Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Токсикология фторацетата и некоторые аспекты современной биохимии (обзор литературы) 13
1.1. Введение в токсикологию фторацетата 13
1.2. Аконитаза и молекулярный механизм токсического действия ФА 17
1.3. Вещества, метаболизм которых связан с образованием ФА 22
1.4. Токсикокинетика и механизм детоксикации ФА 25
1.5. Токсикодинамика, клиника и патоморфология при отравлении ФА 26
1.6. Физиолого-биохимические механизмы действия ФА 33
1.7. Роль глутамата и глутамина в метаболизме млекопитающих 45
1.8. Некоторые аспекты биохимии мозга и действие фторацетата на клетки нервной системы ' 52
1.9. Терморегуляция и термогенез 68
1.10. Гонадотоксическое и эмбриотоксическое действие ФА 73
1.11. Терапия при интоксикации ФА 74
1.12. Обзор литературы: Резюме 7 8
Глава 2. Материалы и методы исследования 80
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение " 102
3.1. Токсикологические характеристики фторацетамида и фторацетата натрия в острых экспериментах с лабораторными животными 102
3.2. Исследование токсикокинетики фторацетата 114
3.3. Исследование токсикодинамики при интоксикации фторацетатом 118
3.3.1. Электрофизиологические исследования при интоксикации ФАА и ФАН 118
3.3.2. Биохимические признаки интоксикации ФАА и ФАН 143
3.3.3. Морфологические особенности токсикодинамики крыс при остром отравлении ФАН в дозе }4ЛД50 175
3.3.4. Изучение особенностей гемодинамики при интоксикации ФА: Эндотелий-зависимая релаксация сосудов крыс 180
3.4. Исследование ФАН и ФЦ на изолированных клетках и митохондриях 183
3.4.1. Действие ФАН и ФЦ на изолированные митохондрии 183
3.4.2. Изучение действия ФА на эндотелиальные клетки и кардиомиоциты 192
3.4.3. Действие ФА на клетки асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) 197
3.4.4. Оценка функционального состояния макрофагов 201
3.4.5. Действие ФАН на развитие апоптоза клеток иммунной системы 203
3.4.6. Оценка кинетических параметров агрегации тромбоцитов методом малоуглового светорассеяния 209
3.4.7. Динамика [Са ] в тромбоцитах кролика при интоксикации ФАА 213
3.5. Разработка эффективных средств терапии при остром отравлении лабораторных животных ФАН 213
3.5.1. Выбор и апробация веществ - компонентов потенциальной терапии 214
3.5.2. Принципы формирование терапевтического комплекса МЕТИС и проверка его эффективности при остром отравлении ФАН 234
3.6. Эксперименты по токсикокинетике и токсикодинамике при интоксикации ФАН с применением препаратов серии МЕТИС 331
3.6.1. Определение фторацетата в плазме крови, гомогенатах органов и моче крыс при интоксикации ФАН 241
3.6.2. Тестирование комплекса МЕТИС при интоксикации ФАН в модельных экспериментах in vivo 244
3.6.3. Влияние ФА на процессы ацетилирования у крыс 249
3.6.4. Физиологические и биохимические показатели крыс при острой интоксикации ФАА с использованием экспериментальной терапии 252
3.6.5. Физиологическое исследование ЭКГ, параметров внешнего дыхания и температуры крыс при острой интоксикации ФАН с использованием экспериментальной терапии 255
3.6.6. Биохимические показатели в органах и плазме крови крыс при интоксикации ФАН и применении лечебных препаратов 268
Заключение 273
Выводы 293
Список публикаций 296
Список цитируемой литературы 302
- Физиолого-биохимические механизмы действия ФА
- Электрофизиологические исследования при интоксикации ФАА и ФАН
- Оценка кинетических параметров агрегации тромбоцитов методом малоуглового светорассеяния
- Тестирование комплекса МЕТИС при интоксикации ФАН в модельных экспериментах in vivo
Введение к работе
Актуальность проблемы
Несмотря на высокий уровень знаний о молекулярных основах жизнедеятельности клеток, существует большой разрыв в понимании взаимосвязи между первичным биохимическим действием вещества и конечным физиологическим ответом организма. С этим связана проблема направленного поиска эффективной терапии в токсикологии. К высокотоксичным соединениям, для которых имеющиеся средства терапии недостаточно эффективны, относятся фторорганические соединения. Эти соединения привлекли к себе пристальное внимание в 1940-х годах, когда среди большого класса биологически инертных веществ была выявлена группа чрезвычайно токсичных соединений с общей формулой CH2FCOOR, объединенных названием «фторацетат» (ФА). Действие ФА проявляется не сразу, но спустя латентный период, составляющий для человека и других млекопитающих от получаса до нескольких часов, даже при отравлении летальными дозами. Наиболее известным представителем ФА является фторацетат натрия (ФАН, вещество 1080). Это соединение использовалось в ряде стран для контроля численности популяций некоторых позвоночных. Для большинства неадаптированных теплокровных животных летальная доза ФАН составляет менее 2 мг/кг [Atzert, 1971].
