Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Микросомальная монооксигеназная система в метаболизме экзогенных и эндогенных соединений
1.1.1. Цитохром Р450 - ключевой компонент микросомальной монооксигеназной системы
1.1.2. Множественные формы цитохромов Р450 15
1.1.3. Феномен индукции цитохромов Р450 18
1.1.3.1. Индукторы цитохромов Р450 20
1.1.3.2. Молекулярные механизмы индукции цитохромов Р450 20
1.2. Характеристика цитохромов Р450 подсемейства 23
1.2.1. Субстратная специфичность СYP1А1 иСУР1А2 26
1.2.2. Регуляция экспрессии гена цитохрома Р450 1А1 27
1.2.2.1. Индукция цитохрома Р450 1А1 полициклическими ароматическими ? углеводородами
1.2.2.2. Неклассические индукторы CYP1A1 32
1.2.2.3. Негативная регуляция CYP1A1 35
1.2.3. Регуляция экспрессии гена цитохрома Р450 1А2 37
1.2.4. Роль физиологических факторов в индукции CYP1А 40
1.2.4.1. Эндогенные индукторы СYP1А 40
1.2.4.2. Старение и стресс: влияние на регуляцию экспрессии CYP1А 43
1.2.5. Межлинейные различия в активности CYP1А у мышей 45
Заключение 47
ГЛАВА 2. Материалы и методы 48
2.1. Материалы 48
2.2. Животные 49
2.3. Методы исследования 49
2.3.1. Индукция CYP1А в микросомах печени мышей 49
2.3.2. Воздействие на животных иммобилизационным стрессом 49
2.3.3. Выделение микросом печени мышей 50
2.3.4. Определение концентрации белка в микросомах 50
2.3.5. Определение общего содержания цитохрома Р450 в микросомах печени 51
2.3.6. Вертикальный электрофорез белков в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях
2.3.7. Полусухой электроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану 51
2.3.8. Иммунохимический анализ белков микросом 52
2.3.9. Определение ферментативной активности CYP1A1 HCYP1A2 52
2.3.10. Получение препаратов суммарной РНК из клеток печени мышей 53
2.3.11. Электрофорез РНК в частично денатурирующих условиях 53
2.3.12. Определение концентрации РНК в образце 54
2.3.13. Реакция обратной транскрипции 54
2.3.14. Мультиплексная полимеразная цепная реакция (ПЦР) 55
2.3.15. Анализ продуктов ПЦР 56
2.3.16. Получение препаратов геномной ДНК 57
2.3.17. Секвенирование продуктов ПЦР 57
2.3.18. Статистическая обработка данных 58
ГЛАВА 3. Результаты 59
3.1. Индукция CYP1A1 и CYP1A2 в печени инбредных линий мышей, обработанных 3-метилхолантреном (MX) и о-аминоазотолуолом (О AT)
3.1.1. Иммунохимический анализ микросомал ьных белков С YP1А1 и С YP1А2 59
3.1.2. Ферментативная активность CYP1A1 и CYP1A2 в печени мышей 61
3.1.3. Уровень экспрессии генов CYP1A1,CYP1A2, AhR и ARNT 63
3.1.3.1. Исследование экспрессии генов CYP1A1, CYP1A2, AhR и ARNT в зависимости от времени после введения MX в качестве индуктора
3.1.3.2. Содержание мРНК цитохромов Р450 1А1 и 1А2 в печени мышей 67
3.1.3.3. Содержание мРНК AhR и ARNT в печени мышей при индукции MX 69
3.2. Сравнительный анализ регуляторной последовательности гена CYP1A2 „. (от -4675 до -4204) у мышей инбредных линий
3.3. Влияние стресса на индукцию цитохрома Р4501А 74
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 78
Заключение 92
Выводы 94
Список литературы
- Микросомальная монооксигеназная система в метаболизме экзогенных и эндогенных соединений
- Характеристика цитохромов Р450 подсемейства
- Индукция CYP1А в микросомах печени мышей
- Индукция CYP1A1 и CYP1A2 в печени инбредных линий мышей, обработанных 3-метилхолантреном (MX) и о-аминоазотолуолом (О AT)
Введение к работе
Цитохромы Р450 (CYP) подсемейства 1А окисляют многие канцерогены с образованием активных метаболитов, способных связываться с нуклеофильными сайтами макромолекул клетки, что может приводить к различным токсическим процессам, в том числе канцерогенезу (Pelkonen, Nebert, 1982; Nebert, McKinnon, 1994; Ioannides, Lewis, 2004). В свою очередь, канцерогенные соединения, особенно относящиеся к полициклическим ароматическим углеводородам (ПАУ), вызывают индукцию этих CYP, что сопровождается многократным увеличением, как уровня их мРНК, так и ферментативных активностей (Nebert, 1994; Cheung et al, 1994; Shimada, 2006). Токсический эффект от канцерогена, попавшего в живой организм, определяется количеством его активного метаболита, который может образоваться, и эффективностью его детоксификации, что напрямую зависит от уровня индуцируемой формы цитохрома Р450, активирующей канцероген. У большинства видов млекопитающих подсемейство 1А состоит из двух форм: CYP1A1 и CYP1A2. Цитохром Р450 1А (CYP1A) наиболее изучен у экспериментальных животных: крыс и мышей. CYP1A1 и CYP1A2 осуществляют биоактивацию многих прооксидантов и проканцерогенов: Р450 1А1 - бенз[д]пирена и других ПАУ, Р450 1А2 - ПАУ, ароматических аминов, нитрозоаминов, парацетамола, гетероциклических аминов (Nebert, 1994; Ioannides, Lewis, 2004).
