Введение к работе
Актуальность проблемы. Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) был впервые обнаружен в 1981 г. (Gallo, 1981) как необъяснимое прогрессирующее поражение иммунной системы, ассоциированное с развитием оппортунистических инфекций и саркомы Капоши. В 1983 г. был открыт ретровирус, являющийся этиологический агентом заболевания (Gotlib е.а., 1981). Вирусом преимущественно поражаются Т4 лимфоциты человека (так называемые "клетки-помощники" и индукторы, имеющие СД-4 антиген на своей поверхности), без которых не может развиться эффективный иммунный ответ против большинства антигенов.
Результатом инфицирования является уменьшение количества и нарушение функций атакованных Т4 лимфоцитов и как конечный этап -поражение иммунной системы и развитие синдрома приобретенного иммунодефицита.
Способность к продуктивной инфекции в человеческих клетках у различных изолятов ВИЛ неодинакова, что свидетельствует о высокой генотипической изменчивости ВИЧ при пассировании его в клеточных культурах и особенно при репликации в организме человека в процессе естественной циркуляции. Единичные и групповые мутации регистрируют в разных участках вирусного генома. Естествено, что высокая генотипическая изменчивость ВИЧ проявляется в изменении свойств белков вируса. Следовательно, иммунологические свойства белков ВИЧ являются существенными для проведения и оценки результатов диагностики.
Для обнаружения инфицированности ВИЧ большое значение имеет выявление антител к внутренним белкам вируса р17, р24, предшественнику р55, а также к оболочечным гликопротеидам др120, др41 и предшественнику дрібо (J. Gaidsmit е.а., 1987).
Поскольку получение антигенов для тест-систем путем культивирования ВИЧ биологически' опасно (Хаитов Р. М., 1988), проводятся работы по получению отдельных белков вируса или их блоков с помощью методов биотехнологии с экспрессией в про- или эукариотических клетках (Crowl е.а., 1985). Это позволяет получать антигены ВИЧ практически в неограниченном количестве, причем белки, полученные этими способами, обладают свойствами природных белков и безопасны в работе.
Появление определяемых в сыворотке крови антител может наблюдаться на протяжении от одной недели до нескольких месяцев после инфицирования, что уменьшает возможности серологических тестов для раннего выявления инфицированности. Несмотря на очевидные преимущества иммунологических методов - простоту, высокую чувствительность, они имеют существенный недостаток, связанный с наличием перекрестных реакций нормальных сывороток с белками ВИЧ (Huttall е.а., 1986).
При помощи ДНК-гибридизационного метода нуклеотидная последовательность ВИЧ-1 может определяться в лимфоцитах или тканях (лимфатических узлах, печени, плаценте и т. д.) только у части инфицированных (Shaw е.а., 1984). Harper и соавторы (1986) с помощью данного метода показали, что только в одной из 100000 клеток лимфатических узлов инфицированных людей содержится вирусная последовательность нуклеотидов.
Поэтому в последнее время для увеличения количества необходимой последовательности нуклеотидов стали использовать метод ферментативной амплификации или цепной полимеразной реакции (ПЦР) (Erlich е.а., 1989). Показано, что метод ПЦР для определения ВИЧ РНК в 100000 раз более чувствителен, чем детекция неамплифицированного материала блот-гибридизации ЗІР-мечеными пробами (Byrne е.а., 1988).
В связи с вышеизложенным перед нами была поставлена задача получения рекомбинантного белка вируса иммунодефицита и изучения его некоторых биохимических и иммунологических особенностей.
Цель и задачи исследования. Основная цель данной работы -получение рекомбинантного предшественника внутренних белков ВИЧ-1, изучение его физико-химических и иммунологических особенностей, а также возможности использования в иммунохимической диагностике инфицированное ВИЧ-1.
Задачи исследования :
-
Выделить зараженные лимфоциты; провести химико-ферментативный синтез генов, кодирующих внутренние белки ВИЧ-1 с использованием провируса в качестве матрицы.
-
Клонировать синтезированные гены для получения рекомбинантных белков.
-
Исследовать структуру и физико-химические свойства рекомбинантных белков.
4. Изучить иммунологические свойства рекомбинантных белков и
возможности их использования для выявления антител к ВИЧ-1.
Научная новизна и практическая ценность работы. Получена рекомбинантная плазмида pGSgag, содержащая гибридный ген, фланкированный вирусными последовательностями. В конструкции находится промотор осповакцины, литированный в соответствующей ориентации с кодирующей частью чужеродного гена.
Получены штаммы-продуценты осповакцины, синтезирующие протеин-предшественник р55-внутренних вирионных белков р17, р24 и р12. Рекомбинантный белок имеет молекулярную массу 55 килодальтон. Она соответствует ожидаемой молекулярной массе полипептида, несущего последовательности р17, р24 и р12.
Показано, что максимальный уровень синтеза рекомбинантных белков отмечается через 36 часов после инфекции.
Обнаружена ЫН2-модификация рекомбинантного белка миристиловой кислотой.
При электронно-микроскопическом исследовании клеток, инфицированных рекомбинантной осповакциной определялись круглые частицы с диаметром 100-150 нм. Частицы определялись как в клетках, инфицированных реконбинантным вирусом, так и в материале, полученном при градиентном центрифугировании.
Рекомбинантный белок использовали для исследования сывороток крови методом дот-блоттинга и иммуноблоттинга. В опыте были выявлены все сыворотки, содержащие антитела к внутренним белкам ВИЧ-1. При этом не наблюдалось ложнопозитивных реакций с сыворотками крови здоровых доноров.
Апробация работы. Материалы работы доложены на IV Республиканской научно-практической конференции с участием зарубежных ученых (США) "Лечение внутри- и околосуставных повреждений. Медицина катастроф" (Уфа, 1991), 56-й итоговой научной конференции молодых ученых БГМИ (Уфа, 1991), на 2-м Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (Самарканд, 1991) и на заседании Уфимского отделения Российского биохимического общества (Уфа, 1994).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация представлена на
страницах машинописи, содержит УС/ рисунков, <у таблиц, состоит
из введения, обзора литературы, описания собственных исследований,
выводов и списка литературы ( 2. отечественных и
иностранных источников).
Похожие диссертации на Получение и некоторые биохимические особенности рекомбинантного белка р55