Уровень ФА в некоторых австралийских растениях достигает 5 г/кг сухого веса [Hall, 1972] и при однократном или повторном употреблении домашними животными служит причиной их гибели, вызывая порой ощутимый экономический ущерб [McCosker, 1989; Minnaar et al., 2000]. Существует ряд фторсодержащих соединений, метаболизм которых в организме протекает с образованием ФА в качестве промежуточного продукта: это противоопухолевые препараты (5-фторурацил и изомеры фторэтилнитрозомочевины), N-(2-фторэтил)-производные наркотических анальгетиков нормеперидина и норметазоцина, пестициды (1,3-дифтор-2-пропанол и фторацетамид, ФАА), 1 -(ди)гало-2-фторэтаны и фторэтанол [Reifenrath et al., 1980; Tisdale, Brennan, 1985; Feldwick et al., 1998 и др.]. В промышленных регионах ФА можно обнаружить в составе капель дождя и тумана [Rompp et al., 2001]. Актуальность проблем токсичности и терапии отравлений ФА существенно возросла в связи с возникновением новой опасности - международного терроризма [Holstege et al., 2007]. Физико-химические особенности, отсутствие вкусовых или обонятельных признаков наличия вещества, отставленное проявление токсичности, схожесть клинических признаков отравления с рядом естественных недомоганий, - все это обусловливает
8 повышенный интерес к всестороннему изучению механизмов действия ФА и поиску эффективных средств терапии интоксикаций.
Механизм токсического действия ФА широко известен под названием "летальный синтез" [Peters, 1952; Peters, Wakelin, 1953], суть которого заключается в превращении в клетках организма нетоксичного самого по себе ФА в токсичный фторцитрат (ФЦ), ингибирующий аконитазу и работу цикла Кребса. Собственно токсикантом является 4-гидрокси-/и/?анс-аконитат, дериват фторцитрата, не содержащий фтора [Kent et al., 1985], а ФЦ получил название «суицидный субстрат» [Clarke, 1991]. В результате блокады аконитазы происходит накопление цитрата в органах и тканях организма, истощаются энергетические запасы, отмечен внутриклеточный дисбаланс ионов и осмотический дисбаланс.
Изучению клинической картины отравления ФА, исследованию механизма токсического действия, а также поиску средств терапии отравлений было посвящено большое количество работ [Chenoweth, 1949; Rammel et al., 1985 и др.]. Несмотря на то, что было исследовано распределение ФА в организме и его действие на отдельные ферментные комплексы, существуют пробелы в понимании молекулярных и клеточных механизмов действия ФА, в понимании взаимосвязи между молекулярными первопричинами и ответом целого организма, и это не позволяет исследователям разработать эффективные средства терапии острой интоксикации ФА. Выявленные признаки отравления недостаточно проанализированы с точки зрения биохимических механизмов адаптации к токсическому воздействию, не предложены альтернативные подходы к терапии с учетом метаболических особенностей различных тканей и органов, поэтому до сих пор не удалось в полной мере подавить метаболизм ФА, ускорить его выведение из организма, нейтрализовать вызываемые им изменения. Этиловый спирт, предложенный около 60 лет назад, но главным образом симптоматическая терапия являются на сегодняшний день единственно приемлемыми средствами медицинской помощи [Dorman, 1990; Proudfoot et al., 2006].
Необходимо также отметить, что при интоксикации ФА, другими ядами, при возникновении критических состояний различного генеза отсутствует строгая специфика патогенеза, поскольку главной причиной токсического эффекта и - в конечном счете - гибели организма является тканевая гипоксия. Поэтому изучение механизмов биохимической адаптации к токсическому действию ФА, установление критических звеньев, определяющих динамику и исход интоксикации, разработка научно обоснованных и эффективных средств терапии острых отравлений ФА является актуальной проблемой, имеющей важное теоретическое и прикладное значение для успешной диагностики и терапии отравлений другими ядами; это также может повысить эффективность терапии критических состояний путем разработки новых антигипоксантов.
9 Цель и задачи исследования
Цель настоящей работы заключалась в комплексном изучении биохимических, физиологических, клинико-токсикологических механизмов действия фторацетата и разработка эффективного средства терапии острых отравлений фторацетатом. Для достижения данной цели были поставлены и решены следующие задачи:
1) Исследовать клинические признаки острого отравления, физиологические и
морфофункциональные особенности действия фторацетата на примере фторацетата натрия
(ФАН) и фторацетамида (ФАА).
Исследовать биохимические особенности действия фторацетата на митохондрии, клетки и организм экспериментальных животных, исследовать взаимодействие энергопродуцирующих и сигнальных систем при воздействии фторацетата.
Теоретически и экспериментально обосновать принципы биохимической адаптации клеток и тканей при действии фторацетата; определить основные направления для разработки эффективной терапии острых отравлений фторацетатом.
4) Разработать терапию острых отравлений фторацетатом и в экспериментах на
животных продемонстрировать ее эффективность.
Положения диссертации, выносимые на защиту
1. Острая интоксикация фторацетатом сопровождается развитием комплекса
клинических, морфофизиологических и биохимических показателей, свидетельствующих о
первичном и преимущественном поражении нервной системы экспериментальных
животных.
Биохимическая адаптация при интоксикации фторацетатом состоит в перестройке метаболических путей и утилизации альтернативных энергетических субстратов с целью поддержания биологического окисления; биохимическая адаптация отражает сопряжение внутриклеточной сигнализации и биологического окисления.
Физиолого-биохимической основой острого токсического действия фторацетата является разобщение процессов внутриклеточной сигнализации и биологического окисления, что выражается в необратимом снижении уровня восстановленных пиридиновых нуклеотидов, подавлении дыхания митохондрий, нарушении баланса внутриклеточного кальция, потере чувствительности или гибели клеток.
4. Основные направления для фармакологической коррекции при острой
интоксикации фторацетатом: конкуренция за коэнзим А, конкуренция за митохондриальную
аконитазу, активация альтернативных метаболических путей, утилизация накапливающегося
цитрата.
10 5. Комплекс веществ, включающий в себя искусственный акцептор электронов, источник восстановительных эквивалентов, донор окиси азота и источник ацетатных групп обладает высоким терапевтическим эффектом при использовании в ранние сроки острой интоксикации фторацетатом и способствует коррекции ряда биохимических и физиологических показателей у экспериментальных животных.
