Введение к работе
Актуальность темы. Ингибиторы протеолитических ферментов представляют собой большую группу белков, способных образовывать комплексы с протеиназами, в составе которых ферменты утрачивают свою активность. Белковые ингибиторы протеиназ, обнаруженные у представителей всех доменов живых организмов, на основании особенностей строения их молекул разделяют на структурные семейства, число которых различается в зависимости от принятой системы классификации [Laskovsky&Kato, 1980; Rawlings et al., 2004]. Ингибиторы, принадлежащие к семейству соевого ингибитора трипсина Кунитца (SKTI, soybean Kunitz trypsin inhibitor), широко распространены среди растений различных систематических групп, как однодольных, так и двудольных. Белки этого семейства могут подавлять активность сериновых, цистеиновых или аспартатных протеиназ, помимо этого некоторые из них проявляют активность по отношению к непротеолитическим ферментам, таким, как растительные инвертазы и а-амилазы [Rodenburg et al., 1995; Heibges et al., 2003]. Белки семейства SKTI в большом количестве присутствуют в семенах и запасающих органах растений, а также в механически поврежденных или пораженных фитопатогенами органах растений.
Физиологические функции белков семейства SKTI в организме растений окончательно не установлены, тем не менее, очевидно, что они участвуют в защите растений от патогенных микроорганизмов и насекомых-вредителей. Показано, что белки SKTI могут действовать как на экстрацеллюлярные протеиназы, секретируемые фитопатогенами, так и протеиназы желудочно-кишечного тракта насекомых, которые повреждают растительную ткань [Мосолов, Валуева, 2005]. В связи с новейшими достижениями биотехнологии по созданию растений, обладающих повышенной устойчивостью к вредителям и болезням, изучение белков данного семейства имеет не только теоретическое, но также важное практическое значение.
К настоящему времени накоплено значительное количество сведений о структуре и свойствах белков-ингибиторов семейства SKTI из картофеля {Solarium tuberosum L), являющегося одной из важнейших сельскохозяйственных культур. Эти белки выделяют в отдельное подсемейство и обозначают PKPI (potato Kunitz proteinase inhibitors). Установлено, что в картофеле белки PKPI представлены многочисленными изоформами, среди которых на основании сходства N- и С-концевых аминокислотных последовательностей выделяют, по крайней мере, пять различных структурных групп, три из которых — PKPI-A, PKPI-B и PKPI-C — относительно хорошо изучены [Ishikawa
et al., 1994; Heibges et al., 2003; Bauw et al., 2006]. Однако структурные особенности белков PKPI, определяющие специфичность взаимодействия с различными протеиназами, остаются малоисследованными. Несмотря на то, что изучены биохимические свойства целого ряда белков РКРІ, выделенных из клубней картофеля, их полная первичная структура, как правило, неизвестна. С другой стороны, значительное количество полных аминокислотных последовательностей белков РКРІ восстановлено по кодирующим их нуклеотидным последовательностям, но практически отсутствуют данные о биохимических свойствах этих белков. Таким образом, исследование взаимосвязи структуры и свойств новых белков РКРІ, является актуальной задачей современной биохимии.
В настоящее время известно около сотни нуклеотидных последовательностей (в основном кДНК), кодирующих белки РКРІ из различных сортов картофеля таких, как Provita, Saturna, Bintje, Pentland squire, Superior, Desire; Danshaku, Ulsten Sceptre [Heibges et al., 2003, Gruden et al., 1997; Strukej et al., 1992; Hannapel, 1993; Herbers at al., 1994; Ishikawa et al., 1994; Stiekema et al., 1988]. Показано, что гены ингибиторов РКРІ в геноме картофеля, представленные множественными копиями, отличаются высоким уровнем полиморфизма, при этом нуклеотидные последовательностями, относящиеся к трем наиболее изученным группам, различаются на 88-99% (РКРІ-А), 85-99% (РКРІ-В) и 54-99% (РКРІ-С). В то же время и последовательности кДНК (или генов) РКРІ, обнаруженные в различных сортах картофеля, отличаются друг от друга. Это позволило высказать предположение, что каждый сорт картофеля содержит свой уникальный набор генов РКРІ, а различия между ними обусловлены высокой скоростью их эволюции [Heibges et al., 2003]. Информация о структуре ранее не изученных генов РКРІ картофеля, а также растений близких видов, представляет значительный интерес, поскольку позволяет судить о процессах их формирования и образования новых форм in vivo.
Цели и задачи работы. Целью работы являлось выделение генов РКРІ из генома картофеля сорта Истринский и не клубненосного дикого вида Solanum brevidensVhiW. (синоним S. palustre Роерр. ex Schltdl.), их сравнительный структурно-функциональный анализ, а также исследование взаимосвязи между структурой и специфичностью продуктов клонированных генов. Были сформулированы следующие экспериментальные задачи:
1. Разработать метод полногеномного ПНР-анализа генов PKPI-A, PKPI-B и PKPI-C растений рода Solanum, включая установление их числа и структуры. Синтезировать
универсальные олигонуклеотидные праймеры, специфичные к высоко консервативным фланговым последовательностям генов, кодирующих белки PKPI, и на их основе создать схему клонирования и реконструкции нуклеотидных последовательностей из набора геномных генов PKPI картофеля сорта Истринский и неклубненосного S. brevidens.
