Введение к работе
Актуальность проблемы. В фундаментальных ме дико-биохимических исследованиях было установлено, что высокий уровень аполипопротеина A-I (АроА-1) в плазме крови коррелирует с низким риском развития атеросклероза и ишемической болезни сердца. АроА-1 человека входит в состав липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), участвует в обратном транспорте холестерола из периферических тканей в печень, обладает антиоксидантными и противовоспалительными свойствами и, по-видимому, может выступать в роли сигнальной молекулы. Известно, что главными местами экспрессии гена ароА-1 и синтеза белка АроА-1 у человека являются гепатоциты печени и энтероциты тощей кишки. Экспрессия гена ароА-1 обнаружена также в плаценте, сердце, хрящевой ткани и в клетках желточного мешка зародышей млекопитающих. Вместе с тем, регуляция экспрессии гена ароА-1 в клетках, отличных от энтероцитов и гепатоцитов, недостаточно охарактеризована.
В настоящее время все больше внимания вызывает представление об атеросклерозе как о процессе хронического воспаления (Hansson and Libby, 2006). Одним из ключевых факторов, участвующих в процессе воспаления при развитии атеросклеротических повреждений сосудов, является фактор некроза опухоли альфа (TNFa) (Canault et al., 2008). TNFa угнетает транскрипцию и снижают секрецию ароА-1 в гепатоцитах человека (Song et al., 1998; Haas et al., 2003), а также приводит к уменьшению как содержания АроА-1 в составе ЛПВП, так и уровня ЛПВП в плазме крови (Khovidhunkit et al., 2004; Esteve et al., 2005).Тем не менее, молекулярные механизмы регуляции экспрессии гена ароА-1 при действии провоспалительных цитокинов все еще недостаточно изучены. Интересным и важным является изучение регуляции экспрессии гена ароА-1 при действии провоспалительных цитокинов, таких как TNFa, в гепатоцитах и клетках моноцитарно-макрофагального ряда.
Цели работы. Целью диссертационной работы является изучение тканеспецифической регуляции экспрессии гена ароА-1 человека при действии TNFa в клетках HepG2 и ТНР-1, а также выяснение роли сигнальных путей JNK, р38, МЕК1/2, NFkB и ядерных рецепторов HNF4a, PPARa, PPARy и LXRs в этом процессе. Задачи исследования.
Изучить регуляцию экспрессии гена ароА-1 в клетках гепатомы человека HepG2 при действии TNFa.
Исследовать возможность экспрессии гена ароА-1 в клетках моноцитарно-макрофагального ряда человека ТНР-1 и её регуляции при действии TNFa.
Изучить роль сигнальных путей JNK, р38, МЕК1/2 и NFkB, а также ядерных рецепторов HNF4a, PPARa, PPARy и LXRs в регуляции экспрессии гена ароА-1 в клетках HepG2 и ТНР-1.
Научная новизна полученных результатов. Впервые показано участие
ядерного рецептора PPARy в регуляции экспрессии гена ароА-І в клетках
гепатомы человека (HepG2). Установлена роль ядерных рецепторов HNF4a,
PPARa, PPARy и LXRs в TNFa-зависимом подавлении экспрессии гена
ароА-І в клетках HepG2.
Впервые показано, что ген ароА-1 экспрессируется в культивируемых
человеческих клетках моноцитарно-макрофагального ряда - ТНР-1, в
моноцитах и макрофагах, полученных из периферической крови человека, в
перитониальных макрофагах мыши, причём экспрессия этого гена
стимулируется при добавлении к клеткам провоспалительного цитокина
TNFa.
Показано участие сигнальных путей JNK, р38, МЕК1/2, NFkB и ядерных
рецепторов PPARa и LXRs в TNFa-зависимой стимуляции экспрессии гена
ароА-І в клетках ТНР-1.
Практическое значение результатов исследования. Полученные
результаты расширяют наши представления о тканеспецифической
регуляции экспрессии гена ароА-1, а также указывают на механизмы
регуляции экспрессии этого гена при действии на клетки
провоспалительного цитокина TNFa. Предложена гипотеза о
противовоспалительной роли эндогенно-синтезированного АроА-І в клетках
моноцитарно-макрофагального ряда.