Научная новизна
С использованием ФАН, ФАА и ФЦ впервые проведено комплексное изучение физиолого-биохимических, морфофункциональных, клеточных и субклеточных (митохондриальных) механизмов действия ФА и его токсического метаболита ФЦ. Предложено теоретическое объяснение и экспериментальное обоснование динамики ряда биохимических показателей в органах и тканях животных при воздействии ФА. Изложены представления о сопряжении и разобщении процессов внутриклеточной сигнализации и биологического окисления. Впервые использована методология изучения кинетических параметров агрегации тромбоцитов для определения характера интоксикации, механизма действия и апробации средств терапии. Обнаружено явление гиперчувствительности тромбоцитов с последующим переходом клеток в рефрактерное (нечувствительное) состояние. Предложена концепция причинно-следственных связей на молекулярно-клеточном уровне при блокаде цикла Кребса на уровне митохондриальной аконитазы. Обоснованы принципы биохимической адаптации и фармакологической коррекции при острой интоксикации фторацетатом. Разработан и теоретически обоснован эффективный терапевтический комплекс «Метис»: введенный в ранние сроки интоксикации ФА, этот комплекс спасает от гибели экспериментальных животных с коэффициентом эффективности до 4,3 (по ЛД50). В экспериментальную токсикологию и фармакологию введен метод биохимической коррекции, основанный на принципе управляемого и целевого воздействия на ход метаболических процессов.
Теоретическое и практическое значение работы
Проведенные исследования расширяют представления о механизмах нарушения гомеостаза при острой интоксикации ФА и позволяют лучше понять взаимосвязь специфических и неспецифических проявлений интоксикации. Знание биохимических механизмов, лежащих в основе адаптации клеток и тканей при воздействии токсического агента, дает возможность эффективно скорректировать нарушенный гомеостаз. Разработанные и теоретически обоснованные средства терапии острых отравлений ФА углубляют наши знания о взаимодействии сигнальных и энергопродуцирующих систем, о
путях биохимической адаптации, о биохимической основе физиологических ритмов. Новый терапевтический комплекс после проведения доклинических испытаний в кратчайшие сроки может быть внедрен в клиническую практику, поскольку его компоненты отличаются дешевизной и доступностью. Использование методологии малоуглового светорассеяния для изучения морфофункциональных характеристик клеток крови свидетельствует о высокой ее эффективности для определения характера интоксикации, а также для разработки средств терапии, что является несомненным вкладом в методическое обеспечение физиолого-биохимических и токсиколого-фармакологических исследований. Проанализирована не только научная литература по разным аспектам действия ФА, но также проведен анализ ряда смежных областей биохимии и клеточной биологии. Полученные в работе практические результаты и теоретические обобщения могут быть использованы в лекционных курсах по биохимии, токсикологии и фармакологии.
Апробация работы
Результаты исследований доложены: на конференции «Кровообращение в условиях высокогорной и экспериментальной гипоксии» (Фрунзе, 1986), II Всесоюзной конференции «Биоантиоксидант» (Черноголовка, 1986), Всероссийской конференции «Проблемы стандартизации в здравоохранении» (Москва, 2001), научно-практической конференции, посвященной 40-летию НИИГПЭЧ (Санкт-Петербург, 2002), Международном симпозиуме по антитерроризму (Волгоград, 2002), на международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003, 2005, 2007), международном симпозиуме «Медицинские и биологические проблемы, связанные с уничтожением химического оружия» (Волгоград, 2003), 2-м съезде токсикологов России (Москва, 2003), Российской научной конференции «Медицинские аспекты радиационной и химической безопасности» (Санкт-Петербург, 2004), на 8-м и 9-м международных симпозиумах по защите от химического и биологического оружия (Ґетеборг, 2004, 2007), 3-м Всемирном конгрессе по химическому, биологическому и радиационному терроризму (Дубровник, 2005), I съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005), Обществе токсикологов США (Сан-Диего, 2006; Шарлотт, 2007), на Питтсбургской конференции (Орландо, 2006), 16-й Северной конференции по судебной медицине (Турку, 2006), 3-й Международной научно-практической конференции «Новые технологии создания инновационных лекарств» (Химки, 2006), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 45-летию НИИГПЭЧ (Санкт-Петербург, 2007), на конференции, посвященной 50-летию Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2007), 10-й международной конференции по химическому разоружению (Брюссель, 2007), на обзорной конференции программы ВН Госдепартамента США (Пущино, 2007).
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 352 страницах машинописного текста, содержит 90 таблиц и 168 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, 6 экспериментальных разделов с дополнительным анализом литературы, обсуждением и частными выводами, заключения и общих выводов. Библиография включает 72 отечественных и 687 зарубежных источников.
Физиолого-биохимические механизмы действия ФА
Патогенез фторацетатного отравления сложен и окончательно не изучен. Данные, различных исследований о физиологических и биохимических ответах при интоксикации ФА необычайно противоречивы. Токсикологическая картина становится более понятной, если принимать во внимание вид животного, метаболические особенности того или иного органа или ткани, степень интоксикации и динамику показателей во времени. Подавление окислительного метаболизма клеток непосредственно или опосредованно обусловливает основные проявления токсичности ФА [Proudfoot et al., 2006]. Пусковым моментом в цепи патологических проявлений является блокч ЦТК, который определяет целый комплекс аномальных процессов и степень тяжести поражения. Влияние ФА на физиолого-биохимический и функциональный статус клеток, органов и тканей напрямую связан с уровнем окислительного метаболизма рассматриваемого объекта. Так, например, ни ФА, ни малонат (ингибитор сукцинатдегидрогеназы, СДГ) не ингибируют фагоцитоз, поскольку активность ЦТК слабо развита в макрофагах [Cifarelli et al., 1979]. Особая ситуация в клетках мозга, нейронах и астроцитах; этому будет посвящена отдельная глава. Видимо, значение имеет соотношение активностей различных метаболических путей: гликолиза и пентозофосфатного шунта, пируватдегидрогеназного и тиокиназного пути поступления углерода в ЦТК, трансаминазных реакций.
