Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Фенотипический и генетический анализ изогенных вариантов холерного вибриона с альтернативным уровнем экспрессии факторов патогенности и персистенции Исаев Николай Джучиевич

Фенотипический и генетический анализ изогенных вариантов холерного вибриона с альтернативным уровнем экспрессии факторов патогенности и персистенции
<
Фенотипический и генетический анализ изогенных вариантов холерного вибриона с альтернативным уровнем экспрессии факторов патогенности и персистенции Фенотипический и генетический анализ изогенных вариантов холерного вибриона с альтернативным уровнем экспрессии факторов патогенности и персистенции Фенотипический и генетический анализ изогенных вариантов холерного вибриона с альтернативным уровнем экспрессии факторов патогенности и персистенции Фенотипический и генетический анализ изогенных вариантов холерного вибриона с альтернативным уровнем экспрессии факторов патогенности и персистенции Фенотипический и генетический анализ изогенных вариантов холерного вибриона с альтернативным уровнем экспрессии факторов патогенности и персистенции Фенотипический и генетический анализ изогенных вариантов холерного вибриона с альтернативным уровнем экспрессии факторов патогенности и персистенции Фенотипический и генетический анализ изогенных вариантов холерного вибриона с альтернативным уровнем экспрессии факторов патогенности и персистенции Фенотипический и генетический анализ изогенных вариантов холерного вибриона с альтернативным уровнем экспрессии факторов патогенности и персистенции Фенотипический и генетический анализ изогенных вариантов холерного вибриона с альтернативным уровнем экспрессии факторов патогенности и персистенции Фенотипический и генетический анализ изогенных вариантов холерного вибриона с альтернативным уровнем экспрессии факторов патогенности и персистенции Фенотипический и генетический анализ изогенных вариантов холерного вибриона с альтернативным уровнем экспрессии факторов патогенности и персистенции Фенотипический и генетический анализ изогенных вариантов холерного вибриона с альтернативным уровнем экспрессии факторов патогенности и персистенции
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Исаев Николай Джучиевич. Фенотипический и генетический анализ изогенных вариантов холерного вибриона с альтернативным уровнем экспрессии факторов патогенности и персистенции : диссертация... кандидата биологических наук : 03.00.07, 03.00.04 Саратов, 2007 149 с. РГБ ОД, 61:07-3/916

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 16

1.1. Основные факторы патогенности и персистенции у возбудителя холеры 16

1.1.1. Основные факторы патогенності! V. cholerae 16

1.1.2. Факторы персистенции 26

1.2. Участие различных глобальных регуляторных систем в генетическом контроле экспрессии генов патогенности и персистенции у возбудителя холеры .37

1.2.1 Регуляторная система quorum sensing 38

1.2.2. Негативная регуляция продукции факторов патогенності! 45

1.2.3. Регуляторный механизм координированного переключения генов, кодирующих факторы вирулентности и персистенции 47

ГЛАВА 2. Материалы и методы 50

2.1. Бактериальные штаммы 50

2.2. Питательные среды и реактивы 52

2.3. Методы 53

2.3.1. Культивирование штаммов 53

2.3.2. Определение продукции холерного токсина 53

2.3.3. Определение продукции ферментов: растворимой гемагглютинин/протеазы и фосфолипазы 55

2.3.4. Определение подвижности . 55

2.3.5. Электрофоретический анализ 55

2.3.6. Выявление присутствия полисахаридов 56

2.3.7. Иммуноблоттинг 57

2.3.8. Двумерный электрофорез и определение массы полученных пептидов 57

2.3.9. Выделение экзополисахарида 58

2.3.10. Количественное определение углеводов 59

2.3.11. Тонкослойная хроматография и высоэффективиая жидкостная хроматография 59

2.3.12. Выделение хромосомной ДНК 59

2.3.13. Электронно-микроскопический анализ холерных вибрионов 60

2.3.14. Блот-гибридизация 60

2.3.15. ПНР-тестирование 61

2.3.16. Определение вирулентности и холерогенности изучаемых штаммов 63

2.3.17. Секвенирование 63

ГЛАВА 3. Выявление в природных популяциях v. cholerae клонов с различной экспрессией нескольких факторов вирулентности 64

3.1. Исследование популяционного состава природных штаммов V. cholerae классического биовара 64

3.2. Культуральные и биохимические свойства морфологически разных вариантов модельного штамма V. cholerae Дакка 35 68

3.3. Изучение генетических свойств двух фенотипически разных вариантов штамма V. cholerae Дакка 35 72

ГЛАВА 4. Выявление у v. cholerae классического биовара экзополисахаридного слоя и его биохимический анали 77

4.1. Сравнительное электронно-микроскопическое изучение поверхности Т Тох+ Нар" МоГ и О Тох" Нар+ Mot+ клонов V. cholerae Дакка 35 78

4.2. Определение углеводного состава экзополисахаридного слоя и изучение его функциональной роли у модельного штамма Дакка 35 83

