Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1. БИОХИМИЯ ОКИСЛЕНИЯ МЕТАНА 9
1.1. Энергетический обмен метанокисляющих микроорганизмов 10
1.1.1. Окисление метана II
1.1.2. Окисление метанола 19
1.1.3. Окисление формальдегида 21
1.1.4. Окисление формиата 24
1.2. Электронног-транспортные системы 26
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 34
2.1. Объект исследования 34
2.2. Получение бесклеточных препаратов 34
2.3. Электронная микроскопия 36
2.4. Определение активности ММО 37
2.5. Очистка цитохрома CQQ . . 38
2.6. Аналитические методы 40
2.7. Спектральные методы 41
2.8. Определение аминокислотного состава .... 42
3. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ МЕТАНООКСИГЕНАЗЫ 43
3.1. Введение 43
3.2. Разработка методов определения активности метанмонооксигеназы по убыли субстрата с помощью газожидкостной хроматографии ... 45
3.3. Радиоизотопный метод определения активности метанмонооксигеназы 51
3.4. Краткое заключение 56
4. ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ МЕТАШОНООКСИГЕНАЗЫ В БЕСКЛЕТОЧНЫХ ПРЕПАРАТАХ 57
4.1. Введение 57
4.2. Внутриклеточная локализация 58
4.3. Стабильность метанмонооксигеназы в
бее клеточных препаратах и условия их
хранения 61
4.4. Условия, необходимые для протекания метанмонооксигеназной реакции 63
4.5. рН-зависимость метанмонооксигеназы .... 65
4.6. Влияние ингибиторов 67
4.7. Субстратная специфичность метанмонооксигеназы 69
4.8. Краткое заключение 75
5. ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ЦИТОХРОМА Ссо В МЕТАНМОНО
ОКСИГЕНАЗНОЙ РЕАКЦИИ MC.CAPSUC.ATUS ШТАММ М. . 76
5.1. Введение 76
5.2. Солюбилизация метанмонооксигеназы .... 77
5.3. Выделение и очистка цитохрома CQQ .... 78
5.4. Молекулярная характеристика цитохрома CQQ. 81
5.5. Спектральные характеристики цитохрома CQQ. 81
5.6. Аминокислотный состав цитохрома CQQ ... 83
5.7. Взаимодействие цитохрома CQQ С СО, СН^ . .
и СН3С1 89
5.8. Изучение роли цитохрома CQQ В метанмонооксигеназной реакции 93
5.9. Краткое заключение 96
6. ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМ МЕТАНМОНООКСИГЕНАЗНОЙ
РЕАКЦИИ КИНЕТИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ 99
6.1. Введение 99
6.2. Дейтероизотопныи эффект метанмоно-оксигеназной реакции 99
6.3. Температурная зависимость метанмоно-оксигеназной реакции 104
6.4. Краткое заключение 108
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 114
ВЫВОДА 121
ЛИТЕРАТУРА 123
- Энергетический обмен метанокисляющих микроорганизмов
- Получение бесклеточных препаратов
- Разработка методов определения активности метанмонооксигеназы по убыли субстрата с помощью газожидкостной хроматографии
- Внутриклеточная локализация
- Солюбилизация метанмонооксигеназы
Введение к работе
Микроорганизмы, окисляющие Cj-соединения (метан, метанол, формальдегид, формиат, окись углерода, амины и т.д.), обладают уникальной способностью строить все компоненты клеток из С--еди-ниц, получая необходимую для биосинтеза энергию за счет их окисления. Они широко распространены в природе. Особое место в этой группе микроорганизмов занимают микроорганизмы, способные окислять метан (45, 46).
Перспективность метана, как сырья для промышленного микробиологического синтеза и возможность использования метанокис-ляющих микроорганизмов в качестве кормового белка и источника биологически активных соединений, для снижения метаноносности угольных пластов способствует превращению этой группы микроорганизмов из объекта теоретических исследований в объек практического применения.
Метанокислякщие микроорганизмы проводят последовательное окисление метана до метанола, формальдегида и формиата. Аналогичных каталитических систем, катализирущих мягкое последовательное включение кислорода в молекулу метана, в современной химии нет. Поэтому ферментная система метанокисляющих бактерий представляет значительный интерес с точки зрения ее моделирования и создания эффективных катализаторов для промышленного получения продуктов окисления метана.