Физиолого-биохимические эффекты, вызываемые ФА, включают в себя: избыточное накопление цитрата [Buffa, Peters, 1950; Pattison, 1959; Annison et al., 1960; Egyed, Brisk, 1965; Buffa et al., 1973]; нарушение транспорта цитрата из MX [Eanes et al., 1972; Kirsten et al., 1978]; повышение уровня лактата [Engel et al., 1954; Allcroft et al., 1969; Schultz et al:, 1982; Taitelman et al., 1983a]; отклонения в регуляции углеводного обмена [Elliott, Phillips, 1954; Egyed, Miller, 1971; Bobyleva-Guarriero et al., 1984]; снижение концентрации СЖК [Liang, 1977]; снижение концентрации макроэргических соединений в тканях [Williamson, 1967; Koenig, Patel, 1970; Stewart et al., 1970]; повышение концентрации аденозина [Liang, 1977]; уменьшение потребления кислорода [Saito, 1990]; нарушение баланса бивалентных катионов, в частности, ионов Са2+ [Buffa, Peters, 1950; Perez, Frindt, 1977; Bosakowski, Levin, 1986]; дисбаланс кислотно-щелочного равновесия [Taitelman et al., 1983a; Szerb, Redondo; 1993]; повышение уровня ионов аммония [Stewart et al., 1970]; изменение уровня» ГАМК [Peters, 1952; Maytnert, Kaji, 1962; Stewart et al., 1970]; повышение фосфора и различных ферментов в плазме [Bgin et al., 1972]; нарушения гемодинамики [Liang, 1977]; нарушение теплопродукции и терморегуляции [Brockmann et al., 1955; Taitelman et al., 1983b; Misustova5 et al., 1980]. Прежде чем останавливаться подробнее на некоторых из них, отметим, что-последний признак в этом перечне — температурный дисбаланс - отнюдь не означает последнее место по значимости; более того, этот признак может оказаться одним- из. решающих в патогенезе отравлений ФА, так что проблеме терморегуляции будет отведена отдельная глава в нашем обзоре, после рассмотрения роли ЦНС.
Пожалуй, едва ли не единственным биохимическим показателем, качественные (но не количественные) изменения которого согласуются в разных исследованиях, - это уровень, цитрата в ткани. Существует положительная корреляция между количеством введенного ФА. и последующим уровнем цитрата в плазме у представителей одного рода животных, с одной стороны, и между чувствительностью животных к ФА и уровнем цитрата в плазме у представителей разных родов, с другой стороны.[Twigg, King, 1989; King et al., 1989]. Там; где дыхание поддерживается в основном-за счет окисления ацетата, превращение ФА во ФЦ сопровождается особенно быстрым накоплением цитрата [Buffa et al., 1973]. У травоядных животных при остром отравлении ФА отмечается времязависимое увеличение уровней цитрата, лактата и глюкозы в крови. Так, при введении овцам ФА на уровне ЛД5о (0,5-1,0 мг/кг) наблюдается постепенное нарастание концентрации этих веществ в течение суток (до 36 мкг/мл цитрата против 19 мкг/мл в норме) [Schultz et al., 1982], а при абсолютной смертельной дозе -через 1,5 часа после введения [Annison et al., 1960]. При введении овцам абсолютно смертельной дозы ФАА (20 мг/кг) изменения биохимических показателей нарастают через 4-5 часов: уровень глюкозы и лактата повышается в 3 раза, цитрата в сердце - в 4 раза, в почках - в 2,5 раза [Egyed, Brisk, 1965].
У других животных при сублетальных дозах ФА концентрация цитрата в тканях начинает увеличиваться через 30 минут после введения яда, достигает максимума через 4-6 часов с последующим падением до нормы примерно через 40 часов [Pattison, 1959]. При острой интоксикации ФА концентрация цитрата в сердце крыс увеличивается в 8-15 раз и в сыворотке в 5-10 раз. Однако у собак цитрат увеличивается всего в 2-3 раза в сердце и сыворотке, а концентрация АТФ в сердце уменьшается незначительно. И у крыс, и у собак наблюдается значительная гипергликемия — двукратное увеличение глюкозы в крови, коррелирующее с уровнем цитрата в плазме. Общий кальций плазмы собак был уменьшен на 18% при дозе ФЦ" 8 мг/кг в/в, наблюдалась обратная корреляция с уровнем цитрата в плазме [Bosakowski, Levin, 1986]. Снижение ионизированного кальция и выраженный, метаболический ацидоз с повышенным уровнем лактата наблюдали в эксперименте на анестезированных кошках с искусственной вентиляцией и внутривенным введением ФАН [Taitelman et al., 1983а]. Концентрация глюкозы в крови крыс может повышаться в 3 раза через 24 часа после введения ФА (250 мг% по сравнению с 80 мг% в контроле), при этом также было отмечено повышение лактата в крови, времяи дозозависимые изменения данных показателей [Engel et al., 1954]. Однако уровень общего кальция в крови крыс не изменился [Bosakowski, Levin, 1986].