Показано, что для активации генов CYP1A необходимо взаимодействие цитозольного белка - Ah-рецептора с ксенобиотиком, транслокация активированного комплекса в ядро с последующим его взаимодействием с ядерным фактором ARNT и, наконец, взаимодействие вновь образованного комплекса Ah-рецептор - ARNT с цис-активными элементами генов CYP1A (Whitlock, 1999; Nebert et al., 2004; Fujii-Kuriyama, 2005).
В окислительном метаболизме лекарств и других ксенобиотиков, как в популяции людей, так и грызунов, существенную роль играет полиморфизм генов CYP, в том числе CYP1A1 и CYP1A2 (Nebert et al., 2004; Daly, 2003). В последнее время проводятся интенсивные исследования в данной области. Впервые такие генетические различия показаны на инбредных линиях мышей.
Так, введение ПАУ мышам индуцибельных линий, обладающих генотипом Ah Ahb или AhbAh (Ah+ генотип), приводит к значительному увеличению активности CYP1A1 и CYP1A2, тогда как у мышей, обладающих генотипом AhdAhd (Ah- генотип), этого не наблюдается (Nebert, 1989). Инбредные линии мышей широко используются в качестве модели для изучения механизмов активации генов цитохрома Р450, а также процессов химического канцерогенеза. Показано, что такие мыши различаются по чувствительности к канцерогенному действию ПАУ, аминоазобензолов и других соединений (Gonzalez et al., 1993; Nebert et al., 2004; Каледин и др., 1990; Каледин и др., 1999; Захарова и др., 1998; Гуляева и др., 2000). Однако молекулярный механизм таких различий остается до конца не исследованным. Кроме того, выявлен и Ah-независимый механизм индукции цитохрома Р450 1А2 (Chaloupka et al., 1994; Nerurkar et al., 1993). Bee это говорит о более сложной картине регуляции экспрессии цитохрома Р450 1А в генетически различающихся линиях мышей, чем существующие на сегодняшний день представления, объясняющие это явление лишь различиями в генотипе Ah рецептора. В связи с этим представляется весьма актуальным исследование индукции цитохромов Р450 1А1 и 1А2 в норме и при воздействии ксенобиотиков в печени мышей, различающихся по чувствительности к индуцирующему действию ПАУ-соединений.
Целью настоящей работы является исследование регуляции экспрессии генов цитохрома Р450 1А в печени мышей, различающихся по генотипу Ah рецептора, при индукции химическими канцерогенами и под влиянием физиологических факторов.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
Определить содержание мРНК, наличие белка и ферментативную активность CYP1A1 и CYP1A2 в печени инбредных линий мышей, различающихся по генотипу Ah рецептора при индукции 3-метилхолантреном и о-аминоазотолуолом;
Для выяснения роли транскрипционных факторов в регуляции экспрессии генов цитохрома Р450 подсемейства 1А определить уровень экспрессии генов AhR и ARNT в печени инбредных линий мышей, различающихся по генотипу Ah рецептора при индукции 3-метилхолантреном;
Провести сравнительный анализ регуляторной последовательности гена CYP1A2 (от -4675 до -4204), содержащей энхансерные модули, необходимые для конститутивной экспрессии гена CYP1A2, у инбредных линий мышей;
На модели иммобилизационного стресса исследовать влияние физиологических факторов на индукцию цитохрома Р4501А у молодых и старых животных.
Таким образом, использование генетической модели мышей с одновременным измерением таких параметров, как активность ферментов и экспрессия соответствующих генов, а также уровень экспрессии транскрипционных факторов, вовлеченных в индукцию, возможно, позволит выстроить последовательность молекулярных событий активации генов цитохрома Р450 1А для мышей с различным генотипом Ah-рецептора.
Научная новизна работы
Несмотря на то, что исследования механизмов индукции цитохромов Р450 подсемейства 1А и регуляции экспрессии их генов ведутся на протяжении многих лет, вопрос о том, как экспрессируются гены основных транскрипционных факторов AhR и ARNT, оставался нерешенным. В данной работе была впервые определена конститутивная экспрессия этих факторов в печени инбредных линий мышей, различающихся по чувствительности к индукции цитохрома Р4501А различными канцерогенными полициклическими углеводородами (ПАУ).
