в цитозоле в результате ксантиноксидазной реакции. Возможно, при гипотермии повышается концентрация оксида азота — фактора релаксации [Stamler, Meissner, 2001], который, в свою очередь, связываясь с каталазой подавляет её активность. Снижается активность каталазы ив. эритроцитах (на 28%). Снижение активности каталазы в эритроцитах также связано с высоким накоплением в них NO при недельной гипотермии. Самосогревание снижает активность каталазы в мозге по сравнению с недельной гипотермией, возвращая её примерно к контрольному уровню. Аналогичные изменения происходят также в печени, почке и миокарде: Различие состоит в том, что в то время как в мозге активность каталазы при самосогревании становится меньше, чем в контроле, в печени, почке и миокарде активность. каталазы остаётся несколько выше контроля. Таким образом, самосогревание обращает изменения; вызванные недельной гипотермией; Викроножной мышце и эритроцитах самосогревание увеличило активность каталазы по сравнению с недельной гипотермией, приближая её к контрольному уровню (табл.5, рис.7). То есть, изменения в икроножной мышце и эритроцитах при недельной гипотермии? и самосогревании противоположны изменениям в мозге, печени; почке и миокарде. Однако общим для всех исследованных тканей является то, что; во всех тканях недельная гипотермия вызывает изменение активности фермента, а самосогревание обращает эффект, вызванный недельной гипотермией. Каталаза является ферментом антиокислительной защиты, следовательно, изменение её активности! вызвано изменениями окислительно-восстановительных процессов. Поскольку окислительные процессы при,гипотермии снижаются; а при согревании увеличиваются,, эта общая закономерность не вызывает удивления. Однако всё же остаётся невыясненным тот факт, почему изменения, вызванные состоянием недельной гипотермии и самосогреваниям эритроцитах и икроножной мышце противоположны изменениям в мозге, печени, почке и миокарде. Икроножную мышцу и кровь можно отнести к периферическим тканям, в то время как мозг, печень, почку и миокард можно отнести к «ядру» тела, то есть к внутренним органам [Проссер, 1977; Хочачка, Сомеро, 1988]. В периферических тканях в первую очередь происходят изменения температуры при изменении .температуры окружающей среды, а затем уже эти изменения происходят и во внутренних органах. Возможно, в этом и заключаются различия.в, реакции.различных тканей на изменение температуры окружающей среды.. В табл.6 и рис. 8,9 приведены данные по активности каталазы в тканях лягушки при недельной гипотермии, самосогревании в осенний период.
