Введение к работе
Актуальность темы. D-глюкуронил С5-эпимераза является ключевым ферментом биосинтеза гепарансульфат протеогликанов (ГСПГ), которые представляют собой класс сложных биологических молекул, состоящих из корового белка и одной или нескольких полисахаридных цепей гликозаминогликанов (ГАГ). Благодаря структурной сложности и разнообразию ГСПГ выполняют множество различных функций в организме - во внеклеточном матриксе, помимо структурной функции, они участвуют в межклеточных взаимодействиях, во взаимодействиях клетки с внеклеточным матриксом, процессах адгезии и миграции; на поверхности клеток осуществляют сигнальные функции, выступая в качестве рецепторов и корецепторов для различных факторов роста и цитокинов. Функции протеогликанов во многом обусловлены модификациями углеводных цепей гликозаминогликанов, включающими N- и О-сульфатирование по разным положениям и эпимеризацию D-глюкуроновой кислоты (GlcA) в L-идуроновую кислоту (IdoA), которая повышает гибкость полисахаридных цепей гепарансульфат протеогликанов, обеспечивая их эффективное взаимодействие с лигандами. Изменение соотношения IdoA/GlcA наблюдается при злокачественной трансформации различных тканей и клеток (Mikami et al, 2001; Loussouarn et al, 2008). За процесс эпимеризации уроновых кислот отвечает фермент D-глюкуронил С5 эпимераза (GLCE), играющий важную роль в процессах морфогенеза и жизнедеятельности живых организмов - мыши, нокаутные по гену GLCE, погибают сразу после рождения и имеют дефекты развития почек, легких и скелета (Li et al, 2003).
Ранее в нашей лаборатории было показано, что экспрессия GLCE значительно снижена в большинстве злокачественных опухолей молочной и предстательной железы человека и в клетках мелкоклеточного рака легкого (Grigorieva et al, 2008; Прудникова, 2009). Эктопическая экспрессия GLCE подавляла пролиферативную активность опухолевых клеток молочной (Prudnikova et al, 2010) и предстательной желез человека (Прудникова, 2009), мелкоклеточного рака легкого in vitro и рост экспериментальных опухолей in vivo (Grigorieva et al, 2011). Полученные данные впервые позволили охарактеризовать GLCE в качестве нового гена супрессора опухолевого роста, однако молекулярные механизмы антипролиферативного действия эпимеразы и причины снижения уровня экспрессии этого гена в опухолевых клетках оставались неизученными.
Известно несколько молекулярных механизмов, обеспечивающих эпигенетическую инактивацию генов супрессоров опухолевого роста. Одними из самых распространенных механизмов являются гиперметилирование промоторной области гена, приводящее к снижению уровня его экспрессии в клетке, и эпигенетическая регуляция экспрессии гена на уровне хроматина, которая определяется степенью модификации гистонов (ацетилирование, фосфорилирование, метилирование, убиквинтинирование) и, как следствие, структурой нуклеосом (Veeck et al, 2010). Немаловажную функцию в регуляции экспрессии генов играет также активность различных факторов транскрипции. Кроме того, регуляция активности генов может осуществляться и на пост-транскрипционном уровне малыми РНК - наиболее древний и консервативный механизм, называемый РНК-интерференцией (Bartels et al, 2009).
Поскольку молекулярные механизмы регуляции экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы на данный момент практически неизучены, особую актуальность имеет поиск причин инактивации D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках, а также определение возможных молекулярных механизмов ее антипролиферативного действия.
Цель работы: оценить влияние D-глюкуронил С5-эпимеразы на экспрессию генов, участвующих в процессе канцерогенеза, и определить возможные молекулярные механизмы ее регуляции в опухолевых клетках и тканях.
Задачи исследования:
-
Определить влияние D-глюкуронил С5-эпимеразы на экспрессию генов, участвующих в процессе канцерогенеза в опухолевых клетках молочной, предстательной желез и рака легкого человека.
-
Определить статус метилирования промоторной области гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолях молочной и предстательной желез человека.
-
Изучить влияние изменения структуры хроматина на экспрессию D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках.
-
Определить роль факторов транскрипции TCF4 и -катенина в регуляции экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках.
-
Оценить вклад микроРНК-218 в регуляцию экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках.