Впервые было проведено комплексное исследование экспрессии транскрипционных факторов AhR, ARNT и их генов-мишеней CYP1A1 и CYP1A2 в печени мышей различных инбредных линий при индукции 3-метилхолантреном. Впервые была измерена динамика накопления мРНК исследуемых генов и выявлен максимум ее синтеза в интервале 10-20 часов после воздействия индуктора. Показано, что в печени мышей, как чувствительных к индуцирующему действию ПАУ (Ah+ генотип), так и дефектных по этому рецептору линиях (Ah"), определяется существенное
8 количество мРНК CYP1A2, AhR, ARNT. Впервые показано наличие транскрипта гена CYP1A1 при индукции MX и О AT в печени линий SWR, AKR и DBA, ранее считавшихся нечувствительными к ПАУ-индукции линиями. Эти результаты свидетельствуют о более сложном механизме формирования чувствительности к индуцирующему действию ПАУ, чем это считалось ранее.
Наличие при индукции MX увеличения содержания мРНК CYP1A у всех линий, независимо от генотипа Ah рецептора, указывает на то, что межлинейные различия не связаны с дефектом Ah рецептора. Полученные данные позволяют предположить существование транскрипционных механизмов регуляции CYP1A у мышей Ah+ линий и CYP1A2 у линии SWR (Ah'), и посттранскрипционных - у мышей AKR и DBA (Ah').
В работе впервые показано влияние возраста и стресса на экспрессию генов CYP1A1, CYP1A2, AhR и ARNT. Содержание мРНК исследуемых генов, за исключением CYP1A1, различается между группами взрослых и старых животных. Содержание мРНК CYP1A2 и ARNT в печени старых мышей заметно выше, чем в печени взрослых особей, в то время как содержание мРНК AhR у старых животных понижено по сравнению со взрослыми. Кроме того, под влиянием стресса увеличивается экспрессия генов CYP1A2, AhR и ARNT, что в большей мере проявляется у взрослых особей. Полученные результаты указывают на существенное ослабление реакции адаптации на стресс у старых животных.
Научно-практическая значимость работы
По своему содержанию работа носит преимущественно фундаментальный характер и представляет собой исследование молекулярных механизмов индукции CYP1A в печени инбредных линий мышей. Важность исследования экспрессии генов AhR, ARNT, CYP1A1 и CYP1A2, прежде всего, определяется вовлечением кодируемых ими белков в процессы канцерогенеза, особенно на его инициирующих этапах. Этот факт имеет фундаментальное значение для понимания механизма действия канцерогенных химических соединений на организм животных и человека и ведет к раскрытию природы фундаментальных биологических процессов в клетке.
9 Изучение механизмов воздействия канцерогенов на организм имеет также важное практическое значение как для экспериментальной работы, так и клинических исследований в ближайшем будущем.
Так, результаты, свидетельствующие об индивидуальных различиях в индукции CYP1A у мышей, генетически различающихся по чувствительности к ПАУ, важно учитывать при изучении механизмов химически индуцированного канцерогенеза, где традиционно используются данные линии мышей. Данные об экспрессии генов CYP1A и их транскрипционных факторов важны в разработке новых высокочувствительных тестов по определению канцерогенной активности химических соединений. Понимание механизмов биоактивации проканцерогенов раскрывает широкие перспективы для предотвращения и/или модификации канцерогенеза в терапевтических целях.
Основные положения, выносимые на защиту
При введении как MX, так и ОАТ, активность CYP1A1 и CYP1A2 в печени мышей увеличивается у линий с генотипом Ah+, и не изменяется у мышей с генотипом Ah", что подтверждает наличие генетических различий в индуцибельности цитохрома Р450 1А у мышей.
Под действием как MX, так и ОАТ, содержание мРНК CYP1A2 увеличивается у мышей всех линий, за исключением мышей SWR. Содержание мРНК CYP1A1 также увеличивается у всех линий мышей, независимо от генотипа Ah рецептора, в том числе у мышей SWR, AKR и DBA, традиционно считающихся нечувствительными к индукции ПАУ.
Вне зависимости от генотипа Ah рецептора в печени мышей определяется мРНК транскрипционных факторов AhR и ARNT, причем введение MX существенно не влияет на уровень их экспрессии. Вместе с результатами по экспрессии генов CYP1A1 и CYP1A2 это свидетельствует о том, что межлинейные различия у мышей в чувствительности к индукции ПАУ обусловлены не только дефектом Ah-рецептора.