Результаты, полученные в этой работе, дополняют представления о роли
TNFa и АроА-І в развитии нарушений липидного обмена и могут быть
использованы при разработке методов тканеспецифической регуляции
экспрессии гена ароА-1 с целью терапии атеросклероза.
Основные положения, выносимые на защиту:
Показана роль сигнальных путей JNK, р38, МЕК1/2 и NFkB в угнетении экспрессии гена ароА-І в клетках HepG2 при действии TNFa.
Показана экспрессия гена ароА-І в клетках моноцитарно-макрофагального ряда ТНР-1 и установлена TNFa-зависимая активация транскрипции этого гена.
Установлено, что сигнальные пути JNK, р38, МЕК1/2 и NFkB принимают участие в активации экспрессии гена ароА-1 в клетках ТНР-1 при действии TNFa.
Выяснено участие ядерных рецепторов HNF4a, PPARa, PPARy и LXRs в TNFa-зависимом подавлении экспрессии гена ароА-І в клетках HepG2, а также установлено, что PPARa и LXRs участвуют в активации транскрипции гена ароА-І в клетках ТНР-1 при действии TNFa.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались в виде устных и стендовых сообщений на следующих
конференциях: 16-ая Международная конференция «СПИД, рак и общественное здоровье», 28 мая - 1 июня, 2007 г., Санкт-Петербург, Россия; 17-ая Международная конференция «СПИД, рак и общественное здоровье», 26 - 30 мая, 2008 г., Санкт-Петербург, Россия; XIII Всероссийский форум «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», 8-11 июня 2009 г., Санкт-Петербург, Россия; Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2009», 13-18 апреля, 2009 г., Москва, Россия; 34th FEBS Congress, 4-9 июля, 2009 г., Prague, Czech Republic; International Conference "Modern Microscopy Techniques in Biology and Medicine", 9-10 November 2009, St. Petersburg, Russia. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 4 статьи в рецензируемых журналах из списка ВАК РФ. Личный вклад автора в проведении исследования. Соискателем были проведены: анализ литературы по теме исследования, планирование экспериментов, получение основной части результатов, написание статей и подготовка докладов на конференциях. Выделение РНК и клеточных белков, реакции обратной транскрипции и Real Time RT-PCR, иммунопреципитация хроматина, иммуноцитохимия, Вестерн-блоттинг, конструирование генетических конструкций, люциферазный тест и выделение ядерных белков выполнены соискателем. Культивирование клеточных линий HepG2 и ТНР-1 выполнено совместно с к.б.н. Э.Б. Диже и А.С. Трулевым. Эксперименты по проточной цитофлуорометрии выполнены совместно с к.б.н. И.В. Кудрявцевым. Задержка белков в геле выполнена совместно с к.б.н. СВ. Орловым.
Внедрение результатов работы. Научные результаты и практические рекомендации могут быть внедрены в научный и учебный процесс Отдела биохимии НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН (Россия, 197376, ул. Ак. Павлова, 12), Кафедры эмбриологии и Кафедры цитологии и гистологии Биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского Государственного Университета (Россия, 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7-9).
Структура диссертации. Диссертация построена по традиционной схеме и содержит разделы «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список цитируемой литературы», включающий 271 наименование, из них 3 источника на русском языке и 268 наименований на английском языке. Диссертация изложена на 106 страницах. Результаты представлены в 1 таблице и иллюстрированы 24 рисунками.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалы. Ингибиторы МАР-киназ были получены из «Biomol» SB203580 (ингибитор р38 MAP); SP600125 (ингибитор JNK1/2/3); U0126 (ингибитор МЕК1/2) и ингибитор NF-кВ (QNZ). Ингибитор Src-киназы РР2 был получен из «Biomol». Синтетические лиганды PPARa были получены из «Sigma»: WY-14643 (агонист) и МК886 (антагонист).