ГЛАВА 5. Протеомный анализ двух изогенных вариантов к cholerae классического биовара с альтернативной экспрессией генов вирулентности и персистентности и выявление сигналов внешней среды, определяющих координированное изменение их экспрессии 89

5.1. Протеомный анализ изогенных EPS" Тох+ Нар" МоГ и EPS+ Тох" Нар+ Mot+ вариантов штамма V. cholerae Дакка 35 90

5.2. Выявление сигналов внешней среды, вызывающих координированное переключение синтеза факторов патогенности и персистентности 97

5.3. Популяционная изменчивость изогенных вариантов штамма Дакка 35 в условиях in vitro и in vivo 106

Заключение 110

Выводы 120

Список используемых источников 122

Введение к работе

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Холера - опасное эпидемическое заболевание, вызываемое токсигенными штаммами Vibrio cholerae. В процессе эволюции в пределах вида возникло три эпидемически опасных варианта с разными диагностическими свойствами: холерные вибрионы 01 серогруппы классического и эль-тор биоваров, а также холерные вибрионы 0139 серогруппы. Характерной особенностью возбудителя холеры является постоянная смена места обитания: чередование пребывания в инфицированном макроорганизме (в тонком кишечнике) с последующим существованием в природных экосистемах. Смена бактериальной клеткой экологической ниши должна сопровождаться появлением у них новых биологических свойств, облегчающих их адаптацию к измененным условиям существования. В этой связи одним из наиболее актуальных направлений современной микробиологии холеры являются исследования генетических систем возбудителя холеры, позволяющих им координировано перестраивать работу клетки для адаптации к меняющимся условиям окружающей среды. В результате дифференциальной активности генов в бактериальных клетках может происходить изменение их фенотипа, обусловленное одновременным изменением продукции нескольких биологически активных веществ. При этом два альтернативных уровня экспрессии генов могут определять два разных фенотипа клеток.

Несмотря на множество публикаций о диапазоне изменчивости возбудителя холеры [Жуков-Вережников Н.Н. с соавт., 1966; Гончарова Н.С., Карасева З.Н., 1970; Адамов А.К. с соавт., 1971; Бароян О.В., 1971; Урюпина Н.В. с соавт., 1971; Воронежская Л.Г. с соавт., 1973; Вейде А.А. с соавт., 1975; Марамович А.С. с соавт., 1975; Дрожевкина М.С. с соавт., 1978; Сомова А.Г. с соавт., 1978; Милютин

8 В.Н. с соавт., 1981; Адамов А.К., Наумшина М.С, 1984; Беляков В.Д., 1986; Грижебовский Г.М., 1997; Савельев В.Н., 1998; Подосинникова Л.С, 1993], интерес к этому вопросу значительно возрос в последние годы, поскольку появились новые подходы к более глубокому анализу фенотипической гетерогенности популяции, основанные на использовании геномных и протеомных технологий [Кап В. et al, 2004; Yildiz F.H. et al, 2004; Бухарин O.B. с соавт., 2005]. Изменение под воздействием факторов окружающей среды состава популяции по продукции ключевых факторов патогенности может привести к понижению или повышению ее вирулентности, что имеет важное значение для изучения механизма развития эпидемического процесса при холере, одной из характерных особенностей которого является периодическая цикличность. Весьма важным является также вопрос о выявлении сигналов внешней среды, определяющих смену доминирующего фенотипа популяции, обусловленную изменением метаболизма бактериальных клеток. Такие знания могут быть полезны как для более глубокого понимания эпидемиологической ситуации, так и для ее прогнозирования.

К настоящему времени накоплены многочисленные данные, свидетельствующие о присутствии в природной популяции холерных вибрионов клонов, отличающихся от типичной формы возбудителя холеры по какому-либо одному признаку [Урюпина Н.В. с соавт., 1971; Сомова А.Г. с соавт., 1978; Адамов А.К., Наумшина М.С, 1984; Грижебовский Г.М., 1997; Wai S.N. et al, 1998; Yildiz F.H. et al, 1999; Yildiz F.H. et al, 2001; AH A. et al, 2002]. Наиболее значителен диапазон морфологической изменчивости холерных вибрионов биовара эльтор. В посевах наряду с типичными прозрачными колониями (S форма) нередко встречаются шероховатые (R формы), а также складчатые или ругозные колонии (р). Описана так-

9 же и сцепленность ряда признаков, хотя имеющаяся информация по этому вопросу явно не достаточна. Так, известно, что у шероховатых (R) форм, как правило, снижена чувствительность к диагностическим фагам, но повышена гемолитическая активность [Милютин В.Н. с соавт., 1981]. Незадолго до начала нашей работы появились данные о том, что одним из значимых компонентов ругозных вариантов эль-тор вибрионов является экзополисахарид или EPS (от англ. exopolysaccharide), расположенный на поверхности бактериальных клеток и обеспечивающий высокий уровень их устойчивости к различным повреждающим воздействиям окружающей среды [Yildiz F.H. et al, 2001; АН A. et al, 2002]. При этом клоны, продуцирующие экзополисахарид, менее подвижны по сравнению с гладкими или S вариантами [Yildiz F.H. et al, 2004]. И совсем недавно [Yildiz F.H. et al, 2004; Beyhan S. et al, 2006] стало известно, что переключение синтеза экзополисахарида в клетках холерных вибрионов эльтор обеспечивается регуляторными системами, которые контролируют активность различных генов, связанных с патогенностью и (или) перси-стентностью. В связи с этим встает вопрос о том, какова взаимосвязь между синтезом факторов вирулентности и персистенции? Как изменяется метаболизм холерного вибриона при смене клеткой фенотипа? Какие сигналы окружающей среды могут активировать этот процесс? Влияет ли доминирующий фенотип популяции на ее вирулентность?