Последовательность регуляторной области гена CYP1A2 (от -4675 до -4204), содержащая энхансерные модули, необходимые для конститутивной экспрессии гена CYP1A2, у различных инбредных линий мышей является
10 консервативной и не связана с межлинейными различиями в экспрессии CYP1A2 и чувствительностью к гепатоканцерогенному действию ОАТ. 5. Уровень экспрессии исследуемых генов, за исключением CYP1A1, различается у молодых и старых мышей в норме и под воздействием стресса. Содержание мРНК CYP1A2 и ARNT в печени старых мышей заметно выше, чем в печени молодых особей, в то время как содержание мРНК AhR у старых животных понижено по сравнению с молодыми. Под влиянием стресса увеличивается экспрессия генов CYP1A2, AhR и ARNT, что в большей мере проявляется у молодых особей и может свидетельствовать об отсутствии или существенном ослаблении у старых животных реакции адаптации на стресс.
Апробация работы
Результаты работы были представлены и обсуждены на международном симпозиуме «13th International Symposium on Microsomes and Drug Oxidations» Стреза, Италия, 2000; на международном конгрессе «7th ESACP Congress» Кон, Франция, 2001; на международной конференции «18th European Workshop on Drug Metabolism» Валенсия, Испания, 2002; на Второй научной конференции с международным участием "Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии" Новосибирск, Россия, 2002; на международной конференции «11th North American ISSX Meeting» Орландо, США, 2002; на международном конгрессе «3rd European Congress of Biogerontology» Флоренция, Италия, 2002; на международной конференции «8th European ISSX Meeting» Дижон, Франция, 2003; на международном симпозиуме «8th Symposium on Catecholamines and other Neurotransmitters in Stress» Смоленице, Словакия, 2003; на международной конференции «7th International ISSX Meeting» Ванкувер, Канада, 2004.
Публикации. Автор имеет 25 печатных работ, из них 13 - по теме диссертации.
Автор выражает глубокую благодарность научным руководителям -заведующей лабораторией молекулярных механизмов канцерогенеза НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, профессору, доктору биологических наук, Гуляевой Людмиле Федоровне и заведующему Группой Фармакогеномики Инстититута Химической Биологии и Фундаментальной Медицины СО РАН, кандидату биологических наук, Филипенко Максиму Леонидовичу - за руководство работой на всех ее этапах, неоценимую методическую помощь, а также за помощь в написании диссертации.
Автор благодарит директора НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, академика РАМН, Ляховича Вячеслава Валентиновича за постоянную поддержку и консультации.
Автор выражает особую признательность Каледину Василию Ивановичу (Институт Цитологии и Генетики СО РАН), в тесном сотрудничестве с которым были выполнены большинство исследований.
Автор благодарит заведующего лабораторией генно-инженерных методов исследования НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН Коваленко Сергея Петровича за внимательное прочтение диссертации и ценные замечания.
Автор благодарит весь коллектив НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, а также всех сотрудников Группы Фармакогеномики Инстититута Химической Биологии и Фундаментальной Медицины СО РАН, за прекрасную творческую и дружескую атмосферу.
Микросомальная монооксигеназная система в метаболизме экзогенных и эндогенных соединений
Важную роль в жизнедеятельности организма играет микросомальная монооксигеназная система (ММС), ответственная за метаболизм разнообразных соединений, таких как лекарства, химические соединения, загрязняющие окружающую среду, пищевые добавки, природные алкалоиды, стероиды, жирные кислоты, простагландины и витамины. Данная система представляет собой комплекс ферментов, локализованных в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) большинства эукариотических клеток. Среди этих ферментов особое значение имеет цитохром Р450, являющийся, по определению, многих исследователей, «основным солистом» в метаболизме ксенобиотиков. В 1958 году был открыт гемопротеид, обладающий способностью связываться с СО с образованием комплекса с максимумом поглощения в области Соре, равным 450 нм (Garfinkel et al., 1958; Klingenberg, 1958). Ранее был обнаружен новый тип оксидоредуктаз, которые требуют обязательного присутствия восстановительных пиридиннуклеотидов - НАДФН и НАДН и окисляют разнообразные субстраты, внедряя в них один атом из молекулярного кислорода (Mason et al., 1955; Hayaishi et al., 1957). Позднее, в 1964 году, Omura и Sato установили, что цитохром Р450 является гемопротеидом b-типа и характеризуется атипичной полосой поглощения карбонильного комплекса в восстановленном состоянии на 450 нм, что и послужило основой для его названия. В 1974 году в двух лабораториях разными методами были впервые получены гомогенные фракции цитохрома Р450 (Imai, Sato, 1974; Van der Hoeven etal., 1974).
Второй компонент микросомальной гидроксилирующей системы -НАДФН-цитохром Р450 редуктаза, относится к классу флавопротеидов. Биохимическая функция этого фермента состоит в транспорте электронов от донора НАДФН к цитохрому Р450, которые необходимы для активации кислорода в комплексе цитохрома Р450 с субстратом. Активность этого фермента обычно определяется по восстановлению какого-либо акцептора электронов - цитохрома с, феррицианида (Masters et al., 1967) или непосредственно цитохрома Р450 (Masters, Okita, 1979). Этот фермент тоже был изолирован из микросомальной мембраны (Levin et al., 1974). Препараты редуктазы характеризуются содержанием одной молекулы ФАД и одного ФМН на полипептидную цепочку (Vermilion, Coon, 1978). Спектральное поглощение НАДФН-цитохром Р450 редуктазы характеризуется максимумами на 277, 380, 455 и плечом на 485 нм.
