Введение к работе
Актуальность проблемы
Na/K-АТРаза является одним из ключевых ферментов эукариотических клеток. Она долгое время была известна как фермент, способный поддерживать градиент ионов Na и К+, однако в 90-е годы XX века было установлено, что Na/K-АТРаза способна функционировать как рецептор, специфическим лигандом которого являются соединения класса кардиотонических стероидов (КТС) (Kometiani et al., 1998). Связывание Na/K-АТРазы с этими соединениями может регулировать экспрессию генов раннего и позднего ответов через активацию транскрипционных факторов (Xie et al., 1999). В литературе обсуждается, что данные процессы протекают без ингибирования ферментативной активности Na/K-АТРазы. Несмотря на довольно длительный период, прошедший с момента этого открытия, данных об участии Na/K-АТРазы в процессах сигнализации в нейрональных клетках известно очень мало, причем основные исследования ведутся с использованием кардиомиоцитов, почечного эпителия и фибробластов.
Na/K-АТРаза в нейрональной ткани поглощает огромное количество АТР - до 50% от общего уровня аденозинтрифосфата клетки, что связано с необходимостью восстанавливать исходное соотношение ионов Na и К после возбуждения нейрона. В нейрональных клетках а-субъединица Na/K-АТРазы представлена двумя изоформами -КТС-чувствительной аЗ-субъединицей и КТС-резистентной а1-субъединицей. В литературе активно обсуждается вопрос о том, каким образом разные изоформы способны вовлекаться в различные внутриклеточные сигнальные пути, а также ставится вопрос о наличии в тканях животных соединений класса кардиотонических стероидов и об их возможном синтезе de novo.
Недавно было показано, что белок агрин, участвующий в формировании нервно-мышечного синапса, способен специфически связываться с КТС-чувствительной аЗ-субъединицей Na/K-АТРазы и вызывать эффекты, аналогичные действию КТС (Hilgenberg et al., 2006). Таким образом, был найден специфический «партнер» для КТС-чувствительной аЗ-субъединицы, которая представлена только в нейрональных клетках, что позволяет говорить о возможных путях регуляции именно КТС-чувствительной аЗ-субъединицы. Мутации в гене, который кодирует эту субъединицу, способны вызывать эпилепсию и паркинсонизм в моделях гетерозиготных мышей по данному гену (Clapcote et al., 2009).
В последнее время начали накапливаться данные о возможной взаимосвязи между Na/K-АТРазой и глутаматными рецепторами. Недавно показано, что связывание уабаина с Na/K-АТРазой может влиять на стабильность ионотропных рецепторов АМРА-класса в
нейронах (Zhang et al., 2009), а также блокировать активность глутаматных переносчиков GLT-1 и GLAST в клетках глии (Rose et al., 2009). Все это позволяет говорить о возможном участии Na/K-АТРазы в функционировании глутаматной системы. Кроме того, накапливаются данные о предпосылках взаимодействия Na/K-АТРазы и ионотропного рецептора NMDA-класса (NMDA - N-метил-Б-аспартат).
NMDA-рецепторы представляют собой ионотропные глутаматные рецепторы, которые участвуют в формировании синаптической пластичности и молекулярной памяти. Важным отличием NMDA-рецепторов от других ионотропных глутаматных рецепторов является то, что их канал проницаем не только для натрия и калия, но и для Са , который является вторичным мессенджером и способен модулировать ответ клетки в зависимости от внешнего сигнала.
В литературе показано, что действие соединений класса кардиотонических стероидов приводит к проявлению экзайтотоксических эффектов глутамата (Stelmashook et al., 1999). Так как этот эффект снимается антагонистами NMDA-рецепторов, было выдвинуто предположение, что КТС способны влиять на функционирование NMDA-рецепторов. Было также показано, что активация NMDA-рецепторов может приводить к частичному ингибированию активности Na/K-АТРазы (Булыгина и соавт., 2003). Однако на сегодняшний день не установлено, способны ли они взаимодействовать между собой. Цель и задачи работы
Целью данной работы явилось выявление особенностей структурного и функционального взаимодействия Na/K-АТРазы и NMDA-рецептора в гранулярных клетках мозжечка крыс.
В соответствии с этой целью были поставлены и решены следующие задачи:
1. Исследовать возможное структурное взаимодействие и ко-локализацию Na/K-
АТРазы и NMDA-рецептора в первичной культуре гранулярных клеток мозжечка.
2. Исследовать активацию Akt и ЕЯЮ/г киназ при действии различных концентраций
уабаина и оценить возможное участие NMDA-рецептора в этих сигнальных каскадах.
3. Выявить механизмы «экзайтотоксического» действия глутамата на фоне действия
уабаина.
4. Исследовать процессы долговременной регуляции NMDA-рецепторов под
действием уабаина на клетки.
5. Оценить возможное влияние NMDA-рецептора на активность Na/K-АТРазы в
первичной культуре гранулярных клеток мозжечка крыс и исследовать общие
механизмы этого процесса.
Научная новизна и практическая значимость работы
В этом исследовании впервые показано, что Na/K-АТРаза и NMDA-рецептор могут формировать функциональный комплекс, в котором способны принимать участие как КТС-чувствительная аЗ-субъединица, так и КТС-резистентная а 1-субъединица Na/K-АТРазы.
Показано, что кратковременное взаимодействие уабаина с аЗ-субъединицей Na/K-АТРазы приводит к активации ERK Уг, а взаимодействие уабаина с а 1-субъединицей Na/K-АТРазы - к активации Akt. NMDA-рецепторы не участвуют в данных сигнальных каскадах. Связывание уабаина с а 1-субъединицей Na/K-АТРазы приводит к усилению функции NMDA-рецепторов за счет фосфорилирования тирозиновых остатков NR2B-субъединицы. Долговременное действие уабаина на аЗ-субъединицу Na/K-АТРазы приводит к уменьшению количества NMDA-рецепторов в первичной культуре гранулярных клеток мозжечка. Был установлен механизм ингибирования Na/K-АТРазы при активации NMDA-рецепторов.
Полученные данные свидетельствуют о том, что NMDA-рецептор в гранулярных клетках мозжечка является объектом сложной регуляции, и на его активность могут влиять как al-, так и аЗ-субъединицы Na/K-АТРазы. Полученные данные могут инициировать исследование причин, по которым недостаточность аЗ-субъединицы Na/K-АТРазы приводит к дефициту деятельности мозга. Апробация работы и публикации
Результаты диссертационной работы были представлены на II Международном семинаре по исследованию экспрессии, структуры и функции мембранных белков (Флоренция, Италия, 2009), XIII Международной конференции по АТРазам Р-типа, (Пасифик Гров, США, 2011). Диссертация апробирована на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (2011). По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, среди которых 3 статьи в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК РФ. Структура и объем диссертации
Работа изложена на 87 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 38 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 136 отечественных и зарубежных источников.