Для успешного решения перечисленных практических задач необходимо знание механизма окисления метана и, в частности, механизма первой стадии этой реакции - окисления метана до метанола. Эта стадия наименее изучена и наиболее важна для метанокисляющих бактерий, поскольку фермент, ответственный за окисление метана до метанола является ключевым для всей дальнейшей цепи окисления метана (46).
Изучение метанокисляющих микроорганизмов проводится весьма интенсивно по широкому кругу вопросов. Однако работы по изучению механизма реакции окисления метана до метанола пока занимают весьма скромное место. Молекулярный механизм окисления метана практически не изучен. Сделаны лишь первые попытки разобраться в этом процессе. После работы Higgins and Quyle (66), установивших, что фермент, окисляющий метан представляет собой оксидазу со смешанной функцией, появились лишь сообщения о характере ин-гибирования реакции окисления метана (4, 6, 39, 40, 55, 57, 65, 68, 69, 91, 104, 106, 120). На основании этих исследований был сделан предварительный вывод о наличии иона метелла в активном центре метанокисляющего фермента. Заслуживает внимания попытка некоторых авторов установить лимитирующую стадию реакции окисления метана (2). Однако этим практически и исчерпываются данные по изучению механизма ферментативного окисления метана.
Подобное положение может быть объяснено сложностями получения и хранения бесклеточных препаратов метанокисляющих бактерий. Это, в свою очередь, определяет сложности выделения и очистки метанокисляющей ферментной системы. Так, к настоящему времени лишь двум группам исследователей удалось получить частично очищенные препараты метанмонооксигеназной системы (18, 39, 40, 42, 65, 120, 121, 122). Обе эти системы различаются как по клеточной локализации, так и по субстратной специфичности.
Все это свидетельствует о необходимости проведения исследования метанмонооксигеназной ферментной системы и изучения молекулярного механизма окисления метана.
Целью настоящей работы являлось изучение молекулярного механизма ферментативного окисления метана до метанола бесклеточными препаратами метанокисляющих бактерий Methyl осо ecus capsu- latus штамм M и выяснению роли в этом процессе цитохрома с, связывающего СО.
В связи с этим в настоящей работе были поставлены следующие задачи:
Разработка методов определения активности метанмоноокси-геназы (MvIO), позволяющих определить ее кинетические параметры;
Получение и частичная очистка компонентов метанмоноокси-геназной системы;
Разработка методов длительного хранения активных бесклеточных препаратов метанокисляющих бактерий;
Изучение физико-химических свойств бесклеточных препаратов;
Исследование структуры активного центра ММО методами стационарной кинетики.
При выделении и характеристике фермента использовали ряд биохимических подходов и электронную микроскопию. Для изучения активного центра применяли различные подходы стационарной кинетики и ряд физико-химических методов, включающих электронную спектроскопию, спектрофлуориметрию, ядерный магнитный резонанс и так далее.
Совокупность результатов, полученных в ходе выполнения настоящей работы, дает возможность более целенаправленно проводить исследования по очистке метанмонооксигеназы. Данные кинетического анализа позволили предложить модель строения активного центра, которая может служить рабочей гипотезой для дальнейшего исследования ферлента.
Ниже сформулированы новые данные, которые получены в настоящей работе и вынесены на защиту:
I. Разработаны методы выделения и длительного хранения субклеточных мембранных структур Мс.capsuLatus, штамм М, окисляющих метан с высокими скоростями;
Установлено, что метанмонооксигеназа м.capsulatus, штамма М, входит в состав мембранных структур везикулярного типа и являются ферментом широкого спектра действия и рН оптимумом 6,5-7,0;
Установлено, что цитохром Cqq не принимает участия в ме-танмонооксигеназной реакции у м.capsulatus штамм М;
Установлено, что лимитирующей стадией ферментативного окисления метана является стадия разрыва С-Н-связи;
5.Исследование зависимости Км для метана от температуры, конкуренция процесса окисления окиси углерода с процессом окисления метана, а также ингибирующего влияния хелатируюших агентов на активность метанмонооксигеназы, позволили предположить, что субстраты связываются с участием иона металла субстрат-связывающего центра фермента;
6. Проведенные исследования позволили сформулировать представления о механизме ферментативного окисления метана, которые сводятся к следующему: молекулярный кислород и метан активируются в координационной сфере иона металла, после чего активная форма кислорода внедряется по активированной С-Н-связи.