В качестве третьего компонента микросомальной гидроксилирующей системы, необходимого для воспроизведения каталитической активности, являются фосфолипиды (Ляхович, Цырлов, 1978). Анализ участия роли фосфолипидов показывает, что они причастны практически ко всем стадиям гидроксилирования. Одним из путей воздействия на микросомальную систему может быть стабилизация активной конформации цитохрома Р450, а также изменение спинового состояния гема. Эксперименты по воспроизведению каталитической активности очищенных форм цитохрома Р450 продемонстрировали необходимость наличия в системе фосфолипидов (Курченко и др., 1982). Сама структура фосфолипидов микросомальных мембран исключает их возможную роль в качестве компонентов электрон-транспортной цепи. Их влияние на микросомальное окисление объясняется особенностями их физического, а не химического воздействия на отдельные компоненты гидроксилирующей системы (Autor et al., 1973).
Схема действия микросомальной монооксигеназной системы (ММС), впервые описанная Эстабруком с соавт. (Estabrook et al., 1968), в настоящее время подтверждена многими исследователями (рис. 1). Первая стадия состоит во взаимодействии субстрата с окисленной формой цитохрома Р450. При связывании его с субстратами первого типа (углеводороды, алкилированные амины, ненасыщенные химические соединения) происходит переход гемового железа из низкоспинового в высокоспиновое состояние. Вторая стадия состоит в восстановлении образовавшегося фермент-субстратного комплекса первым I электроном, который поступает с НАДФН-специфичной цепи переноса от НАДФН через флавопротеид І (НАДФН-цитохром Р450 редуктазу). Третья стадия состоит в образовании тройного комплекса: восстановленный цитохром Р450-субстрат-кислород. Четвертая стадия представляет собой восстановление тройного комплекса вторым электроном, который, как полагают, поступает из НАДН-специфичной цепи переноса электронов, состоящей из НАДЯ-цитохром Ь5 редуктазы или флавопротеида II и цитохрома Ь5 (Hiang, 1981).
Характеристика цитохромов Р450 подсемейства
Среди множества форм цитохрома Р450 важное место занимают CYP, принадлежащие к подсемейству 1А. У большинства видов млекопитающих, в том числе у мышей, крыс и человека, подсемейство 1А состоит из 2-х форм -CYP1A1 и CYP1A2 (Gonzalez, 1988; Ioannides, Lewis, 2004). Эти формы цитохромов имеют особое значение в химическом канцерогенезе, так как метаболизируют наиболее распространенные канцерогены - полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) (CYP1A1), ариламины и афлатоксины (CYP1A2) (Nebert, McKinnon, 1994; Гуляева и др., 1994).
Нуклеотидная последовательность кДНК этих цитохромов и аминокислотная последовательность соответствующих белков определена для мыши (Kimura et al., 1984), крысы (Kawajiri et. al, 1984; Hines et. al, 1985) и человека (Jaiswal et al., 1985; Jaiswal et al., 1986). Последовательность кДНК CYP1A1 определена также у рыб (Heilmann et. al, 1988). У мыши оба гена расположены на 9 хромосоме, а у человека - на 16 хромосоме. Гены CYP1A1 и CYP1A2 содержат по семь экзонов, при этом, первый экзон является некодирующим (Gonzalez, 1988).
Цитохром Р4501А1 катализирует все реакции окисления бензо(а)пирена с образованием хинонов, фенолов, дигидродиолов и эпоксидов (рис. 3). Метаболитами являются, в том числе, нестабильные электрофильные интермедиаты, способные связываться с макромолекулами клетки (Гуляева и др., 1994). Высокоспецифичным субстратом для CYP1A1 крыс является 7-этоксирезоруфин (Parkinson, 1996).
В человеческой популяции обнаружены 4 аллельных варианта CYP1A1. Мутация Т/С в 3 - некодиругащей области гена приводит к повышенной индуцибельности фермента; этот аллельный вариант оказался ассоциирован с повышенным риском возникновения рака легкого (Tamasi et al., 2003) и молочной железы (Murray et al., 1991). Мутация, приводящая к замене аминокислоты в гем-связывающем участке CYP1A Ile452Val, фенотипически проявляется в виде повышенной активности фермента. У курильщиков с таким генотипом наблюдался повышенный уровень аддуктов бензо(сс)пирена с ДНК, но данные по риску возникновения рака в этом случае противоречивы (Bartsch et al., 2000). Для остальных двух аллельных вариантов фенотипические проявления на данный момент неизвестны (Tamasi et al., 2003).