Для решения поставленных вопросов в качестве модельного объекта были взяты холерные вибрионы классического биовара, так как до настоящего времени не были предприняты попытки выявления причин фенотипической гетерогенности популяции этого возбудителя с использованием современных методов исследования. Между тем изучение механизмов адаптации этого патогена к меняющимся ус-

10 ловиям окружающей среды остается актуальным, поскольку классические вибрионы до сих пор сохранились в эндемичных по холере районах - Индии и Бангладеш [Nair G.B. et al, 2002; Safa A. et al, 2005]. Несмотря на утрату ими в настоящее время пандемического потенциала, штаммы этого возбудителя являются одним из природных резервуаров генов вирулентности. Об этом свидетельствует выделение в 1991-1994 гг. в Бангладеш клинических штаммов холерного вибриона биовара эльтор, которые в результате горизонтального переноса генетической информации приобрели ряд генов возбудителя азиатской холеры - ген tcpA из острова патогенносте VPI-1 и ген rstR из профага СТХ [Nair G.B. et al, 2002]. Кроме того, высокий уровень продукции холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии и других факторов вирулентности у холерных классических вибрионов по сравнению с вибрионами эльтор делают их наиболее удобным модельным объектом для исследования многих вопросов регуляции генной активности in vitro.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: выявление и изучение морфологических, биохимических и генетических особенностей изогенных клонов V. cholerae классического биовара с альтернативным и одновременным изменением уровня продукции факторов па-тогенности и персистенции.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Изучить популяционный состав природных штаммов V. cholerae классического биовара для выявления клонов с одновременным изменением нескольких свойств, определяющих вирулентность и(или) персистентность холерного вибриона.

  1. Провести сравнительный анализ морфологических, биохимических и генетических свойств двух фенотипически разных клонов модельного штамма V. cholerae Дакка 35 с различным уровнем продукции экзополисахарида (EPS), холерного токсина (Тох), растворимой гемагглютинин/протеазы (Нар), а также подвижности (Mot).

  2. Выделить, очистить и изучить моносахаридный состав экзополисахарид-ного слоя, обнаруженного на поверхности клеток EPS+ Тох" Нар+ Mot+ модельного штамма V. cholerae Дакка 35.

  3. Получить белковые «портреты» двух фенотипически разных изогенных вариантов штамма V. cholerae Дакка 35 (EPS+ Тох" Нар+ Mot+ и EPS" Тох+ Нар" Mot"), провести их сравнительный анализ и выяснить роль отдельных белков в адаптации клеток к меняющимся условиям внешней среды.

  4. Выявить сигналы внешней среды, вызывающие смеїгу фенотипа клеток в популяции V. cholerae классического биовара.

  5. При экспериментальной инфекции определить вирулентность двух фенотипически разных (EPS+ Тох" Нар+ Mot+ и EPS" Тох+ Нар" Mot") субпопуляций V. cholerae.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

При изучении популяционного состава 76 штаммов холерного вибриона классического биовара впервые выявлены штаммы с координированным альтернативным уровнем экспрессии четырех факторов патогенности и персистенции.

Впервые на поверхности клеток классических холерных вибрионов обнару-жен экзополисахаридмый (EPS) слой в клетках, определяющий мутность колоний.

12 Установлена его функциональная роль, которая состоит в защите клеток от воздействия стрессовых факторов внешней среды.

Впервые установлено, что при повышении рН среды до 9,0 происходит альтернативное изменение уровня экспрессии генов, определяющих продукцию экзо-полисахарида, холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы, а также подвижности в популяции клеток EPS- Тох+ Нар- МоГ.

Впервые проведен сравнительный протеомный анализ двух изогенных фено-типически разных вариантов (EPS+ Тох" Нар+ Mot+ и EPS- Тох+ Нар" Mot") модельного штамма V. cholerae Дакка 35 и показана дифференциальная продукция около 60 белков. Установлено, что координированное изменение клеточного метаболизма, адекватное условиям внешней среды, определяет степень вирулентности бактериальной популяции.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

По результатам работы составлены методические рекомендации «Получение штаммов холерного вибриона классического биовара с координированным изменением экспрессии факторов патогенносте и персистенции», которые одобрены Ученым Советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 7 от 27 июня 2006 г.) и утверждены директором института 29 июня 2006 г. Предложенный методический прием позволяет использовать один и тот же штамм холерного вибриона классического биовара для получения различных биологически активных веществ, изменяя условия его культивирования.

Депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" 8 штаммов холерного вибриона классического биовара с альтернативным

13 уровнем экспрессии трех генов, связанных с вирулентностью, и 2 штамма V. cholerae Дакка 35, утративших способность продуцировать холерный токсин за счет внедрения транспозона TnphoA (KmR) в участок хромосомы, определяющий синтез этого фактора патогенности. Указанные штаммы могут быть использованы в фундаментальных исследованиях, направленных на изучение механизмов регуляции генов вирулентности.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

  1. Популяция ряда природных штаммов V. cholerae классического биовара содержит клоны двух типов, различающихся по морфологии колоний (прозрачные или Т от англ. translucent и мутные или О от англ. opaque), продукции холерного токсина (Тох+ и Тох~), растворимой гемагглютинин/протеазы (Нар+ и Нар") и подвижности (Mot+ и Mot"). Одновременное и альтернативное изменение фенотипиче-ских свойств двух типов клонов не связано с различиями в составе изученных структурных и регуляторных генов.

  2. На поверхности клеток О Тох~ Нар+ Mot+ модельного штамма V. cholerae Дакка 35 присутствует экзополисахаридный слой, определяющий морфологию колоний и состоящий из рамнозы, глюкозы, галактозы и гексозамина. Продукция эк-зополисахарида (EPS) в клетках возбудителя холеры повышает их устойчивость к действию осмотического и оксидативного стресса.

  3. По данным протеомного анализа фенотипически различные клетки, присутствующие в популяции V. cholerae Дакка 35, различаются по экспрессии около 60 разных белков. Клетки с фенотипом EPS+ Тох~ Нар+ Mot+ продуцируют значи-

14 тельно больше мембранных и цитоплазматических белков, защищающих их от воздействия неблагоприятных факторов внешней среды.

  1. рН является сигналом внешней среды, вызывающим координированное переключение синтеза факторов патогенности и персистенции у холерных классических вибрионов. При повышении рН среды до 9,0 в популяции клеток EPS- Тох+ Нар" Моґ происходит одновременное изменение уровня экспрессии генов, определяющих продукцию экзополисахарида, холерного токсина, растворимой гемагглю-тинин/протеазы, а также подвижности.

  2. Фенотипическая структура популяции штамма влияет на уровень вирулентности возбудителя для кроликов-сосунков.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации доложены и представлены на научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб» «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2004, 2005 гг.), на третьем съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития" (Москва, 2004 г.), на Всероссийской научно-практической конференции "Молодые ученые в медицине" (Казань, 2004 г.).

ПУБЛИКАЦИИ: По теме диссертации опубликовано 10 научных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использован-

15 ных источников, включающего 222 цитируемые работы, из них 187 зарубежных и 35 отечественных. Общий объем диссертации составляет 149 страниц. Текст иллюстрирован 12 таблицами и 29 рисунками.

Регуляторная система quorum sensing

Экспрессия основных факторов патогенносте холерного вибриона - СТ и TCP коїггролируется несколькими регуляторными системами. Одна из них toxR/toxT координировано на уровне транскрипции изменяет экспрессию более 20 различных генов и включает регуляторные белки, структурные гены которых расположены как в эволюционно древней части хромосомы (toxR, toxS, aphA, aphB), так и на мобильных генетических элементах (tcpP, tcpH, toxT), приобретенных холерным вибрионом на более позднем этапе эволюции [Miller V.L. et al, 1984; Champion G.A. et al, 1997; Crawford J.A. et al, 1998; Cotter P.A., DiRita V.J., 2000; Li C.C. et al, 2000; Nye M.B. et al, 2000; Provenzano D. et al, 2000b; Li C.C. et al, 2002]. Глобальным в этой системе является регуляторный белок ToxR с молекулярной массой 32,5 кДа, ген которого расположен на большой хромосоме возбудителя холеры и регулирует не только транскрипцию генов вирулентности, но и генов, кодирующих белки, участвующие в адаптации микроорганизмов к условиям внешней среды (например, белка-порина OmpU) [DiRita V.J. et al, 1991; Higgins D.E. et al, 1996; Dzieman M. et al, 1999; Li C.C. et al, 2002; Reidl J., Klose K.E., 2002; Crawford J.A., 2003]. Трансмембранный белок ToxR совместно с белками ToxS и TcpP активирует транскрипцию гена toxT. Образующийся цитоплазматиче-ский белок ТохТ обеспечивает высокий уровень экспрессии TCP и СТ [Schumacher D.A., Klose К.Е., 1999; Krukonis E.S. et al, 2000]. Данная многокомпонентная сие 38 тема регулирует транскрипцию генов в ответ на изменение температуры, содержания аминокислот, желчи, NaCl, рН, СОг и т. д.

Описано несколько глобальных регуляторных систем, связывающих контроль экспрессии факторов вирулентности (СТ и TCP) и персистенции (внеклеточный экзополисахарид): двух-компонентная система quorum sensing [Miller М.В. et ah, 2002] и трех-компонентная система VieS/A/B [Tischer A.D., Camilli A., 2004].