Энергетический обмен метанокисляющих микроорганизмов
В настоящее время общепринято, что метан окисляется бактериями до углекислого газа и воды через метанол, формальдегид и формиат: сн4 -сн3он -НСОН — НСООН -со2
В пользу такой последовательности, предложенной более 20 лет назад (76, 77), свидетельствуют следующие факты:
1. Метаниспользующие бактерии способны окислять метан и метанол, а также формальдегид и формиат (33, 34, 36, 58, 76, 77, ИЗ, 130).
2. Некоторые постулированные промежуточные продукты были обнаружены при окислении метана и метанола (36, 66, 76).
3. Некоторые постулированные продукты накапливались в присутствии ингибиторов (71, 72).
4. Активность ферментов, катализирующих окисление метанола, формальдегида и формиата, была показана в экстрактах Pseu-doraonas methanica, растущего на метаноле (33, 34, 103).
Несмотря на простоту и очевидность вышеприведенной схемы расшифровка каждого ее этапа потребовала больших усилий. Рассмотрим последовательно стадии окисления метана до С02.
Получение бесклеточных препаратов
В качестве объекта исследования использовали метанокисляю-щий микроорганизм Methyiococcus capsuLatus штамм М. Клетки этого микроорганизма сферические, неподвижные, грамотрицательные, диаметр 1,0 мкм. Наряду с диплококками в культуре Мс. capsuLatus имеются отдельные кокки (рис. 5). Клетки окружены макрокапсулой, имеют развитую систему внутрицитоплазматических мембран, заполняющих большую часть содержимого клетки. Мембраны располагаются в виде плотноупакованных стопок вдоль продольной оси клеток.
Имеются внутриклеточные липидные включения. На агаризованной среде образуют белые гладкие, округлые, разграниченные колонии. МсcapsuLatus облигатныи метилотроф. Метан ассимилирует гексуло-зофосфатным путем.
Мс.capsuLatus штамм М, любезно предоставленный Институтом ВНИИсинтезбелок, выращивали в условиях непрерывного культивирования, в режиме хемостата. Объем ферментера 100 л, скорость протока 0,1-0,15 ч , температура +(42)-(45)С, рН 5,2-5,5, концентрация биомассы 10-12 г абсолютно сухого веса в литре. Активность клеток составляла 200-300 нмоль 02/мин мг абсолютно сухого веса.
Разработка методов определения активности метанмонооксигеназы по убыли субстрата с помощью газожидкостной хроматографии
Определение активности метанмонооксигеназы по убыли метана в реакционной среде связано с использованием растворимого метана. При этом в реакционном сосуде не должно быть газовой фазы. В противном случае метан легко диффундирует. Это обстоятельство осложняет использование растворенного метана для оценки активности фермента из-за необходимости введения в реакционный сосуд различных компонентов реакционной среды и отбора проб. Ними разработаны два типа реакционных сосудов, которые позволяют обойти эти трудности.
А. Конструкция первого варианта реакционного сосуда представлена на рис. 6. Ячейка состоит из термостатированного корпуса и вкладыша, соединяемого с корпусом ячейки при помощи шлифа. Снизу вкладыш герметично закрыт резиновой мембраной. Наличие эластичной мембраны позволяет осуществить отбор жидких проб и осуществлялось с помощью шприца через резиновую пробку.
Такая конструкция реакционной ячейки позволяет отбирать от 0,1 до 0,5 мл реакционной жидкости без образования газовой фазы, так как при отборе пробы размер эластичной мембраны увеличивается на объем отбираемой пробы.
