Введение к работе
Актуальность проблемы. Значительный прогресс в исследовании молекулярных механизмов, обеспечивающих избирательность экспрессии генов эукариот, был достигнут благодаря изучение белков, взаимодействующих со специфическими последовательностями ДНК. В последние годы стало очевидным, что регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции осуществляется белковыми факторами, узнающими специфические последовательности в регуляторних элементах генов. Однім из условий функционирования этих белков является доступность их сайтов связывания в хроматине регуляторных областей EFelsenfeld, 19923
Структура хроматина регуляторных областей индуцибельных гормон-зависимых генов устанавливается в процессе развития на стадиях, предшествующих экспрессии, и поддерживается в ходе клеточных генераций. Исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе структурных перестроек хроматина при подготовке генов к транскрипции, носят описательный характер, причинно-следственные отношения между структурными и функциональными изменениями в хроматине не установлены. Известно, что показателем подготовленности гена к ответу на регуляторний сигнал (компетенции к транскрипции) является присутствие в хроматине регуляторных областей специфических участков гиперчувствительности (конститутивных ТЧУ) к различным нуклеазам, появление которых не зависит от действия индуктора [Gross, Garrard, 1988]. В этих участках нуклеосомы либо отсутствуют, либо модифицированы, вследствие чего специфические последовательности ДНК становятся доступными для регуляторных белков. Процессы, происходящие в структуре хроматина гормон-зависимых генов в состоянии компетенции к транскрипции и факторы, обуславливающие это состояние, практически не изучены. В разработке этого направления представляется перспективным поиск и изучение факторов, детерминирующих структурную организацию хроматина гормон-зависимых генов и обуславливающих компетентное к транскрипции состояние этих генов. Одним из подходов к решению этих вопросов, на наш взгляд, является поиск этих факторов среди белков', специфически взаимодействующих с последовательностями ДНК конститутивных гиперчувствительных участков хроматина.
В качестве объекта для исследования мы выбрали гормон-зависимый ген триптофаноксигеназы [К.Ф.1.13.11.11] крысы (ТО). Ген ТО экспрессируется преимущественно в печени под контролем глюкокортикоидных гормонов. В хроматине 5'-фланкирующей области этого гена идентифицированы три конститутивных участка гиперчувствительности к ДНКазе 1, характеризующие компетентное к транскрипции состояние гена [Becker е.а.. 1984]. Эти участки формируются в процессе развития и их появление не зависит от действия индуктора. Аналогичные гиперчувствительные участки не обнаружены в тканях, в которых ген ТО не активен.
Дели и задачи исследования. Предлагаемая работа посвящена поиску и идентификации белковых факторов гена триптофаноксигеназы, специфически связывающихся с фрагментами регуляторної! области , содержащими последовательности, гиперчувствительные к ДНКазе і в хроматине печена крыс. С этой целью мы выбрали фрагменты от -466-го до -292-го и от -292-го до -178-го нуклеотида 5'-фланкирующей области гена, содержащие последовательности отдельных гиперчувствительных к ДНКазе 1 участков в хроматине печени (рис.1). Были поставлены следующие задачи:
-
Выявить в ядерных экстрактах печени белки, специфически связывающиеся с фрагментами от -466-го до -292-го и от -292-го до -178-го нуклеотида 5'-фланкирующей области гена ТО
-
Провести очистку выявленных белков.
-
Сопоставить обнаруженные белковые факторы с известными транскрипционными факторами, описанными дія генов, зкс-прессирующихся в печени.
Научная новизна и теоретическая ценность работы. В работе представлены новые данные о белках, специфически взаимодействующих с регуляторной областью (от -465-го до -178-го нуклеотида) гена ТО. Впервые показано, что белки, относящиеся к семейству ядерных факторов 1 (NF1). образуют специфические комплексы с фрагментами этой области гена.
Проведенное исследование носит фундаментальный характер. Полученные нами данные развивают имеющиеся яредставления о структурно-функциональной организации индущЛельных гормон-зависимых генов и белковых факторах, участвующих в спе-
пифической организации хроматина регуляторних областей этих генов в компетентном к транскрипции состоянии. Наши результаты подтверждают имеющиеся данные о том, что транскрипционные факторы семейства NF1 являются компонентом регуляторной системы многих эукариотических генов.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научных семинарах лаборатории химии белка и кафедры биохимии Санкт-Петербургского государственного университета, на 13-м европейском совещании "Клеточное ядро" (Венгрия. 1993), на X и XI Всероссийском симпозиуме "Структура и функция клеточного ядра" (Гродно. 1990; Санкт-Петербург. 1993).
Публикации. По теме диссертации опубликовано б работ.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, включая 22 рисунка и 3 таблицы, список литературы включает 163 работы.