Образование биопленок и их функционирование - пример сложного социального поведения бактерий, регулируемого и управляемого не только сигналами из окружающей среды, но и межклеточными сигналами. Межклеточные коммуникации между микроорганизмами осуществляются при участии механизма, реализуемого посредством постоянного обмена информацией с помощью специализированных химических молекул, получившего название "чувство кворума" или "чувство плотности" (quorum sensing). Этот механизм позволяет бактериям действовать коллективно, подобно тому, как ведут себя клетки в многоклеточном организме [Ильина Т.С. с соавт., 2006].

В 2002 г J. Zhu et al. было обнаружено, что в регуляции экспрессии основных генов патогенносте у холерного вибриона важная роль принадлежит именно этой регуляторной системе - quorum sensing.

Впервые регуляторный механизм quorum sensing популяции был открыт в 1979 г при изучении морских "светящихся" бактерий V.fischeri и V. harveyi. У данных микроорганизмов продукция ферментов, ответственных за излучение света, происходит только при достижении высокой плотности клеточной популяции, иными словами при накоплении секретируемых в среду сигнальных молекул [Miller М.В., Bassler B.L., 2001].

В 90-х годах усилился интерес к данному регуляторному механизму, так как было обнаружено, что достаточно большое число разнообразных биологических процессов, таких как биолюминесценция, горизонтальный генетический перенос, образование антибиотиков, споруляция, синтез ряда экзоферментов и факторов патогенносте у растительных и животных патогенов регулируются этим механизмом [Miller М.В., Bassler B.L., 2001]. Необходимо отметить, что при изучении межклеточных взаимодействий в популяции открыто три фактора передачи сигналов: непосредственный (физический) контакт между клетками, выработка диффундирующих в среду химических агентов и генерация тех или иных физических полей (ми-тогенетическое излучение Гурвича) [Brandner J.P., Kroos L., 1998; Fuqua С. et ai, 2001]. Из этих факторов наиболее полно изученным является передача сигналов посредством химических молекул. В качестве посредников или аутоиндукторов выступают низкомолекулярные производные аминокислот. У грамотрицательных бактерий роль аутоидукторов выполняют ацилированные лактоны гомосерина, а у грамположительных - низкомолекулярные пептиды. Необходимо отметить, что даже в пределах рода Vibrio существуют различия как в аутоиндукторах, так и в механизмах их детекции [Fuqua С. et ah, 2001; Miller М.В., Bassler B.L., 2001].

Регуляторная система «quorum sensing» детально изучена у морских светящихся бактерий V. fischeri, у которых свечение является процессом зависимым от плотности популяции, т. е. не наблюдается в разбавленных клеточных суспензиях, например, в морской воде, а реализуется лишь в концентрированных культурах - в светящихся органах головоногого моллюска Euprymna scolopes (природная эколо 40 гическая ниша), где плотность популяции достигает 1010-10п кл/мл. Данная система, по-видимому, представляет пример взаимовыгодного межвидового сотрудничества. Моллюск - ночное животное и светящиеся бактерии делают его незаметным для хищников (свечение, напоминающее лунный свет, не дает тени). В свою очередь бактериям моллюск предоставляет питание и укрытие [Losick R, Kaiser D., 1997; Miller M.B., Bassler B.L., 2001].

Механизм регуляции свечения V. fischeri исследовался поэтапно. Вначале было показано, что свечение культур V. fischeri, может быть индуцировано культу-ралыюй жидкостью, отделённой от клеток во время стационарной фазы роста. Впоследствии была открыта и детально охарактеризована генетическая система "luxl - luxR", обнаруженная у большинства известных грамотрицательных бактерий.

Данная система состоит из двух оперонов luxICDABEG и luxR. Ген luxl кодирует белок Luxl, состоящий из 193 аминокислот и функционирующий как синтета-за аутоиндуктора. Накопление аутоипдукторов в среде является сигналом V. fischeri для биолюминесценции. Гены ІихА и ІихВ кодируют, соответственно, субъединицы а и b люциферазы (ферментного комплекса, ответственного за био-люминсценцию). Гены luxCD и ІихЕ определяют синтез редуктаз жирных кислот, которые являются окисляемыми субстратами в ходе люциферазной реакции, приводящей к испусканию кванта света [Miller М.В., Bassler B.L., 2001].

Исследование популяционного состава природных штаммов V. cholerae классического биовара

Проблема фено- и генотипической изменчивости патогенных бактерий остается одной из важнейших проблем микробиологии. К настоящему времени установлено, что популяция холерных вибрионов, выделенных от больных холерой, вибрионосителей или из внешней среды, является гетерогенной [Finkelstein R.A. et al, 1997; Милютин В.Н. с соавт., 1981; Адамов А.К., Наумшина М.С., 1984]. Так, при рассеве на плотной среде разных штаммах V. cholerae биовара эльтор среди типичных гладких прозрачных или Т (от англ. translucent) колоний можно обнаружить атипичные мутные или О (от англ. opaque) колонии. При этом изменение в ряде случаев морфологии колоний коррелировало с изменением продукции таких факторов вирулентности как гемолизин и холерный токсин [Finkelstein R.A et al, 1997; Holmes R.K. et al, 1975].