При индукции ПАУ-соединениями в печени экспериментальных животных наряду CYP1A1 регистрируется другой член этого подсемейства - цитохром Р450 1А2. Этот фермент был также получен в изолированном виде и охарактеризован по спектральным, электрофоретическим и каталитическим свойствам. CYP1A2, в отличие от CYP1A1, конститутивно экспрессируется в печени экспериментальных животных и человека и, следовательно, метаболизирует многие химические соединения без индукции (Schweikl et al., 1993). Экспрессия его гена в культуре гепатоцитов заметно уменьшается, что предполагает контроль гепатоцитарных факторов транскрипции. CYP1A1 катализирует окисление ариламинов, гетероциклических аминов, образующихся при пиролизе белков. Для CYP1A2 мыши показана афлотоксин Bi-4-гидроксилазная активность (Gonzalez, 1988). Показано также участие этого фермента в метаболизме эндогенных соединений, например, стероидов (Aoyama et al., 1990). Интересно отметить, что мыши, гомозиготные по мутантному гену CYP1A2, гибнут вскоре после рождения с симптомами острой дыхательной декомпенсации (distress), что предполагает важную роль CYP1A2 в неонатальном периоде (Pineau et al., 1995). Высокоспецифичным субстратом для CYP1A2 крыс является 7-метоксирезоруфин (Parkinson, 1996).
В настоящее время механизм индукции CYP1A1 детально изучен, что объясняется возможностью экспрессии этого гена в культуре первичных гепатоцитов. Гораздо сложнее обстоит дело с изучением механизмов индукции CYP1A2, так как его ген достаточно трудно экспрессируется в культурах клеток. В различных клеточных культурах и тканях интактных животных в отсутствие индуктора CYP1A1 не экспрессируется. CYP1A2 конститутивно экспрессируется как в печени, так и внепеченочных органах (Gonzalez, Lee, 1996). Экспрессия этого гена в первичной культуре гепатоцитов заметно падает.
При исследовании множественных форм цитохрома Р450 встает вопрос об их идентификации. В настоящее время найдено значительное количество субстратов, являющихся селективными маркерами для изоформ CYP. Так, например, ЭР преимущественно метаболизируется CYP микросом печени животных, обработанных MX (Burke, Mayer, 1974). Вариация алкильных групп в алкоксирезоруфинах привела к тому, что возник целый ряд специфичных субстратов для изоформ CYP1 (Burke et al., 1985). Особенно важны субстраты для CYP1A, так как эти ферменты активируют многие проканцерогены. Традиционно для идентификации CYP1A1 и CYP1A2 используются ЭР и MP соответственно. Однако в последнее время появились сообщения о том, что они являются недостаточно специфичными. Так, нокаутные по гену CYP1A2 мыши показали высокую МРОД активность при индукции ТХДД, что говорит о неспецифичности этой реакции (Hamm et al., 1998). Подобные ситуации значительно усложняют исследования активности форм цитохрома Р450. Решение этой проблемы может быть либо в продолжении поисков более специфичных субстратов, либо в использовании других методов, таких как определение уровня мРНК, либо применение иммунохимических методов с использованием высокоспецифичных антител.
Субстратами для CYP1A1 являются ПАУ, в том числе такие канцерогены, как бенз[д]пирен и бенз[а]антрацен (Kuwahara et al., 1984). В последнее время появились сообщения о том, что этот фермент метаболизирует некоторые гормоны. Так, Доостзаде с соавт. (Doostzadeh et al., 1996) показали, что CYP1A1, экспрессируемый в дрожжах, осуществляет 7Р-гидроксилирование прегненолона с образованием его 7-гидроксилированного метаболита, необходимого для активации иммунной защиты.
Индукция CYP1А в микросомах печени мышей
Каждая экспериментальная группа мышей («молодые» и «старые») была разделена на две подгруппы из семи животных: интактные и те, которые подвергались иммобилизационному стрессу посредством фиксации в положении лежа на спине в течение двух часов. Через час после завершения иммобилизационного воздействия проводили декапитацию животных. В течение семи дней непосредственно перед экспериментом мыши содержались в индивидуальных клетках для снятия эффекта групповых отношений.
Микросомную фракцию печени мышей выделяли общепринятым методом дифференциального центрифугирования в среде, содержащей 125 мМ КС1, 20 мМ Трис-HCl (рН 7,4) при температуре + 4 С. Гомогенизирование печени, проводили в гомогенизаторе из органического стекла с пестиком из фторопласта. Полученный гомогенат разделяли на центрифуге ЦВР при 10 000 g в течение 15 минут. Надосадок центрифугировали на ультрацентрифуге VAC -602 при 105 000 g в течение одного часа. Порции по 1 мл S9 фракции замораживали в жидком азоте. Осадок, представляющий фракцию микросом (ЭПР), ресуспендировали до гомогенного состояния в 0,1 М К-фостатном буфере (рН 7,4), содержащем 20% глицерин.