Внутриклеточная локализация
В процессе фракционирования бесклеточного препарата в центробежном поле ММО найдена во фракции субклеточных частиц, осаждающихся при сравнительно небольших ускорениях (табл. I). Такая же картина наблюдалась при аналогичном ультрацентрифугировании в течение 30 мин. В этих условиях во фракции частиц обнаруживалось до 60-80% активности ММО по сравнению с исходным препаратом. Надосадочная фракция содержала лишь 3-6% исходной активности. Активность фермента надосадочной фракции также связана с высокомолекулярными структурами, которые полностью осаждались при центрифугировании в течение 1-1,5 часов при 150 тыс.ё Невидимому, они являются более мелкими обрывками мембранных структур клетки. В этих условиях во фракции частиц всегда обнаруживалось лишь 70-80% активности фермента. Потеря 20-30% активности ММО частично компенсировалась при объединении фракций частиц с надосадочной фракцией. Частичную потерю ферментативной активности можно объяснить тем, что для проявления активности ММО необходимы, по крайней мере, два компонента, один из которых в процессе разрушения клетки и суспендирования фракции частиц частично экстрагируется из частиц и переходит в растворимую фракцию, что приводит к снижению его зффективно,іїконцентрации. в частицах о Экстракция этого компонента из мембраны, по-видимому, происходит и при длительном хранении бесклеточного препарата. Процесс экстракции должен быть сравнительно медленным процессом, так как активность ММО от концентрации белка бесклеточного препарата (от 0,05 до 0,5 мг/мл) имеет линейную зависимость (рис. 13).
class5 ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ЦИТОХРОМА Ссо В МЕТАНМОНО
ОКСИГЕНАЗНОЙ РЕАКЦИИ MC.CAPSUC.ATUS ШТАММ М. class5
Солюбилизация метанмонооксигеназы
Были предприняты попытки получить растворимый препарат ММО, Для этого использовались три подхода: I) фрагментация м«шбран ультразвуком, 2) солюбилизация фосфолипазой А и Д при их совместном действии и по отдельности. При обработке мембранных структур ультразвуком (19 кгц, 5С) активность ММО прогрессивно уменьшалась по мере увеличения времени обработки. По данньм ультрацентрифугирования препаратов, обработанных ультразвуком, при 144 THCg в течение I часа количество растворенного белка увеличивалось до 10-15$ от исходного препарата. Однако надосадоч-ная фракция не обладала активностью ММО и ее добавление к осадку фрагментированных мембран не восстанавливало активность фермента.
Неионные детергенты (тритон Х-100 и тритон Х-І0І) слабо со-любилизировали мембраны и при концентрации выше 1,5-2$ полностью инактивировали ММО. Добавление надосадочной фракции после центрифугирования мембранных структур, обработанных тритоном Х-100 или Х-І0І, или ультразвуком, к суспензии осадка мембран, полученных центрифугированием (144 Tbic.g І час) мембран, обработанных неионогенными детергентами, не приводило к восстановлению ферментативной активности.
Обработка мембран холатом или дезоксихолатом натриз ( 2,5$) приводила к полной солюбилизации мембран и полной инакт.двации ММО. Добавление к полученному препарату различных солюбилизиро-ванных фракций не восстанавливало активности фермента, оосфоли-паза А не солюбилизировала мембраны, а фосфолипаза Д (I мг на 10 мг мембран) растворяла их лишь частично ( — 5-10$). Совместная обработка мембран фосфолипазой А и Д приводила к такому же результату, что и обработка только фосфолипазой Д. В обоих случаях активность фермента после разделения на растворимую фракцию и фракцию мембран полностью терялась.
Причины инактивации ММО в процессе солюбилизации могут быть следующие: I) разведение одного из белковых компонентов; 2) высокая лабильность одного из компонентов в солюбилизированном состоянии; и 3) наличие специфического ингибитора (регулятора), который в мембране пространственно разобщен, а при солюбилизации выходит из мембраны и инактивирует один из белковых компонентов ММО.
Необычные свойства цитохрома CQQ, а также указания на участие этого цитохрома в ферментативном окислении метана, побудили нас разработать метод выделения цитохрома ссо ИЗ метанокисля-ющих бактерий Mc.capsuLatus, штаммМ, и изучить его физико-химические параметры. Представлялось также интересным очистить ци TOXpOM CQQ ИЗ Мс.capsuLatUs ДО ГОМОГеННОГО СОСТОЯНИЯ И ИССЛЄД0 вать его роль в реакции окисления метана с тем, чтобы проверить не является ли разведение этого компонента при солюбилизации мембран лимитирующим фактором в реакции ММО.