Отмеченное раннее одновременное изменение морфологии колоний и продукции СТ у холерных эльтор вибрионов позволило высказать предположение, что у холерных вибрионов классического биовара может также происходить координированное включение (или выключение) ряда генов, кодирующих факторы вирулентности и персистенции. Для подтверждения этой гипотезы нами был изучен по-пуляционный состав 76 штаммов V. cholerae классического биовара, выделенных на территории Пакистана и Индии в 1942-1969 гг. и хранящихся в Государственной коллекции патогенных бактерий института «Микроб». У исследуемых штаммов была изучена морфология колоний, а также проверена подвижность, ферментативные и токсигенные свойства.

На первом этапе работы после рассева каждого штамма на плотной среде (на 2-х чашках с агаром из сердечной мышцы) оценивали морфологию изолированных колоний. В результате фенотипического анализа популяции были обнаружены две группы штаммов. В первую входили 65 штаммов (что составило 86 % от общего числа проверенных штаммов), характеризующихся однородным популяционным составом относительно морфологии колоний и состоящих из типичных прозрачных колоний. Вторая группа была представлена 11 штаммами (14 %), в популяции которых были обнаружены как типичные прозрачные колонии, так и атипичные мутные колонии (рис. 6). Прозрачные колонии обозначили как Т-колонии (от англ. translucent), мутные - как О-колонии (от англ. opaque).

Существование различий в морфологии колоний может быть связано с изменением биосинтеза поверхностных структур клетки, включая белки внешней мембраны и экзополисахаридный слой, недавно обнаруженный у холерных вибрионов эльтор. Более того, можно также допустить, что появление клонов с атипичной морфологией могло быть следствием избирательной активности набора различных генов, в том числе и генов вирулентности.

Морфология макроколоний различных штаммов холерного вибриона классического биовара: 1 -2 - V. cholerae Дакка 35, 3-4 - V. cholerae 9361, 5-6- У. cholerae В1307, 7-8 - V. cholerae 2 Огава. Четные номера - клоны, формирующие прозрачные колонии; нечетные номера - мутные колонии.

В этой связи Т- и О-колонии 11 штаммов были проверены на продукцию ими ключевых и дополнительных факторов патогенности: холерного токсина (СТ), ток-син-корегулируемых пилей адгезии (TCP), растворимой гемагглютинин/протеазы (Нар), а также на подвижность. Действительно, среди этих штаммов было выявлено семь (9361, В1307, 2 Огава, 26, Дакка 35, 104/63, 34), у которых вариабельность морфологии колоний сопровождалась изменением продукции ряда факторов патогенности (табл. 4).

Следует особо отметить, что О-колонии различных штаммов чаще всего были более подвижны и имели высокий уровень продукции Нар по сравнению с Т-колониями (табл. 4). Поскольку О-варианты имели более высокий уровень продукции растворимой гемагглютинин/протеазы и большую подвижность, их фенотип был обозначен как О Нар МоГ. Между чем для Т клопов был характерен альтерна тивный уровень экспрессии указанных факторов патогенности - незначительное количество Нар и невысокая подвижность. В этой связи их фенотип был обозначен как Т Нар МоГ.

Сравнительное электронно-микроскопическое изучение поверхности Т Тох+ Нар" МоГ и О Тох" Нар+ Mot+ клонов V. cholerae Дакка

К настоящему времени не вызывает сомнений, что у патогенных бактерий, включая возбудителя холеры, имеются молекулярно-генетические механизмы, позволяющие им регулировать свою вирулентность в зависимости от условий внеш 98 ней среды. Принцип действия этого механизма состоит в передаче информации об изменении параметров внешней среды сенсорными трансмембранными белками на белок-регулятор, способный, как правило, взаимодействовать с большим количеством промоторов, контролирующих экспрессию генов факторов патогенности, тем самым активно включая или выключая их. Ключевым компонентом таких регуля-торных систем являются трансмембранные белки, изменяющие активность регуляторного белка [DiRita V.J., et al, 1991; Литвин В.Ю. с соавт., 1998; Hase С.С., Mekalanos J.J., 1998; Романова 10. М. с соавт.,1999; Crawford J.A. et al, 2003; Kovacikova G. et al, 2003; Бухарин O.B. с соавт., 2005]. Вместе с тем вопрос о сигналах внешней среды, изменяющих активность регуляторных белков, остается недостаточно изученным, поскольку список внешних воздействий воспринимаемых сенсорными системами бактериальной клетки очень разнообразен.

