Введение к работе
Биологический цикл азота является одним из важнейших биохимических циклов в природе. Он объединяет большое количество различных организмов, осуществляющих в процессе своего функционирования окисление/восстановление различных соединений азота. Одним из ключевых ферментов этого цикла является цитохром с нитритредуктаза (NrfA), катализирующая реакцию респираторной аммонификации нитрита, а именно восстановление нитрита до аммония без высвобождения каких-либо промежуточных продуктов реакции, Цитохром с нитритредуктазы обнаружены у аммонифицирующих бактерий, принадлежащих к различным подкласам протеобактерии. Эти ферменты досточно хорошо изучены: в литературе имеется большое количество данных по их каталитическим и спектральным свойствам, ЭПР и мессбауэровской спектроскопии, а для ряда ферментов описана пространственная структура и предложен молекулярный механизм действия. В зависимости от типа протеобактерии NrfAs выделяют как из мембранной, так и из растворимой фракций в виде мономера или комплекса с белком-донором электронов. Помимо нитритредуктазнои активности эти ферменты обладают также способностью к восстановлению гидроксиламина - предполагаемого промежуточного продукта процесса восстановления нитрита. Для NrfA из є- и 5-протеобактерий показана также сульфит редуктазная активность. В растворе эти ферменты существуют в виде сходным образом сформированных гомодимеров. Мономеры, NrfAs выделенные из разных протеобактерии имеют молекулярный вес порядка 53-61 кДа, а пространственная укладка составляющих их полилептидных цепей в целом гомологичная. Мономеры NrfAs содержат по 5 гемов типа с в качестве простетических групп. Расстояния между этими гемами предполагают возможность прямого электронного переноса] Характерной особенностью мономеров известных NrfAs является консервативность взаимного расположения и ориентации в пространстве всех 5-й гемов. Важной особенностью известных NrfAs является также наличие в их структурах ионов кальция, занимающих консервативное положение.
Не так давно, из растворимой фракции нитрат восстанавливающей облигатной хемолитоавтотрофной и галоалкалофильной сероо кисляю щей у-протеобактерии Thioalkalovibrio nitratireducens (штамм ALEN 2), обнаруженной в содовом озере Fazda в Египте, был выделен фермент, обладающий нитритредуктазнои активностью. Кинетические исследования этого фермента, названного TvNiR, показали, что помимо нитритредуктазнои активности он способен восстанавливать гидроксиламин и сульфит, используя дитионит в качестве донора электронов. Было показано, что единственным продуктом нитрит и гидроксиламин редуктазной активностей является аммоний. При этом TvNiR обладал более высокой нитритредуктазнои активностью по сравнению с известными NrfAs. Молекулярная масса мономерной формы TvNiR составляла величину около 60 кДа. Эксперименты по гель-фильтрации продемонстрировали, что TvNtR в растворе преимущественно существует в форме гомогексамера, с небольшой долей тримерной и мономерной форм, при этом активностью обладали только гексамерная и тримерная формы. Анализ на металлы показал, что этот фермент содержит атомы железа и кальция, а спектрофотометрические исследования показали, что TvNiR имеет характерный спектр цитохром с белков. Помимо этого фермент характеризовался высокой термостабильностью.
Таким образом, было показано, что новая цитохром с нитритредуктаза из у протеобактерии Thioalkalivibrio nitratireducens, несмотря на имеющиеся сходства с известными NrfAs из различных протеобактерий, имеет ряд уникальных признаков, свойственных только этому ферменту и резко выделяющих его на фоне других известных цитохром с нитритредуктаз. Поэтому цель данной работы заключалась в детальном исследовании методом рентгеноструктурного анализа пространственной структуры TvNiR для того, чтобы понять в чем причина указанных выше отличий в свойствах этого фермента от известных NrfAs, а также чтобы выяснить накладывают ли экстремальные условия существования родительского организма отпечаток на структуру функционирующего в нем фермента.