Синтетический агонист LXRs (ТО901317) был получен из «Biomol». Синтетический агонист PPARy (GW1929) и синтетический антагонист PPARy (GW9662) были получены из "Sigma". Рекомбинантный TNFa человека был получен из "Sigma". В данной работе использовались следующие антитела: мышиные моноклональные антитела против актина человека ("Abeam", ab3280), мышиные моноклональные антитела против АроА-1 человека ("AbD Serotec", 0650-0050), кроличьи поликлональные антитела против HNF4a человека ("Santa Cruz Biotechnology", sc-8987), кроличьи поликлональные антитела против PPARy человека ("Santa Cruz Biotechnology", sc-7196), кроличьи поликлональные антитела против LXR|3 человека ("Abeam", ab56237), мышиные моноклональные антитела против PPARa человека ("Abeam", ab2779) , козьи антитела против IgG мыши (FITC) ("Abeam", ab 6669-1), козьи антитела против IgG мыши (HRP) и козьи антитела против IgG кролика (HRP) ("Sigma"). pCMVL представляет собой вектор экспрессии бактериального гена-репортера lacZ под контролем промотора ранних генов цитомегаловируса человека (CMV), и был получен ранее (Perevozchikov et al., 1997). pCMVHNF4, вектор экспрессии транскрипционного фактора человека HNF4a, был любезно предоставлен Dr. Fukamizu (University of Tsukuba, Japan). pCMVHNF4D, вектор экспрессии доминантно-негативного мутанта транскрипционного фактора человека HNF4a, был любезно предоставлен Dr. Leff (Wayne State University School of Medicine, USA). pAPOA-I(-2498/+173)-Luc, pAPOA-I(-2498/+72)-Luc, pAPOA-I(-256/+173)-Luc и pAPOA-I(-256/+72)-Luc, плазмиды, содержащие ген-репортер люциферазы светлячка под контролем делеционных вариантов 5'-регуляторного участка гена ароА-1 человека (-2498...+173), (-2498...+72), (-256...+173) и (-256...+72) относительно точки инициации транскрипции (+1) соответственно, были сконструированы с использованием методов генетической инженерии и описаны ранее (Лапиков и др., 2008). Экспериментальная часть.
Клеточные культуры и трансфекция. Клеточная линия гепатомы человека HepG2 была получена из Банка клеточных культур Института Цитологии Российской академии наук и культивировалась в среде DMEM с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки (FCS) ("Биолот»), в атмосфере 5% ССЬ при 37 С. В экспериментах с TNFa клетки
высевались в 24-луночные планшеты с плотностью 1x10 клеток на см и культивировались 24 ч в среде DMEM. После этого ростовую среду меняли, клетки переводили в DMEM без FCS и дополнительно инкубировали 24 ч. Ингибиторы сигнальных протеинкиназ и синтетические лиганды ядерных рецепторов добавляли за 1 ч до внесения TNFa в культуральную среду. Синтетические лиганды ядерных рецепторов добавляли к клеткам в следующих концентрациях: WY-14643 10 мкМ, МК886 10 мкМ, ТО901317 5 мкМ, GW1929 10 мкМ, GW1929 10 мкМ. Использовали следующие концентрации ингибиторов: SB203580 - 25 мкМ, SP600125 - 10 мкМ, U0126 - 10 мкМ, QNZ - 10 нМ, РР2 - 10 мкМ. Трансфекцию клеток генетическими конструкциями осуществляли методом кальций-фосфатной преципитации, как описано ранее (Graham, van der Eb, 1973). Во всех экспериментах использовали по 3 мкг плазмидной ДНК, 0.5 мкг плазмиды pCMVL (для контроля эффективности трансфекции) и 1 мкг ДНК спермы лосося (размер фрагментов ДНК 200-400 п.о.) на лунку 24-луночного планшета. Ингибиторы, синтетические лиганды и/или TNFa добавляли к клеткам через 24 ч после трансфекции и культивировали 24 ч. Клеточная линия моноцитарной лейкемии человека ТНР-1 была получена из Банка клеточных культур Института Цитологии Российской академии наук и культивировалась в среде RPMI-1640 с 10% FCS ("Биолот»), в атмосфере 5% С02 при 37С. Дифференцировку клеток ТНР-1 в макрофаги проводили, добавляя к клеткам форболовый эфир (phorbol 12-myristate 13-acetate - РМА) (50 нг/мл), как описано ранее (Tedla et al., 2004). Мононуклеары периферической крови человека получали,
используя метод разделения клеток в градиенте Percoll-Hypaque, как описано (Bennett and Breit, 1994).