Выявление различий между EPS- Тох+ Нар- МоГ и EPS+ Тох- Нар+ Mot+ клонами в продукции поверхностных белков, защищающих клетку от воздействия желчи, присутствующей как в макроорганизме, так и во внешней среде (соли желчных кислот) послужило основанием для проведения экспериментов по изучения ее влияния на клетки V. cholerae Дакка 35 in vitro. Как известно, холерный вибрион является кишечным патогеном и на ранней стадии инфекции подвергается влиянию желчи, которая постоянно присутствует в кишечнике. Большинство кишечных патогенов имеет высокочувствителыгую к желчи цитоплазматическую мембрану и устойчивую внешнюю. По данным литературы, устойчивость внешней мембраны к желчи связана с присутствием на поверхности клеток липополисаха-рида и белков-поринов, препятствующих поступлению желчи в клетки [Proven-sano D. et al, 2000a]. Кроме того, грамотрицательные бактерии выработали особые «откачивающие» механизмы: RND (от англ. resistance nodulation division), MF (от англ. major facilitator), системы транспорта ABC (от англ. ATP binding cassette), эффективно выводящие через поры во внешней мембране различные антимикробные компоненты, в том числе и желчь, проникающие внутрь клеток [Bina J.E, Mekalanos J.J., 2001; Provensano D. et ah, 2000b]. Общим свойством данных систем, является участие в образовании пор белка TolC или подобных ему белков. Предполагается, что у V. cholerae существует около шести «откачивающих» систем RND типа, при этом одна или несколько функционируют, используя канал во внешней мембране, сформированный из белка TolC [Bina J.E, Mekalanos J.J., 2001]. Изучение белка TolC у эльтор вибрионов выявило, что его присутствие способствует устойчивости клеток к желчи [Bina J.E, Mekalanos J.J., 2001]. Другой механизм устойчивости холерных вибрионов к желчи связан с синтезом белка внешней мембраны OmpU. Штаммы V. cholerae, содержащие OmpU, более резистентны к холагу натрия и анионным детергентам (например, к дезоксихолату и додецилсульфату натрия), чем холерные вибрионы, экспрессирующие белок OmpT [Provenzano D., Klose K.E., 2000]. Это обусловлено тем, что поры, образованные за счет белка OmpU, имеющего большое количество гидрофильных остатков, менее проницаемы для холата натрия и анионных детергентов, чем поры, сформированные из белка OmpT. Вместе с тем сведения о влиянии солей желчных кислот на изменение экспрессии белков OmpU и TolC у холерных вибрионов классического биовара практически отсутствуют. При изучении влияния соли желчной кислоты (холат натрия) на EPS+ Тох" Нар+ Mot+ и EPS" Тох+ Нар- Моґ клоны V. cholerae Дакка 35 было обнаружено, что EPS+Tox Нар+ Mot+ клоны обладают большей устойчивостью к действию холата натрия по сравнению с EPS- Тох+ Нар" Моґ клонами. Об этом говорит тот факт, что при одинаковой посевной дозе клеток обоих клонов в бульон е холатом натрия (0,4 %), EPS Тох Нар МоГ клонов вырастало в 100 раз меньше, чем EPS+ Тох Нар+ МоГ. В присутствии халата натрия у EPS Toxr Нар" МоГ клонов снижалась продукция холерного токсина с 13,0 мкг/мл до 5,1 мкг/мл. При определении уровня биосинтеза другого важного фактора патогенности - TCP методом иммуноблотинга было выявлено, что в обоих клонах их продукция также уменьшалась (рис. 24).

Протеомный анализ изогенных EPS" Тох+ Нар" МоГ и EPS+ Тох" Нар+ Mot+ вариантов штамма V. cholerae Дакка 35

Vibrio cholerae - возбудитель опасного эпидемического заболевания является удобной моделью для изучения механизмов адаптации патогенных бактерий к меняющимся условиям внешней среды, так как данный микроорганизм приспособлен к существованию в двух разных экологических нишах - в поверхностных водоемах и кишечнике человека. Очевидно, что из-за существенных различий комплекса условий внешней среды и организма хозяина, холерные вибрионы должны реализо-вывать разные генетические программы, осуществляющие инфекционный процесс или выживание во внешней среде.

Интенсивные исследования, проведенные в последнее время, показали существование механизмов координированной экспрессии генов, определяющих продукцию факторов вирулентности и персистенции в зависимости от условий внешней среды. Интересным, но все еще недостаточно изученным механизмом адаптации популяции к меняющимся условиям внешней среды являются фазовые изменения фенотипа, которые являются одним из источников популяционной неоднородности. Фазовые изменения следует отличать от классической схемы регуляции генной активности, поскольку, с одной стороны, фазовые вариации это наследуемые изменения, определяемые генетическими механизмами, с другой стороны, фазовые изменения транскрипции генов должны быть обратимы и частота появления ревертантов должна превышать частоту случайного мутагенеза. Переключение между двумя фазами это вероятностное (случайное) событие и внешние условия лишь изменяют частоту фазовых переходов [van der Woude M.W., Baumer A.J., 2004].