Научная новизна работы
В данной работе впервые было показано, что:
-
Восстановление экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы в клетках рака молочной и предстательной желез и мелкоклеточного рака легкого человека приводит к изменению экспрессии генов, участвующих в молекулярных механизмах ангиогенеза и инвазии/метастазирования,
-
регуляция экспрессии эпимеразы осуществляется как на транскрипционном, так и на пост-транскрипционном уровне через сложный комплекс эпигенетических механизмов регуляции экспрессии генов
-
в отличие от других генов-супрессоров развития опухоли, метилирование не играет роли в регуляции экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых тканях молочной и предстательной желез человека
-
степень модификации гистонов Н3К9Ас и Н3К4Ме3 влияет на экспрессию D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках молочной железы человека
-
экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках молочной железы in vitro и опухолях in vivo коррелирует с уровнем экспрессии TCF4 и -катенина
-
микроРНК-218 приводит к снижению экспрессию белка D-глюкуронил С5-эпимеразы в клеточных культурах рака молочной и предстательной желез in vitro
Практическая значимость
Данная работа носит преимущественно фундаментальный характер и представляет собой определение возможных молекулярных механизмов антипролиферативного эффекта и инактивации D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках человека. Однако результаты исследования показали и возможность практического применения полученных данных для создания нового метода дифференциальной диагностики различных опухолей и выбора оптимальной стратегии лечения пациентов. Так, в ходе работы была показана активация экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы ингибитором гистоновых деацетилаз трихостатином А, который в настоящее время активно применяется в клинической практике в качестве антиопухолевого препарата. Диагностическое определение уровня экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы будет иметь важное значение для определения группы пациентов, для которых показано лечение этим препаратом.
Наряду с возможным использованием D-глюкуронил С5-эпимеразы в качестве нового дифференциального диагностического маркера, интересные перспективы связаны со способностью эпимеразы регулировать процессы опухолевого ангиогенеза и инвазии/метастазирования, что позволит рассмотреть возможность создания на ее основе нового анти-ангиогенного и /или антиметастатического препарата для лечения злокачественных новообразований.
Положения, выносимые на защиту:
-
Эктопическая экспрессия D-глюкуронил C5-эпимеразы в опухолевых клетках рака молочной и предстательной желез и мелкоклеточного рака легкого человека приводит к изменению активности генов канцерогенеза, продукты которых участвуют в молекулярных механизмах ангиогенеза и инвазии/метастазирования.
-
Тканеспецифичное действие эпимеразы заключается в регуляции экспрессии различных генов-супрессоров опухолевого роста (рак молочной железы) или факторов роста и их рецепторов (клетки мелкоклеточного рака легкого)
-
В опухолевых тканях молочной и предстательной желез не обнаружено гиперметилирование промоторной области гена D-глюкуронил С5-эпимеразы
-
Степень ацетилирования и метилирования лизиновых остатков гистонов Н3 влияет на экспрессию D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках молочной железы человека зависит от.
-
Экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы в культуре опухолевых клеток in vitro и опухолях молочной железы in vivo положительно коррелирует с уровнем экспрессии TCF4/-катенин-транскрипционного комплекса
-
МикроРНК-218 регулирует уровень белка D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевых клетках молочной и предстательной желез in vitro
Апробация работы
Результаты работы были представлены и обсуждены на V региональной конференции молодых ученых-онкологов им. академика РАМН Н.В.Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, Россия, 2010); на 1 Британской Конференции по изучению рака молочной железы человека (1st British Breast Cancer Research Conference; Ноттингем, Великобритания, 2010); на XXIII Международной зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, Россия, 2011); на 16 Всемирном Конгрессе по Современным Достижениям в Онкологии и 14 Международном Симпозиуме по Молекулярной Медицине (16th World Congress on Advances in Oncology and 14th International Symposium on Molecular Medicine; Родос, Греция, 2011); на 8 Европейской конференции по исследованию рака молочной железы (8th European Breast Cancer Conference, Вена, Австрия, 2012).
Публикации: По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Структура работы: Диссертационная работа изложена на 105 страницах машинописного текста с полуторным интервалом, состоит из 6 разделов: введение, обзор литературы, материалов и методов, результатов, и обсуждения результатов, выводов, а так же списка цитируемой литературы, содержащего 2 отечественных и 131 зарубежных источника. Работа иллюстрирована 1 таблицей и 37 рисунками.