Животные. Мыши С57В/6 были получены из питомнока "Рапполово" (Россия). Все эксперименты с животными были одобрены комитетом по этичному обращению с животными НИИ экспериментальной медицины РАМН и выполнялись в соответствии с требованиями, изложенными в "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals". (1996) Institute of Laboratory Animal Research, Commission on Life Sciences, National Research Council. National Academy Press Washington, D.C. USA. Для получения перитониальных макрофагов использовали мышей возрастом 2 месяца и весом 16-20 г. Мышиные перитониальные макрофаги получали методом перитониального лаважа, переносили в 24-луночные планшеты (1x10 клеток на лунку) в RPMI с 10% FCS и инкубировали в атмосфере 5% СОг при 37 С.
Р-галактозидазный и люциферазный тесты. Р-галактозидазный тест проводили стандартным способом, используя в качестве субстрата ферментативной реакции о-нитрофенил-Р-О-галактопиранозид. Относительную активность Р-галактозидазы рассчитывали как отношение оптической плотности D420 за 1 ч на 1 мг тотального белка в клеточных лизатах.. Относительную активность люциферазы (RLU) измеряли на люминометре 20/20" ("Turner BioSystems"), используя Luciferase Assay System ("Promega") в соответствии с рекомендациями изготовителя. За единицу активности люциферазы (RLU) принимали свечение в течение 1 мин на 1 мг тотального белка в клеточных лизатах. Относительную активность люциферазы (RLA) выражали в процентах, принимая за 100% величину RLU в необработанных контрольных клетках. Концентрацию белка измеряли по методу Брэдфорд.
Обратная транскрипция. Тотальную РНК из культивируемых клеток выделяли с использованием RNA STAT-60 реагента ("Tel-Test") в соответствии с инструкциями изготовителя. После обработки ДНКазой I, свободной от РНКаз ("Roche Applied Science") (30 мин при 37С, далее реакцию останавливали добавлением EDTA в конечной концентрации 2 мМ 15 мин при 70С для инактивации ДНКазы), концентрация тотальной РНК и ее чистота определялись при помощи спектрофотометра Avaspec-2048 ("Avantes"). 2 мкг тотальной РНК использовали для проведения реакции обратной транскрипции, используя как праймер oligo-dT ("Invitrogen") и обратную транскриптазу M-MLV ("Promega"), для получения одноцепочечной кДНК (15 мин при 70С с праймером dT16, 1 мин на льду, 60 мин при 42С в реакционной смеси, содержащей 0.5 мМ дНТФ, 0.3 мМ MgC12, 75 мМ КС1, 10 мМ DTT, и 8 единиц/мкл обратной транскриптазы, и затем 15 мин при 70С для инактивации обратной транскриптазы).
Полимеразная цепная реакция в реальном времени - Real Time PCR. Праймеры и
зонды для PCR подбирали с использованием программы "РгітегЗ" (Rozen, Skaletsky,
2000). Для Real Time PCR использовали следующие праймеры и зонды к указанным генам
человека и мыши (все последовательности написаны в ориентации 5'-3'):
Человек: GAPDH (AAGGGCATCCTGGGCTAC, GTGGAGGAGTGGGTGTCG, CY5-
TGAGCACCAGGTGGTCTCTGAC-RTQ2), p-actin (AGCCTTCCTTCCTGGGC,
CGGATGTCCACGTCACACT, Cy5-TGGAGTCCTGTGGCATCCACGA-RTQ2), apoA-I
(CCTTGGGAAAACAGCTAAACC, CAGCTTGCTGAAGGTGGAG, FAM-
AGCTCCTTGACAACTGGGACAGCGT-BHQ1), LXRa (TCACCTTCCTCAAGGATTTCA,
TCGAAGATGGGGTTGATGA, ROX-TAACCGGGAAGACTTTGCCAAAGCA-RTQ2),
LXRp (CAGCAAGGACGACTTCCA, CCGCGAGAACTCGAAGAT, R6G-
AGGCCTGCAGGTGGAGTTCATCAAC-RTQ1), PPARa (TCACAAGTGCCTTTCTGTCG,
TCTTGGCATTCGTCCAAAA, ROX-GGATGTCACACAACGCGATTCG-RTQ2),
HNF4a (CGTGCTGCTCCTAGGCAA, GTCAAGGATGCGTATGGACAC, R6G-
GAGCTGGCGGAGATGAGCCG-RTQ1), PPARy (TGAC AGCGACTTGGC AAT,
