Введение к работе
Актуальность темы. Рак желудка (РЖ) в России занимает одно из ведущих мест в общей структуре онкологической заболеваемости и второе место среди опухолей желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). У 75%) первично выявленных больных заболевание диагностируется в III—IV стадии, что предопределяет неудовлетворительные результаты лечения. Частота обнаружения ранних форм РЖ не превышает 10-20%), а у 83% больных при первично выявленной злокачественной опухоли уже существуют регионарные метастазы [Симонов Н.Н. и соавт, 2001]. В связи с отсутствием каких-либо специфических клинических проявлений диагностика раннего РЖ должна быть основана исключительно на применении фиброгастроскопии с биопсией в качестве метода скрининга. В Японии, где давно практикуется эндоскопический скрининг ЖКТ, выявляемость раннего РЖ наиболее высокая в мире (54-56%). Однако при тяжелой дисплазии в условиях хронического воспаления, при подслизистом опухолевом росте, а также при изъязвленной опухоли, покрытой некротическим налетом, сложно объективно трактовать морфологические изменения слизистой. В этом случае большие надежды возлагают на использование молекулярно-биологических методов диагностики с целью выявления эффективных онкомаркеров.
Эпителий желудка относится к тканям, которым свойственно непрерывное клеточное обновление. В основе возникновения изменений в слизистой желудка, приводящих к развитию рака, лежит дисбаланс между апоптозом и пролиферацией клеток [Маев И.В. и соавт, 2006].
Среди белков, ингибирующих апоптоз, ключевую роль играет сурвивин. Его экспрессия обнаруживается в большинстве видов опухолей, в то время как в нормальных тканях она практически не детектируется. Экспрессия гена сурвивина, по разным данным, обнаруживается в 35 - 82% опухолей желудка [Meng Н. et al., 2004, Krieg A., et al., 2002, Da C.L., et al., 2009] и ассоциируется с неблагоприятным прогнозом заболевания.
В случае диффузного РЖ одним из ведущих событий в канцерогенезе считается мутация Е-кадгерина [Имянитов Е.Н., 2009]. Металлопротеиназа ММР-7 (матрилизин) инициирует эпителиально-мезенхимальный переход в ткани желудка путем протеолиза Е-кадгерина, что приводит к дистантным метастазам [Yin Y. et al., 2010]. Особенностью ММР-7 является то, что она экспрессируется
самими опухолевыми клетками и участвует в развитии рака, начиная с его ранних стадий [II М., 2006].
Замечено, что в ряде интестинальных опухолей желудка наблюдается повышенная экспрессия циклооксигеназы-2 (СОХ-2), при этом в нормальной ткани желудка она отсутствует или находится на низком уровне [Samaka R.M., 2006]. Гиперэкспрессия СОХ-2 в злокачественных опухолях определяет устойчивость к апоптозу, усиление пролиферативной активности клеток, инвазивность, ангиогенез и метастазирование [Konturek Р.С. et al., 2005]. В настоящее время клиническая значимость указанных выше онкомаркеров для диагностики РЖ только начинает изучаться.
Цель исследования - оценить значимость определения уровней экспрессии мРНК сурвивина, ММР-7 и СОХ-2 в различных областях слизистой желудка для повышения эффективности диагностики РЖ и для установления границ распространения опухоли.
Задачи исследования.
-
Оптимизировать условия проведения анализа экспрессии гена сурвивина методом совмещенных реакций обратной транскрипции и ПЦР (ОТ-ГЩР) на различном клеточном и клиническом материале.
-
Провести анализ относительной экспрессии мРНК генов сурвивина, СОХ-2 и ММР-7 методом ОТ-ГЩР в клинических образцах слизистой от пациентов с аденокарциномой желудка, взятых из опухоли и на расстоянии 2, 5 и 8 см от её видимой границы.
-
Сопоставить уровни экспрессии выбранных онкомаркеров с основными клиническими показателями и морфологическими характеристиками опухоли у больных РЖ.
-
Оценить с помощью ROC-анализа значимость предложенных онкомаркеров для диагностики РЖ и выбрать те из них, которые имеют наилучшую диагностическую эффективность.
Научная новизна исследования. Впервые проведено одновременное комплексное исследование относительных уровней экспрессии генов сурвивина, СОХ-2 и ММР-7 в опухолях и в прилегающих к ним трех участках слизистой желудка, полученных от больных с РЖ. Получены новые данные об участии этих факторов в развитии опухолевого процесса в данном органе. Комплексный подход к исследованию этих маркеров позволит в дальнейшем с высокой степенью достоверности осуществлять дифференциальную диагностику РЖ.
