Введение к работе
Актуальность проблемы. Биогеохимический цикл азота связан с взаимопревращением
соединений азота в широком интервале степеней окисления (от +5 до -3) и характеризуется
разнообразием окислительно-восстановительных реакций, катализируемых
металлосодержащими оксидоредуктазами. Системное исследование совокупности термодинамических, кинетических и структурных свойств этих ферментов, а также их комплексов с искусственными и физиологическими субстратами, ингибиторами, донорами и акцепторами электронов - это путь к пониманию механизмов действия и регуляции как отдельных ферментов, так и в целом процессов массо- и энергопереноса в клетках бактерий, участвующих в азотном обмене.
Нитрит является одним из ключевых компонентов этого цикла. Основная роль в процессах его потребления принадлежит: нитритредуктазам различного строения и локализации. Восстановление нитрита может осуществляться в ходе ассимиляторных, респираторных или диссимиляторных процессов, протекающих в клетках бактерий. Ассимиляторное восстановление нитрита приводит к образованию иона аммония, который включается клеткой в синтез биомассы. Этот процесс катализируется цитоплазматической сирогем-содержащей нитритредуктазой, которая использует НАД(Ф)Н или ферредоксин в качестве доноров электронов. Респираторное восстановление нитрита может катализироваться тремя классами ферментов. Цитохром сй?і-содержащая и медь-содержащая нитритредуктазы катализируют одноэлектронное восстановление нитрита до окиси азота N0, которая затем восстанавливается до N2 путем последовательного действия нескольких редуктаз. Пятигемовые цитохром с нитритредуктазы (ccNiR) катализируют шестиэлектронное восстановление нитрита непосредственно до аммиака без выделения промежуточных продуктов в окружающую среду.
Мономеры ccNiR имеют молекулярную массу около 50 кДа, являются однодоменными белками и содержат пять гемов с, один из которых, координированный в проксимальном положении аминогруппой Lys, является каталитическим, остальные - принимают участие в переносе электронов. Структурные исследования показали, что функциональной единицей ccNiR является димер, его образование приводит к образованию единой электрон-транспортной цепи, состоящей из 10 гемов с и позволяет осуществлять передачу электронов с одного мономера на другой, повышая таким образом эффективность работы фермента Предполагается, что помимо участия в дыхательных процессах в клетках бактерий ccNiR выполняет функции детоксикации клетки от избытка нитрита и N0.
В Институте биохимии им. А.Н.Баха из растворимой фракции клеточного экстракта галоалкалофильной серуокисляющей бактерии Thioalkalivibrio nitratireducens была выделена новая цитохром с нитритредуктаза (TvNiR) [Tikhonova T.V. et al, 2006]. Определение пространственной структуры TvNiR показало, что фермент существенно отличается от ранее описанных в литературе ccNiR: мономер TvNiR представляет собой двухдоменный белок, содержащий восемь гемов с, пять из которых, включая каталитический, гомологичны пяти гемам известных ccNiR, а дополнительные три гема расположены на отдельном домене. В кристалле TvNiR существует как высокосимметричный гексамер с молекулярной массой 380 кДа. Образование гексамера, содержащего 48 гемов с, не приводит к образованию коллективной электрон-транспортной цепи, связывающей несколько активных центров. В связи с этим возникает вопрос о роли столь сложной структуры в катализе, а также об олигомерном состоянии белка в растворе и в клетке. Для понимания связи между структурой и функцией фермента, а также понимания физиологического состояния и роли фермента в клетке
предполагается провести комплексное исследование кинетических, термодинамических и
структурных свойств различных олигомеров TvNiR .
Цель работы. Целью настоящей работы являлась характеристика физико-химических и
каталитических свойств цитохром с нитритредуктазы из бактерии Thioalkalivibrio
nitratireducens
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Разработка и оптимизация процедуры выделения и очистки TvNiR хроматографическими методами, оптимизация методов определения активности фермента в растворе с различными субстратами.
Характеристика физико-химических свойств, олигомерного состава и субстратной специфичности TvNiR.
3) Исследование модельных систем транспорта электрона в активный центр нитритредуктазы
(фото- и электрохимические системы восстановления активного центра фермента).
Научная новизна. Настоящая работа посвящена изучению новой гексамерной 48-гемовой цитохром с нитритредуктазы из галоалкалофильной у-протеобактерии 7V. nitratireducens, представляющей собой уникальную высокоорганизованную систему, обеспечивающую эффективный направленный транспорт электронов и протонов. Предложена двухстадийная схема выделения TvNiR, позволившая значительно повысить выход белка по сравнению с ранее применявшимся методом препаративного электрофореза. Охарактеризован олигомерный состав TvNiR в растворе с применением хроматографических методов и метода малоуглового рентгеновского рассеяния. Показано, что в растворе фермент существует в виде высокостабильного гексамера с молекулярной массой около 380 кДа. Охарактеризованы физико-химические и каталитические свойства TvNiR. Показано, что фермент катализирует реакции восстановления нитрита, гидроксиламина, сульфита и пероксида водорода. Исследовано функционирование электрон - транспортной цепи TvNiR в условиях ее обеспечения электронами, поступающими от фотокаталитической системы, использующей доноры электронов флавиновой или птериновой природы или непосредственно от электрода, на который был иммобилизован фермент. Показано, что флавины и/или флавосодержащие белки могут рассматриваться как потенциальные физиологические доноры электронов для TvNiR. Практическая значимость работы. Результаты настоящей работы расширяют имеющиеся сведения о свойствах мультигемовых цитохромов, играющих ключевую роль в метаболических процессах, связанных с переносом электронов. Установление структурно-функциональных связей и закономерностей функционирования электрон-транспортной цепи гемов в гексамере может быть использовано для развивающейся сейчас биоэлектроники: создания электронопроводящих материалов на основе биомолекул.
Высокая стабильность иммобилизованных на электроде препаратов TvNiR в сочетании с широким рабочим интервалом рН, ионной силы, температуры, а также высокой активностью определяет перспективность использования фермента в качестве биосенсора при определении нитрита.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: международная конференция «Structural Biology at Crossroads: From Biological Molecules to Biological Systems» (Germany, Gamburg, 2004), международная конференция «Biocatalysis-2005» (Москва, 2005), и "Biocatalysis - 2007" (Москва, 2007),
международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007), 32-й международный конгресс FEBS «Molecular machines» (Austria, Vienna, 2007).
Публикации. По материалам настоящей диссертации опубликованы 3 статьи.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и Списка цитируемой литературы, включающего 179 ссылок. Работа изложена на 116 страницах, содержит 53 рисунка и 10 таблиц.