К настоящему времени установлено, что популяция холерных вибрионов, выделенных от больных холерой, вибрионосителей или из внешней среды, является гетерогенной по многим свойствам, включая и морфологические [Finkelstein R.A. et al, 1997; Милютин В.Н. с соавт., 1981; Адамов А.К., Наумшина М.С., 1984]. Среди типичных гладких прозрачных колоний можно обнаружить атипичные мутные колонии. При этом изменение в ряде случаев морфологии колоний коррелировало с изменением продукции таких факторов вирулентности как гемолизин и холерный токсин [Finkelstein R.A et al, 1997: Holmes R.K. et al, 1975]. Эти фазовые вариации, выражающиеся в формировании двух морфологически разных типов колоний, способствуют, видимо, адаптации холерных вибрионов к меняющимся условиям внешней среды [Fong J.C.N, et al, 2006].

Отмеченное раннее одновременное изменение морфологии колоний и продукции СТ у холерных эльтор вибрионов позволило высказать предположение, что разный фенотип колоний может указывать на разный уровень экспрессии в клетках многих белков и полисахаридов. Для подтверждения этой гипотезы нами были проведены исследования на модельных штаммах V. cholerae классического биовара. Был изучен популяционный состав 76 штаммов V. cholerae классического биовара, выделенных на территории Пакистана и Индии в 1942-1969 гг. и хранящихся в Государственной коллекции патогенных бактерий института «Микроб». У исследуемых штаммов была определена морфология колоний, а также изучена подвижность, ферментативные и токсигенные свойства.

В результате фенотипического анализа популяции было обнаружено две группы штаммов. В первую входило 86 % изученных штаммов, популяция которых состояла из типичных прозрачных колоний (S-форма). Вторая группа была пред 112 ставлена 11 штаммами (14 %), в популяции которых были обнаружены как прозрачные, так и мутные колонии, которые также находились в S-форме. Прозрачные колонии были обозначены как Т-колонии (от англ. translucent), мутные колонии -как О-колонии (от англ. opaque). Поскольку изменение морфологии может быть связано с изменением продукции различных белков, в том числе и белков, связанных с вирулентностью [Finkelstein R.A. et al, 1992; Finkelstein R.A et al, 1997; Ali A. et al, 2000a; Yildiz F.H. et al, 2004; van der Woude M.W., Baumer A J. 2004], T и О колонии 11 штаммов были проверены на продукцию ими ключевых и дополнительных факторов патогенности: холерного токсина, токсин-корегулируемых пи-лей адгезии, растворимой гемагглютинин/протеазы, а также подвижности. Сравнительный анализ Т и О клонов позволил выявить семь штаммов (9361, В1307,2 Ога-ва, 26, Дакка 35, 104/63, 34), у которых вариабельность морфологии колоний сопровождалась изменением продукции ряда факторов патогенности. Так как О колонии были подвижны и имели высокий уровень продукции Нар, их фенотип был обозначен как О Нар+ Mot+. Для Т клонов была характерна альтернативная экспрессия указанных факторов патогенности - незначительное количество Нар и невысокая подвижность, поэтому их фенотип был обозначен как Т Нар- МоГ.

Наибольший интерес, на наш взгляд, представляют штаммы V. cholerae 9361, Дакка 35 и В1307, которые четко отличались друг от друга по четырем свойствам: морфологии колоний, продукции Нар, подвижности и продукции холерного токсина. Для последующего изучения в качестве модельного был взят штамм V. cholerae Дакка 35, два типа колоний которого значительно отличались по продукции СТ при изучении методом РПИГ и имели фенотип Т Тох+ Нар" МоГ и О Тох- Нар+ Mot+. При количественно определении синтеза СТ было выявлено, что Т Тох+ Нар 113 МоГ клонами синтезируют 13,0 мкг/мл, в тоже время у О Тох- Нар+ Mot+ клонов было обнаружено его присутствие, но в очень незначительном количестве - 0,03 мкг/мл. Анализ биологической активности токсина Т Тох+ Нар" МоГ клонов в кожной пробе по Крейгу показал, что энтеротоксин штамма Дакка 35 обладал типичной для холерного токсина биологической активностью. Несмотря на четкие различия в продукции СТ, различные клоны этого штамма не имеют существенных различий в экспрессии TCP. Проведенный анализ культуральных свойств показал, что Т Тох+ Нар- МоГ и О Тох- Нар+ МоГ клоны Дакка 35 обладают типичными свойствами, характерными для классических холерных вибрионов.

При изучении генетических свойств двух фенотипически разных вариантов штамма V. cholerae Дакка 35 было установлено, что сравниваемые варианты не отличаются друг от друга по набору генов, расположенных как на мобильных генетических элементах (ctxA, zot, асе - профаг СТХф, toxT, tcpP, tcpH- ОП VPI-I), так и в эволюционно древней части хромосомы (toxR, hapR, ІихО). Также не было обнаружено отличий от других классических штаммов холерного вибриона по ко-пийности глобального регуляторного гена toxR и по количеству структурных генов ctxAB, оба варианта штамма Дакка 35 имеют две копии оперона ctxAB и одну копию регуляторного гена toxR величина фрагмента которого была идентична таковой классическим штаммам.

Похожие диссертации на Фенотипический и генетический анализ изогенных вариантов холерного вибриона с альтернативным уровнем экспрессии факторов патогенности и персистенции