Увеличение концентрации цитрата прямо пропорционально дыхательной активности ткани: метаболически активные ткани — сердце, почки, селезенка - в максимальной степениt накапливают цитрат. Однако в печени, также имеющей высокий респираторный уровень и метаболическую активность, наблюдается невысокое накопление цитрата [Cole et al., 1955; Twigg et al., 1986]. Отмечена корреляция уровня цитрата с мышечной активностью: так, в диафрагме накапливается больше цитрата, чем в мышцах бедра. Получены данные о том, что в печени скорость накопления цитрата регулируется половыми гормонами [Ord, Stocken, 1953; Buffa et al., 1972], а также зависит от характера питания: в печени голодного животного накопление цитрата незначительно или отсутствует вовсе [Buffa, Peters, 1950; Potter, Busch, 1950; Ord, Stocken, 1953]. В то же время имеются сведения, что и при голодании интоксикация ФА вызывает накопление цитрата в печени, если содержание глутатиона в этом органе ниже нормы [Mead et al., 1985].
Электрофизиологические исследования при интоксикации ФАА и ФАН
В ходе исследования было проведено 2 серии экспериментов на крысах линии Wistar с острой интоксикацией фторацетамидом (ФАА). Препарат вводили внутрижелудочно в дозе 11 мг/кг (У2ЛД50). В первой группе животных регистрацию физиологических параметров осуществляли на бодрствующих ненаркотизированных крысах. Во второй группе эксперименты были проведены на крысах, находящихся под лёгким уретановым наркозом (1 и 0,5 г/кг для контрольных и опытных животных, соответственно). Уретан вводили за 15 минут до начала инструментального исследования. В данной группе крыс регистрацию через 1 час проводили только у 4-х животных, введение уретана перед 3-м часом интоксикации им не проводили. Необходимость применения легкого наркоза была связана с трудностью проведения 3-х минутной записи ЭКГ, лишенной артефактов, у бодрствующих крыс. В обеих сериях экспериментов обследуемые группы состояли из 10 животных. Для регистрации физиологических показателей крыс помещали в специальный станок, ограничивающий их подвижность. Регистрацию проводили до введения препарата, через 1, 3 и 24 часа после начала интоксикации (обе группы животных), а также через 3 и 7 суток в группе наркотизированных крыс.
Общие положения. В обеих экспериментальных группах погибло по 20% крыс, что свидетельствует о фактическом превышении дозы 1/2ЛД50 в данном эксперименте и для данной партии животных. В первой группе животных гибель зарегистрирована через 6 часов и к 1 суткам после введения препарата. Во второй группе — на 3 и 4 сутки. Судороги отмечены в обеих группах крыс. Интересен факт повышения чувствительности отравленных животных к действию уретана. Так, для достижения одинакового уровня состояния «пассивного бодрствования», когда крыса принимает боковое неподвижное положение, сохраняя при этом тактильную чувствительность и ориентировочные реакции, отравленным крысам потребовалась вдвое меньшая доза наркотика, причем такой эффект сохранялся вплоть до 7 суток обследования. Известно, что уретан является наркотиком «коркового» типа действия, т.е. преимущественно влияющего на корковые структуры мозга и слабо затрагивающего стволовые. Кроме того, механизм действия уретана связан с его тормозящим влиянием на- дегидрогеназы и угнетением окислительных процессов в клетках [Аничков, 1982]. Таким образом, нельзя исключить однонаправленное действие ФАА и уретана на определенные метаболические процессы в клетки, что привело к развитию более выраженных реакций при совместном действии препаратов.
Регистрация электромиограммы не выявила никаких отклонений у подопытных животных по сравнению с контролем. Имеющаяся двигательная активность носит поведенческий характер и связана с реакцией избегания (попытками животного освободится из станка). Интенсивность и частота вспышек несколько возрастают к 1 часу после введения препарата и затухают до интактного уровня к 3-му и 24-му часу обследования.
Клинический анализ ЭКГ. Прежде всего, надо отметить, что при анализе ЭКГ нами не обнаружено принципиальных отличий между двумя экспериментальными группами крыс. Однако есть определенные различия, в основном касающиеся динамики развития патологических процессов. Показатели ЭКГ для каждой группы представлены в таблицах 3.3.1.1 и 3.3.1.2. В первые часы после введения ФА происходит увеличение амплитуд всех компонентов ЭКГ. Особенно значимо растет амплитуда зубцов Р и R. К 3 часам эти сдвиги приобретают устойчивый характер. У части животных наблюдается смещение сегмента ST ниже изолинии и снижение амплитуды зубца Т, что свидетельствует о развитии ишемических нарушений. Начиная с 4-го часа у значительной части животных начинается рост амплитуды зубца Т, причем его форма может быть представлена двухфазным (V.) колебанием. К 24 часам форма как предсердного, так и желудочкового комплексов ЭКГ могут претерпевать значительные изменения.