Концентрацию белка в микросомах определяли методом Лоури (Lowry et al., 1951) с использованием в качестве стандарта бычьего сывороточного альбумина. Пробы белка разбавляли водой до конечного объема 400 мкл. К пробам добавляли 2 мл смеси, содержащей 49 частей раствора А (2% ИагСОз в 0,1 М растворе NaOH) и 1 часть раствора В (0,5% водный раствор CuS04-5H20 на 1% растворе цитрата Na). Пробы выдерживали 10 мин при комнатной температуре и добавляли 200 мкл реактива Фолина. Смесь выдерживали 30 минут при комнатной температуре и на спектрофотометре "Hitachi-557" (Япония) измеряли оптическую плотность растворов при длине волны 750 нм против контрольного раствора (вода с реагентами). Для количественной оценки содержания белков предварительно строили калибровочную кривую, используя растворы белка известной концентрации.
Определение количества цитохромов Р450 проводили в соответствии с методом, описанным Омура и Сато (Omura, Sato, 1964). Исследования проводили с помощью дифференциального двухволнового двулучевого спектрофотометра "Hitachi 557" (Япония), снабженного X-Y-самописцем модели 057 ("Hitachi", Япония). Среда инкубации: 0,1 М К-фосфатный буфер (рН 7,4), содержащий 20% глицерин. Количественное определение цитохрома Р450 проводили из дифференциального спектра по разнице между восстановленной дитионитом натрия (кювета сравнения) и СО-восстановленной формами (опытная кювета) на длине волны X = 450 нм. При расчете использовался коэффициент экстинции 91 MNT CM"1.
Разделение микросомальных белков проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970) в денатурирующих условиях. Концентрирующий гель содержал 4% ПААГ, 0,125 М трис-НС1 (рН 6,8), 0,1% SDS. Разделяющий градиентный 7,5-15% ПААГ гель содержал 0,375 М трис-HCl (рН 8,8) и 0,1% SDS. Пробы перед нанесением кипятили на водяной бане при 95С в течение 3-5 мин в буфере: 62,5 мМ Трис-HCl (рН 6,8), 0,1% SDS, 10% глицерин, 2% р-меркаптоэтанол, 0,001% бромфеноловый синий и наносили на гель. Электрофорез проводили в буфере: 25 мМ Трис- НС1 (рН 8,3), 195 мМ глицин, 0,1% SDS при 80-120 V в течение 4-5 часов.
После электрофоретического разделения белки переносились на 0,45 им нитроцеллюлозную мембрану методом полусухого переноса в буфере 25 мМ Трис-НСІ, 195 мМ глицин, 20% этанол на приборе Fastblot "Biometra" (Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Перенос осуществляли в течение 1,5 ч при силе тока 150 мА. Для оценки эффективности и равномерности переноса мембрану окрашивали 0,2 % раствором Ponceau S в 3% трихлоруксусной кислоте.
Нитроцеллюлозную мембрану отмывали от Ponceau S водой, затем ТБС-Т буфером (0,01 М Трис-НСІ (рН 7,5), 0,15 М NaCl, 0,05% твин-20) до исчезновения окраски. Для блокировки центров неспецифической сорбции, мембрану помещали в буфер ТБС-Т (ЮмМ Трис-НСІ, 150мМ NaCl, рН7,5), содержащий 10% бычий сывороточный альбумин. После отмывки буфером ТБС Т, мембраны инкубировали с первичными антителами (клон 14Н5) против Р450 1А1/2 крыс. После отмывки буфером ТБС-Т, а затем буфером АР 9,5 (50 мМ Трис рН 9,5, 100 мМ NaCl, 2мМ MgCl2), мембраны помещали в раствор вторичных антител кролика направленными против IgG мыши, коньюгированными со щелочной фосфатазой. После отмывки, белки визуализировали, окрашивая мембраны раствором 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфата (BCIP) и /»-нитротетразолиума голубого (NBT) в буфере АР 9,5. Работа проводилась совместно с Захаровой Л.Ю.
Индукция CYP1A1 и CYP1A2 в печени инбредных линий мышей, обработанных 3-метилхолантреном (MX) и о-аминоазотолуолом (О AT)
Методом мультиплексной ОТ-ПЦР были определены уровни мРНК цитохромов Р450 1А1 и 1А2 в печени 6-ти инбредных линий мышей, различающихся по генотипу Ah-рецептора, т.е. по чувствительности к индуцирующему действию полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), в норме и при индукции MX. Среди выбранных мышей три линии обладали AhR+ генотипом (СВА, C57BL, A/Sn) и три линии были нечувствительны к индукции ПАУ (DBA, AKR и SWR - AhR генотип) (Nebert, 1989; Nebert et al., 2004). Полученные данные представлены на рисунке 10.