TGGGCTTCACATTCAGCA, R6G-TATTCTCAGTGGAGACCGCCCAGGT-RTQ1), Мышь: apoA-I (TATGTGGATGCGGTCAAAGA, ACGGTTGAACCCAGAGTGTC, FAM-CCTCCTCCTTGGGCCAACAGCT-RTQ1), p-actin (CTGGCACCACACCTTCTACA, CTTTTCACGGTTGGCCTTAG, ROX-GCACCCTGTGCTGCTCACCG). Все варианты использованных праймеров и зондов (кроме праймеров к ароА-1 мыши и к [3-актину мыши) были подобраны таким образом, что они не были способны амплифицировать геномную ДНК (один из пары праймеров располагается на границе двух экзонов). Кроме того, в качестве отрицательного контроля использовались следующие варианты: а) без добавления в реакционную смесь обратной транскриптазы, б) без добавления матрицы для проверки загрязнения реакционной смеси молекулами ДНК. Для оптимизации мультиплексирования (анализа экспрессии четырех различных генов в одной пробирке) были подобраны условия, при которых происходило скорейшее нарастание амплификации продуктов PCR (значения Ct). Для проведения реакции RealTime-PCR использовали следующие значения: 95С 300 с, затем 40 циклов при 95С 25 с и 60С 45 с в случае TaqMan и 95С 300 с, затем 40 циклов при 95С 30 с, 60С 20 с и 72С 30 с в случае SyberGreen. Использовали наборы для проведения TaqMan и Syber Green RealTime-PCR производства компании «Синтол» (каталожные номера R-412 и R-402). Реакционная смесь (25мкл) содержала 0.25 мМ дНТФ, 2.5 MMMgC12, 0.05 единиц/мкл Taq - полимеразы («Синтол»), 0.25 pmol/мкл каждого из праймеров, 0.125 pmol/мкл зонда. Реакцию проводили с использованием амплификатора ANK32 производства компании «Синтол». Число циклов (значения Ct), необходимое для достижения порогового уровня флуоресценции, превышающего 10 стандартных отклонений от уровня фруктуаций фоновой флуоресценции, определяли при помощи программного обеспечения ANK32 («Синтол»). Относительные значения количеств кДНК (в процентах от контрольного образца) рассчитывали по формуле (2 1 контрль" 1 р33^ х Ю0. Рассчитанные количества кДНК каждого из генов нормировали по уровню экспрессии гена «домашнего хозяйства», кодирующего глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (gapdh) или бета-актин, и представляли как относительный уровень экспрессии гена, принимая за 100% уровень экспрессии в контрольных клетках.
Иммунопреципитация хроматина (СЫР). Иммунопреципитацию хроматина проводили, как описано ранее (Martens et al., 2005). Фрагментацию хроматина проводили обработкой лизированных клеток HepG2 ультразвуком при 0С, используя генератор ультразвука УЗДН-1 (4 раза по 20 с при силе тока 0.3 А, частота звуковых колебаний 44 кГц), получая, в результате фрагменты хроматина длинной 200-300 п. о. Оценку количества фрагментов ДНК, соответствующих гепацитарному энхансеру гена ароА-І, в связанной с антителами и несвязанной фракциях хроматина проводили методом RealTime PCR с помощью праймеров и зонда, специфичных к данному участку гена apoA-I: HRE-c (5-hre-c: GCTTGCTGTTTGCCCACT, 3-hre-c: GGTCCTGGCAATGTGGAA, h-hre-c: FAM-CCCAGGGACAGAGCTGATCCTTG-BHQ1). В качестве отрицательного контроля использовали преципитацию неспецифическими IgG человека. Количества преципитированного хроматина, содержащие последовательность гепацитарного энхансера гена ароА-1 нормировали по общему содержанию такой последовательности в образце хроматина
Иммуноферментный анализ (ELISA). Человеческий АроА-1 в культуральных средах определяли методом иммуноферментного анализа с использованием поликлональных антител кролика против человеческого АроА-1 и вторых антител козы против кроличьих IgG, сконъюгированных с пероксидазой хрена. Поликлональные кроличьи антитела против человеческого АроА-1 были описаны ранее (McVicar et al., 1984), было установлено, что эти антитела не связывают белки FCS.
Вестерн-блоттинг. Клетки трижды отмывали PBS, затем лизировали в буфере RIPA-50 (50 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 1 мМ EDTA, 0.1% SDS and 0.01% NaN3, 1 мМ
PMSF, рН 7.4). SDS-элетрофорез белков проводили в 7% или 12% полиакриламидном геле. Вестерн-блоттинг проводили, как описано (Kim et al., 2009), используя систему детекции Enhansed Chemoluminiscent (ECL).