В процессе обследования у 2-х крыс первой группы в момент регистрации возникли тонические и тонико-клонические судороги. В первом случае приступ наступил за I мин
120 перед регистрацией ЭКГ, во втором — через несколько минут после окончания записи. На обоих рисунках видно, что дыхание в этот момент носит достаточно правильный характер, по частоте существенно не отличающийся от фонового уровня. На кривых усредненного кардиоцикла отчетливо выражено значительное увеличение амплитуды зубца Р, в одном из случаев даже превышающей амплитуду зубца R. В этом же случае отмечен и значительный рост амплитуды зубца Т. Наблюдавшиеся нами изменения амплитуды зубца Р согласуются с данными литературы о повышении легочного артериального давления и сосудистой резистентности с первого часа интоксикации ФАА [Taitelman et al., 1983b]: У первой группы крыс в первые 24 часа интоксикации не выявлено значимых нарушений длительности интервалов ЭКГ. Вместе с тем, у части крыс имело место возникновение атриовентрикулярных (суправентрикулярных) экстрасистол. У 80% крыс первой группы наблюдается нарушение ритма сердца. Развитие аритмий подтверждается и значениями коэффициента аритмии (табл. 3.3.1.3). Первоначально развивается синусовая аритмия с сохранением нормальной формы предсердной части комплекса ЭКГ. При этом ЧСС остается достаточно высокой. У 20% крыс происходит дальнейшее нарушение ритма и развитие аритмии неясной этиологии. На фоне значительной брадикардии и редукции зубца Р могут возникать вспышки тахикардии (синдром тахикардии — брадикардии), возникающие как в случайном порядке, так и имеющие определенную ритмичность, чаще всего с периодом 10-15 сек. С известной осторожностью можно предполагать развитие в этом случае синдрома слабости синусового узла, однако нам не удалось зарегистрировать ни одного периода асистолии, характерной для данного синдрома.
Во второй группе животных, находящихся под влиянием уретана, также происходит рост предсердной части ЭКГ, но не к 3-му, а уже к 1-му часу обследования. То же происходит и с амплитудой зубцов R и Т (табл.3.3.1.2). В отличие от животных первой группы, у наркотизированных крыс происходит замедление проводимости: увеличиваются длительности всех зубцов и интервалов ЭКГ. Наблюдается устойчивое, прогрессирующее снижение частоты сердечных сокращений, достигающее наибольшей степени к 24 часам и сохраняющееся на низком уровне вплоть до 7-х суток. Однако следует отметить, что ЧСС у крыс 2-й группы оказалась все-таки выше, чем у крыс 1-й группы. Анализ ЭКГ по трем стандартным отведениям показал наличие сдвига электрической оси сердца крыс вправо, на что указывает углубление зубца S в I и II отведениях, рост амплитуды зубца R во II и III отведениях (24 ч, 72 ч). Величина зубца Рщ Pi , т.е. имеется смещение предсердной электрической оси вправо, что позволяет говорить о возможной гемодинамической перегрузке правых отделов сердца вследствие развития острой легочной гипертензии. Для крыс данной группы характерно значительное возрастание амплитуды зубца Т в первые сутки интоксикации. При этом форма зубца часто имеет двухфазный ( "/.) характер с чрезвычайно глубокой отрицательной фазой. Безусловно, речь идет о значительных ишемических. поражениях миокарда, однако было бы некорректным на основании 3-х отведений давать заключение о наличии очаговых поражений.
Оценка кинетических параметров агрегации тромбоцитов методом малоуглового светорассеяния
Тромбоциты (кровяные пластинки) являются самыми малыми по размеру клетками крови: диаметр покоящихся (интактных) тромбоцитов составляет 2-4 мкм. Тромбоциты представляют собой возбудимую популяцию форменных элементов крови, ответственную за процессы коагуляции, репарации сосудистой стенки, депонирование и транспорт биологически активных веществ, осуществление иммунных реакций организма. Такая полифункциональность тромбоцитов обусловлена существованием на их мембране множества разнообразных рецепторных комплексов. Выявлено более 20 участков связывания биологически активных веществ (БАВ) различной химической природы. (пуринов, катехоламинов, производных триптофана, простагландинов, пептидов и др.) [Siess, 1989; Ralevic, Burnstock, 1998]. Для модельных исследований тромбоциты интересны тем; что сочетают в себе структурно-функциональные особенности нервных, мышечных и секреторных клеток. Часть рецепторных комплексов тромбоцитов (например, адренорецепторы, серотониновые и опиатные рецепторы), а также система захвата, серотонина идентичны структурам, выделенным из нейрональных мембран [Da Prada et al., 1988; Siess, 1989]. Микротрубочки и микрофиламенты образуют цитоскелетную сеть, белки которой составляют более половины общего количества тромбоцитарных белков и по своим физико-химическим характеристикам аналогичны сократительному аппарату мышечных клеток [Ермолаева и др., 1991]. Наконец, тромбоциты являются секреторными клетками? [Гаврилов и др., 1985; Siess, 1989], поскольку способны выделять вещества, находящиеся в плотных гранулах и альфа-гранулах, за счет сокращения системы открытых каналов, связанных с поверхностью клеток. Секреция не сопровождается лизисом тромбоцитов.
Интактные тромбоциты имеют форму двояковыпуклых дисков с гладкой, реже складчатой ("рифленой") поверхностью [Frojmovic, Milton, 1982; Siess, 1989]. В ответ на стимул тромбоциты переходят в сферизованное состояние с последующим образованием псевдоподий. Начальная стадия активации тромбоцитов, т.е. сферизация, развивается в течение 2-3 сек и сопровождается увеличением объема клеток примерно в 1,5 раза. Для образования псевдоподий требуется 7-8 сек. В результате активации возрастает доступность интегринового комплекса ПЬ/Ша на поверхности тромбоцитов к адгезивным белкам (фибриногену, фибронектину, фактору Виллебранда) и уменьшается отрицательный-поверхностный потенциал [Frojmovic, Milton, 1982]. Тромбоциты с псевдоподиями образуют агрегаты, первоначально - димеры [Миндукшев, 1996]. Процесс сопровождается выбросом химических веществ, находящихся в гранулах, из клеток в окружающую среду [Siess, 1989]. Происходит лавинообразное усиление процесса - активированные тромбоциты выделяют вещества, которые в свою очередь вызывают агрегацию. Наряду с прямой агрегацией возможно появление рефрактерных клеток, которые должны отличаться повышенным содержанием цАМФ и цГМФ [Миндукшев, 1996]. В интактных тромбоцитах уровень цАМФ ненамного ниже той концентрации, которая необходима для насыщения всех участков связывания на соответствующей протеинкиназе А (РКА), а уровень цГМФ на 1-2 порядка ниже этого показателя [Eigenthaler et al., 1992]. Это означает, что даже незначительное повышение концентрации цАМФ в тромбоцитах (примерно в 1,5 раза) приводит к активации большинства РКА, тогда как для полной активации цГМФ-зависимых протеинкиназ необходимо повысить концентрацию цГМФ в десятки раз. РКА подавляет инозитольный обмен в тромбоцитах посредством фосфорилирования белка Rap-1В, который участвует в сопряжении G-белка с фосфолипазой С [Lapetina, 1990], фосфорилирует рецепторы инозитолтрифосфата, угнетая рецептор-зависимое повышение концентрации внутриклеточного кальция [Авдонин, Ткачук, 1994], фосфорилирует киназу легких цепей миозина, угнетая ее, что приводит к быстрому дефосфорилированию 20 кДа-белка и разрушению комплекса миозин-цитоскелет [Siess et al., 1993].