Провести сравнительный анализ последовательностей реконструированных генов картофеля сорта Истринский и S. brevidens, а также известных по данным литературы последовательностей PKPI других сортов картофеля и видов растений рода Solatium. На основании полученных данных оценить скорость эволюции генов PKPI, а также перспективность поиска новых форм ингибиторов этого подсемейства в других видах растений рода Solatium.
Идентифицировать вариабельные и консервативные области в последовательностях генов PKPI, а также «горячие точки» рекомбинации. Усовершенствовать классификацию последовательностей в пределах групп.
Разработать метод ускоренной гетерологичной экспрессии клонированных генов PKPI в Escherichia coli. Получить ряд рекомбинантных белков, кодируемых новыми, ранее не изученными генами PKPI, и охарактеризовать специфичность их действия на протеиназы: трипсин, химотрипсин, субтилизин Карлсберг, протеиназу К, эластазу из лейкоцитов человека (HLE) и папаин.
Научная новизна и практическая значимость работы: Впервые предложен и успешно апробирован метод полногеномного ПЦР-анализа последовательностей генов семейств PKPI-A, PKPI-B и PKPI-C. Показана возможность его применения для растительных изолятов рода Solatium, включая представителей различных секций, в частности Petota.
Установлены последовательности ряда новых генов PKPI трех структурных групп PKPI-A, PKPI-B и PKPI-C, кодирующих ингибиторы протеиназ типа Кунитца в геноме картофеля сорта Истринский.
Впервые установлены последовательности генов, кодирующих в геноме неклубненосного S. brevidens (Phill.) белки-ингибиторы протеиназ типа Кунитца, гомологичные белкам PKPI-A и PKPI-B из культурного картофеля. Эти гены обозначены Spls-KPI Путем сравнительного анализа выделенных нуклеотидных последовательностей генов, а также известных по данным литературы, показано, что различия между последовательностями генов PKPI S. brevidens и S. tuberosum незначительны, а последовательности некоторых генов Spls-KPI и PKPI практически идентичны и
кодируют полностью идентичные по структуре белки. Установлено, что нуклеотидные последовательности генов PKPI состоят из мозаично расположенных блоков, характер локализации которых позволяет предположить, что в растениях семейства пасленовых (Solanaceae) гены PKPI подвергаются рекомбинации, которая и обусловливает природную вариабельность структуры генов, кодирующих белки PKPI в картофеле.
В нуклеотидных последовательностях генов PKPI выявлены консервативные и вариабельные области. На основании анализа доступных в литературе и определенных в настоящей работе последовательностей генов предложена модель блочной организации генов PKPI, согласно которой новые гены возникают в результате рекомбинации и обмена блоками, что сочетается со случайным мутагенезом в районе вариабельных зон. Предложенная модель позволяет объяснить факт природной вариабельности структуры генов PKPI в картофеле и других растениях семейства Solanaceae.
Разработаны методы экспрессии генов PKPI в Е. coli и очистки рекомбинантных продуктов. Выделены, очищены и охарактеризованы рекомбинантные белки PKPI-B10 и PKPI-C2, кодируемые в геноме картофеля сорта Истринский генами PKPI-B10 и PKPI-С2, а также белки Spls-KPI-Bl, Spls-KPI-B2, Spls-KPI-B3, Spls-KPI-B4 и Spls-KPI-B5, кодируемые соответствующими генами в геноме S. brevidens. Показано, что рекомбинантные белки не действовали на протеиназу К, HLE и папаин, но были способны с разной степенью эффективности подавлять активность трипсина, химотрипсина и субтилизина Карлсберг. Показано, что рекомбинантный белок PKPI-B10 способен подавлять рост и развитие фитопатогенного гриба Fusarium culmorum. Сделано заключение о возможности использования выделенных генов, кодирующих исследованные белки, для создания трансгенных растений, устойчивых к действию фитопатогенным микроорганизмов.
Апробация работы и публикации: Основные результаты работы были представлены на III, IV и V Международных конференциях «Регуляция роста, развития и продуктивности растений» (Белоруссия, Минск, 2003, 2005, 2007); Международной конференции "Молекулярная генетика, геномика и биотехнология" (Белоруссия, Минск, 2004); Конгрессе общества SISV-SIGA (Италия, Лечче, 2004); XVI и XVII Зимних молодежных научных школах "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2004, 2005); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы защиты картофеля, плодовых и овощных культур от болезней, вредителей и сорняков» (Белоруссия, Минск, 2005), 1-ом и 2-ом Международном симпозиуме по геному пасленовых (Нидерланды, Вагенинген, 2004;
Италия, Искья, 2005); VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007). По материалам диссертации опубликовано 18 работ, из которых— 6 статей и 12 тезисов докладов.
Структура и объем работы: Диссертация изложена на 190 страницах; содержит 39 рисунков и 7 таблиц; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 284 наименования.
Похожие диссертации на Ингибиторы протеиназ типа Кунитца из картофеля: молекулярное клонирование и экспрессия генов