Иммуноцитохимия. Для иммуноцитохимического анализа экспрессии АроА-1 макрофаги ТНР-1 культивировали на пластиковых покровных стеклах (Tissue Culture Coverslips 13 mm, "Sarstedt"), а все манипуляции с моноцитами ТНР-1 проводили в суспензии. Клетки ТНР-1 фиксировали в 4% параформальдегиде на PBS в течение 20 мин при +4С, трижды отмывали PBS. Для детекции внутриклеточного АроА-1 клетки пермеабилизировали добавлением 0.1% TritonX-100, 1% BSA на PBS в течение 10 мин при +22С; в случае определения АроА-1, связанного с наружной поверхностью клеточной мембраны, пермеабилизацию не проводили. Далее препараты блокировали в течение 40 мин при +22С в блокирующем буфере (1% BSA, 0.02% Tween-20, 1 мкг/мл неспецифических IgG человека на PBS). Клетки обрабатывали мышиными моноклональными антителами против АроА-1 человека в разведении 1:250 в 1% BSA, 0.02% Tween-20 на PBS при +37С, 2 ч. После двукратной отмывки блокирующем буфером добавляли козьи поликлональные антитела меченые FITC против IgG мыши (Abeam, ab6669-l) в разведении 1:1000 в 1% BSA, 0.02% Tween-20 на PBS при +22С 1 ч, трижды отмывали блокирующем буфером, один раз PBS и заключали в среду Vectashield (Vector Labs, USA), содержащую 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). В качестве контроля специфичности иммунного окрашивания использовали клетки, которые не обрабатывали антителами против АроА-1, но обрабатывали антителами, мечеными FITC. Клетки анализировали методом лазерной сканирующей конфокальной микроскопии при помощи Leika TCS SPE LCSM. Проточная цитофлуорометрия. Моноциты и макрофаги ТНР-1 культивировали в 24-луночных планшетах, как описано выше. Анализ клеток проводили при помощи проточного цитофлуориметра Epic Altra (Beckman Coulter, USA) и полученные результаты анализировали с использованием программного обеспечения Ехро32 (Beckman Coulter, USA).
Получение ядерных экстрактов, гель-ретардация и супер-шифт в геле. Ядерные
экстракты из культивируемых клеток получали, как описано (Andrews and Faller, 1991).
Концентрацию белка в ядерных экстрактах определяли по методу Бредфорд. В
экспериментах по гель-ретардации использовали синтетические двуцепочечные
олигонуклеотиды: HRE-A: 5'-CATGAACCCTTGACCCCTGCCCTG-3' и
3'-CTTGGGAACTGGGGACGGGACTGT-5'; HRE-C: 5'-
CTTGAGCTGATCCTTGAACTCTTAAG-3' и З'-CTCGACTAGGAACTTGAGAATTCTAGS'. Олигонуклеотиды метили [a32P]dCTP или [a32P]dGTP посредством ДНК-полимеразы фага Т4 (обменная реакция по 3'-концу), или посредством фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I (достройка выступающих 5'-концов), а также [у Р]АТР посредством полинуклеотидкиназы фага Т4, согласно (Kadonaga et al., 1987). Ретардацию выполняли, как описано (Kadonaga et al., 1987). Для проведения экспериментов по супер-сдвигу в геле к белкам ядерных экстрактов перед добавлением меченых олигонуклеотидов добавляли указанные антитела (2 мкг в 10 мкл) и инкубировали 1 ч при 4С. Пробы разделяли электрофорезом в 5% неденатурирующем полиакриламидном геле. Гель, приготовленный на трис-боратном буфере, фиксировали в 10% этаноле + 10% уксусной кислоте в течение 15 мин, высушивали и радиоавтографировали.
Статистический анализ. Результаты представляли как среднее значение ± стандартная ошибка среднего значения. Статистический анализ различий между сравниваемыми группами выполняли с использованием проверки по непарному ґ-критерию Стьюдента, либо по критерию Даннета в случаях множественного сравнения с контрольной группой. Все статистические анализы выполняли с использованием программы Statistica 5.0, "StatSoft, Inc., США".