Большинство гормонов и биологически активных веществ, вызывающих изменение содержания цГМФ в клетках, требуют для реализации этого эффекта присутствия ИОНОВЇ кальция. Однако ряд агентов негормональной природы (нитрозамины, нитропруссид натрия, энтеротоксин Е.соН, порфирины) оказывают влияние на активность фермента гуанилатциклазы независимо от кальция [Murad et al., 1979]. Концентрация Са2+ в цитоплазме изменяется от 0,1 до 0,5 мкМ с интервалом в 1 минуту. Индукторы агрегации практически не влияют на амплитуду повышения кальция в цитоплазме одиночного тромбоцита, но увеличивают частоту его флуктуации до нескольких колебаний в секунду [Авдонин, Ткачук, 1994; Ткачук, 1999]. Т.о., Са-зависимые эффекты БАВ прямо пропорциональны частоте флуктуации цитоплазматического кальция, поскольку при большей частоте осцилляции увеличивается вероятность насыщения этим ионом Са-связывающих белков. Поскольку количественная оценка действия БАВ на внутриклеточный кальциевый обмен и биохимические процессы весьма затруднена, необходимо искать новые методические и методологические приемы для адекватной оценки физиологической реакции на первичный стимул. Деркачев с соавторами [1998], разработали новый способ оценки функционального состояния тромбоцитов — метод малоуглового светорассеяния, позволяющий изучать не только агрегацию, но и активацию тромбоцитов, причем делать это без предварительной отмывки клеток от плазмы и при физиологической концентрации ионов Са2+ в среде (см. методы).
Действие ФАН на активацию и агрегацию тромбоцитов in vitro
Для оценки кинетических параметров агрегации тромбоцитов в опытах с ФАН in vitro тромбоциты крыс преинкубировали с 0,1 мМ - 10 мМ ФАН в течение 1-5 минут. В качестве контроля использовали ацетат натрия в эквивалентных концентрациях. При внесении ФАН непосредственно в кювету с суспензией тромбоцитов крыс регистрируется активация тромбоцитов. На рис. 3.4.6.1 приведен протокол записи эксперимента, в котором активацию клеток инициировали однократным внесением 5 мМ ФАН. Для сравнения показана активация тромбоцитов, индуцированная применением 5 мМ ацетата натрия. После активации тромбоцитов ФАН или ацетата натрия (АН) инициировали агрегацию тромбоцитов путем однократного применения соответствующих концентраций АДФ от 10 до 100 нМ (рис.3.4.6.2). На основании данных протокола регистрации изменения интенсивности светорассеяния тромбоцитами, проинкубированных с ФАН или ацетатом с последующим воздействием АДФ, построен график зависимость скорости агрегации от концентрации этого активатора (рис.3.4.6.3). Данный эксперимент свидетельствует о том; что повышение чувствительности тромбоцитов к АДФ обусловлено не деполяризацией плазматической мембраны в результате повышения концентрации внеклеточного натрия, [Friedhoff, Sonenberg, 1983], а в результате воздействия ФА на энергопродуцирующие системы тромбоцитов. При исследовании характера агрегационного ответа тромбоцитов, проинкубированных со ФАН в концентрации 10 мМ, получены следующие значения параметров функциональной активности тромбоцитов: CJO=25,24±8,34; /г=2,93±0,62. При инкубации тромбоцитов с ФАН в концентрации 5 мМ получены следующие значения параметров статуса: ЕС5о=Ъ5,13± 12,55; Л=3,01±0,96. Для сравнения агрегационный ответ оценивали для тромбоцитов, проинкубированных с ацетатом в концентрации 5 мМ: isCjo=53,83±12,74; /г=2,96±0,79. Величины ECso характеризуют статус тромбоцитов, проинкубированных с ФАН, как гиперчувствительный к индуктору агрегации, а коэффициент Хилла (И) и характер зависимости скорости агрегации от концентрации АДФ (рис.3.4.6.3) свидетельствуют о кооперативном связывании пуриновых рецепторов с АДФ.