Показано, что в аденокарциномах наблюдаются достоверно высокие уровни экспрессии маркеров по сравнению с интактной
слизистой желудка как у пациентов с РЖ, так и у пациентов контрольной группы. В работе впервые установлено, что повышение экспрессии онкомаркеров в одном или двух участках слизистой за видимой границей опухоли может указывать на распространение опухолевого процесса вдоль стенки желудка. Впервые показано, что в случае перстневидноклеточного рака (ПКР) наблюдается низкий уровень экспрессии маркеров в самой опухоли и высокий - в прилегающей к ней слизистой желудка. Кроме того, выявлена корреляция между повышенным уровнем экспрессии ММР-7 в слизистой желудка за границей опухоли и глубиной инвазии опухоли.
Впервые обнаружено, что уровень экспрессии сурвивина-2В повышается на поздних стадиях развития опухоли, а уровни экспрессии мРНК общего сурвивина и СОХ-2 в аденокарциномах кишечного типа достоверно выше таковых при раке диффузного типа.
Практическая значимость работы. Исследование экспрессии мРНК генов СОХ-2, ММР-7 и сурвивина показало, что данные онкомаркеры обладают различной клинической ценностью для диагностики РЖ. Установлено, что наименьшей чувствительностью обладает анализ экспрессии СОХ-2, наибольшей - ММР-7. Анализ уровня экспрессии ММР-7 позволяет детектировать РЖ уже на I стадии его развития. Кроме того, уровень экспрессии мРНК СОХ-2 и сурвивина позволяет дифференцировать кишечный и диффузный типы РЖ. Анализ экспрессии генов СОХ-2, ММР-7 и сурвивина в их комбинации улучшает чувствительность диагностики РЖ по сравнению с анализом экспрессии этих онкомаркеров в отдельности.
Анализ уровней экспрессии мРНК генов сурвивина, СОХ-2 и ММР-7 в зоне опухоли и в трех участках слизистой желудка, находящихся на различном расстоянии от нее, позволяет повысить эффективность диагностики РЖ и установить истинные границы опухоли. Это дает возможность не только определять злокачественный потенциал опухоли, но и сократить количество рецидивов РЖ за счет коррекции объема оперативного вмешательства и показаний к послеоперационному курсу химиотерапии.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту. 1. Экспрессия СОХ-2 и сурвивина коррелирует с глубиной инвазии, размером опухоли, но не зависит от степени поражения лимфоузлов и наличия отдаленных метастазов. Повышение уровня экспрессии ММР-7 в слизистой желудка за границей опухоли коррелирует с глубиной инвазии опухоли (г Спирмана равен 0,313, р=0,025).
-
Опухоли на I стадии развития имеют низкие уровни экспрессии мРНК СОХ-2.
-
По уровню экспрессии ММР-7 можно достоверно верифицировать опухоли уже на I стадии их развития, на что указывает высокая чувствительность (80,4%) и специфичность (90,9%) теста.
-
Диффузный тип РЖ, в частности перстневидноклеточный рак, характеризуется более низким уровнем экспрессии сурвивина и СОХ-2 непосредственно в опухоли и повышением экспрессии этих маркеров в слизистой желудка за видимыми границами опухоли.
-
Применение метода скрининга слизистой желудка у раковых больных позволяет повысить чувствительность и специфичность диагностических тестов.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на
Российских и Международных конференциях: XXIII конференции
IATMO "Cancer, cell death and differentiation" (октябрь 2007 г., Триест,
Италия); V конференции молодых ученых России с международным
участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической
медицины», (май 2008 г., Москва); 6-ой международной научно-
практической конференции «Достижения фундаментальных наук в
решении актуальных проблем медицины», (сентябрь 2008 г.,
Астрахань); 7-ой международной научно-практической конференции
«Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем
медицины», (май 2010 г., Астрахань), VII Конференция с
международным участием "Молекулярная медицина и
биобезопасность" (октябрь 2010 г., Москва), IV международная пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых (24 марта 2011г., Москва).
Апробация диссертационной работы состоялась на заседании Ученого совета ГУЗ «Московский научно-исследовательский институт медицинской экологии» Департамента здравоохранения г. Москвы.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 4 статьи в центральных периодических изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 143 страницах машинописного текста и содержит разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение, выводы и список литературы, включающий 148 источников. Работа иллюстрирована 36 рисунками и 13 таблицами.