В печени интактных мышей исследуемых линий мРНК CYP1A1 практически не регистрировался, в то время как конститутивный уровень экспрессии гена CYP1A2 был достаточно высок, что вполне согласуется с результатами Вестерн-иммуноблота, а также с ранее полученными результатами (Kimuraetal., 1986).
Обнаружено, что в печени всех исследуемых линий мышей регистрируется значительное увеличение количества мРНК цитохрома Р450 1А1 (рис. 10) при индукции 3-метилхолантреном. Этот факт оказался неожиданным, поскольку мыши линий SWR, AKR и DBA традиционно считаются ПАУ-неиндуцибельными (Nebert, 1989), т.е. обладают генотипом Ahd Ahd. Увеличение содержания уровня мРНК CYP1A1 достаточно трудно оценить вследствие её низкого содержания в контроле. Тем не менее, видна разница в уровне мРНК CYP1A1 среди исследуемых линий. Особенно это заметно для линий Ah+ генотипа. У линий, дефектных по Ah-рецептору, также наблюдалось увеличение содержания мРНК CYP1A1, хотя оно было не столь ярко выраженным: в 2 - 3 раза ниже по сравнению с Ah+ линиями.
При исследовании экспрессии гена CYP1A2 обнаружено, что, в отличие от CYP1A1, в печени необработанных индуктором мышей регистрируется заметное количество мРНК (рис. 10). Количество мРНК CYP1A2 различается среди исследуемых линий не значительно. Исключение составляют мыши линии SWR, у которых содержание мРНК CYP1A2 в контроле в 3-4 раза выше, по сравнению с мышами линий C57BL, A/Sn, СВА, AKR и DBA и сравнимо с индуцированным MX.
Введение животным 3-метилхолантрена сопровождалось усилением экспрессии CYP1A2 в печени мышей A/Sn, C57BL, СВА и AKR в 3-4 раза. Содержание мРНК CYP1A2 не изменялось у SWR мышей, но статистически значимо (р 0.05), увеличивалось у DBA мышей при индукции MX.
Аналогичные эксперименты были проведены с использованием ОАТ в качестве индуктора. Методом мультиплексной ОТ-ПЦР были определены уровни мРНК цитохромов Р450 1А1 и 1А2 в печени 5-ти инбредных линий мышей, различающихся по генотипу Ah-рецептора. Полученные данные представлены на рисунке 10.
Как видно, индукция ОАТ проходит схожим с MX образом. Можно лишь отметить, что уровень индукции в случае ОАТ выше, чем в случае с MX.
Таким образом, вне зависимости от генотипа индуцибелыюсти (генотипа Ah-рецептора) все исследуемые линии мышей реагировали на введение химических канцерогенов (MX или ОАТ) усилением экспрессии генов CYP1A1 и CYP1A2.
До настоящего времени тестируемые линии не были охарактеризованы по уровню экспрессии генов AhR и ARNT. Поэтому следующим шагом в нашей работе было определение уровня мРНК этих транскрипционных факторов в норме и при индукции. Поскольку предварительно не было обнаружено существенных отличий при индукции CYP1A ОАТ и MX, то дальнейшие эксперименты проводили только с использованием MX в качестве индуктора.
Методом мультиплексной ОТ-ПЦР были определены уровни мРНК транскрипционных факторов AhR и ARNT в печени 6-ти инбредных линий мышей, различающихся по генотипу Ah-рецептора, т.е. по чувствительности к индуцирующему действию полициклических ароматических углеводородов (ПАУ). Результаты представлены на рисунке 11.
На рисунке 11а приведены значения относительного содержания мРНК Ah-рецептора в печени мышей исследуемых линий. Видно, что вне зависимости от генотипа AhR, его экспрессия практически одинакова у всех мышей. И лишь для линии SWR можно отметить почти двукратное снижение его экспрессии по сравнению с другими линиями. Видно также, что экспрессия этого фактора практически не изменяется при введении мышам индуктора. При индукции MX содержание мРНК AhR статистически значимо (р 0.05) увеличивалось только у мышей линий AKR и DBA, тогда как у C57BL, A/Sn, CBA и SWR мышей - не изменялось. Аналогичные эксперименты были проведены для ARNT (рис. 116). И в этом случае нами не было выявлено существенных межлинейных различий и зависимости от введения индуктора. Конститутивное содержание мРНК ARNT различалось статистически значимо {р 0.05), но лишь незначительно среди исследуемых линий мышей: немного повышено у мышей линий СВА и SWR и слегка понижено у AKR и DBA по сравнению с C57BL и A/Sn. После индукции MX содержание мРНК ARNT не изменялось у мышей с Ah+ -генотипом и слегка уменьшалось у мышей с Ah -генотипом. Таким образом, проведенные эксперименты показали, что уровень экспрессии генов AhR и ARNT существенно не зависит от генотипа Ah рецептора и индукции 3-метилхолантреном.