Тестирование комплекса МЕТИС при интоксикации ФАН в модельных экспериментах in vivo
Проведена серия экспериментов по оценке агрегационной активности тромбоцитов крыс через 3 и 24 часа после подкожного введения ФАН в дозе 2,0 мг/кг и последующим использованием двух схем лечения комплексами Метис-1 и Метис-2. В качестве сравнения на каждом сроке исследования использовались животные, получившие ФАН в этой же дозе без применения терапии, животные, получившие терапию без интоксикации ФАН, а также контрольные животные (без введения ФАН и антидота). В каждой группе мы исследовали по 2-3 крысы Wistar, проводя 5-6 анализов тромбоцитарной фракции крови от каждой крысы. У животных через 3 часа после введения ФАН развивалась характерная клиническая картина отравления, описанная в предыдущих разделах. Кровь при отборе была повышенной вязкости, темного цвета. Дополнительное внесение одной капли гепарина (около 20 мкл) в пробирку позволило предотвратить моментальную агрегацию тромбоцитов. Для активации использовали АДФ в диапазоне концентраций 60,0 нМ - 4,0 мкМ. Кинетические параметры агрегации тромбоцитов при интоксикации крыс приведены в таблице 3.6.2.1.
Функциональный статус тромбоцитов крыс после применения комплекса Метис-2 Функциональное состояние тромбоцитов при воздействии комплекса Метис-2 мы исследовали через 3 и 24 часа после его введения лабораторным животным. У животных после введения комплекса Метис-2 клинические проявления отравления отсутствовали; кровь была алого цвета обычной вязкости. Тестирование показало, что под влиянием антидота наблюдался более сильный «отклик» активационной кривой (12) и увеличение латентного периода агрегационной кривой (2) (рис.3.6.2.2). Количественная оценка кинетических параметров агрегации тромбоцитов крыс после введения антидота Метис-2 показала выраженное снижение скорости агрегации тромбоцитов через 3 часа после введения и менее выраженное - через сутки (по сравнению с контролем, табл.3.6.2.2). Незначительное влияние комплекса Метис-2 на ЕС50 и снижение Umax свидетельствует о его влиянии на эфферентное (интегриновое) звено функционального ответа тромбоцитов, т.е. аналогично влиянию МС (см. табл.3.5.1.4, 3.5.1.5).
. Совмещенные по х, у осям координат графики в расширении .SCR — кривых малоуглового рассеяния в углах 12 (синие) и 2 (зеленые). Активация І мкМ АДФ контрольной плазмы и плазмы крыс через 24 часа после введения комплекса Метис-2 (выделенные кривые).
Оценка функционального статуса тромбоцитов крыс при интоксикации ФАН с применением комплекса Метис-2
Животным после отравления ФАН в дозе І/2ЛД50 был введен комплекс Метис-2. Тестирование методом малоуглового рассеяния показало, что после введения антидота чувствительность тромбоцитов к активации АДФ (ЕС50) была значительно повышена по сравнению с тромбоцитами отравленных животных без лечения. Динамика изменений кинетических параметров агрегации тромбоцитов крыс в группах без применения (А) и с применением (В) антидота Метис-2 представлены на рис.3.6.2.3. Повышение чувствительности тромбоцитов к активатору АДФ под действием антидота происходит в 10,6 раз через 3 часа и в 6,5 раз через 24 часа. Мы рассчитали условную «потребность» тромбоцитов в активаторе АДФ после отравления животных ФАН без лечения и при введении Метис-2 (рис.3.6.2.4). С одной стороны, такое представление ярко демонстрирует степень потери чувствительности тромбоцитов и терапевтическую эффективность комплекса Метис-2. С другой стороны, представление о «потребности» в сигнальных молекулах, по сути, выражает потребность неравновесной системы в определенном количестве информации и (или) негэнтропийной энергии для приведения ее в сбалансированное состояние [Зерниченко, Гончаров, 1989]. араметры тромбоцитов крыс после отравления ФАН и после лечения комплексом Метис-2.
А - Umax и ЕС50 через 3 и 24 часа после отравления ФАН; В - Umax и ЕС50 через 3 и 24 часа после отравления ФАН и введения комплекса Метис-2.
Проведена оценка влияния комплекса Метис-1 на функциональную активность тромбоцитов крыс через 3 и 24 часа после введения терапевтического препарата (табл. 3.6.2.3). Под влиянием Метис-1 наблюдался значительный «отклик» активационной кривой (12), как и в случае с комплексом Метис-2 (рис.3.6.2.5). Однако кинетические параметры агрегации не претерпели столь же значительных изменений, хотя направленность изменений параметра Umax через 3 часа аналогична той, что мы наблюдали с комплексом Метис-2 и с веществом МС.
Совмещенные по х, у осям координат графики кривых, полученных на приборе при регистрации светорассеяния в углах 12 (синие) и 2 (зеленые). Активация 1 мкМ АДФ контрольных тромбоцитов и тромбоцитов, полученных через 24 часа после введения комплекса Метис-1 (выделенные кривые).
Оценка функционального статуса тромбоцитов крыс при интоксикации ФАН с применением комплекса Метис-1
Применение комплекса Метис-1, как и применение Метис-2, привело к повышению чувствительности тромбоцитов к активатору АДФ при интоксикации ФАН по сравнению с тромбоцитами отравленных животных без введения антидота. Кинетические параметры агрегации тромбоцитов крыс в группах без применения антидота (А) и с применением антидота (В) представлены на рисунке 3.6.2.6. Сопоставление действия комплексов Метис-1 и Метис-2 на крыс при интоксикации ФАН показало идентичный по эффективности результат влияния на функциональную активность тромбоцитов через 3 часа после введения препарата. Через 24 часа у отравленных животных, получивших антидоты, наблюдались незначительные отличия в эффектах Метис-1 и Метис-2 (рис.3.6.2.7). Таким образом, комплексы Метис-1 и Метис-2 обладают аналогичным механизмом воздействия на тромбоциты крыс. Препараты не вызывают гиперчувствительности тромбоцитов контрольных животных, снижают максимальную скорость агрегации, и нормализуют чувствительность тромбоцитов отравленных животных к активатору АДФ.
