Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Получение специфических антител к норадреналину и возможность их использования для предотвращения повреждающего действия этого катехоламина на миокард Смотров Сергей Петрович

Получение специфических антител к норадреналину и возможность их использования для предотвращения повреждающего действия этого катехоламина на миокард
<
Получение специфических антител к норадреналину и возможность их использования для предотвращения повреждающего действия этого катехоламина на миокард Получение специфических антител к норадреналину и возможность их использования для предотвращения повреждающего действия этого катехоламина на миокард Получение специфических антител к норадреналину и возможность их использования для предотвращения повреждающего действия этого катехоламина на миокард Получение специфических антител к норадреналину и возможность их использования для предотвращения повреждающего действия этого катехоламина на миокард Получение специфических антител к норадреналину и возможность их использования для предотвращения повреждающего действия этого катехоламина на миокард Получение специфических антител к норадреналину и возможность их использования для предотвращения повреждающего действия этого катехоламина на миокард Получение специфических антител к норадреналину и возможность их использования для предотвращения повреждающего действия этого катехоламина на миокард
>

Данный автореферат диссертации должен поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - 240 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Смотров Сергей Петрович. Получение специфических антител к норадреналину и возможность их использования для предотвращения повреждающего действия этого катехоламина на миокард : ил РГБ ОД 61:85-3/1163

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА I. Повревдающее действие катехоламинов на миокард и существующие способы ингибирования их кардиотоксического действия 8

ГЛАВА II. Проблема получения антител к катехоламинам 18

ГЛАВА III. Материалы и метод 29

3.1. Реактивы 29

3.2. Получение коныогированных антигенов 29

3.3. Определение молярного соотношения НА-белок в конъюгатах 31

3.4. Иммунизация животных 32

3.5. Метода идентификации антител 33

3.6. Методы определения специфичности и сродства антител 35

3.7. Метод выделения антител 36

3.8. Метод определения валентности антител... 37

3.9. Модель изолированного сердца крысы, пер-фузируемого по Лангендорфу 38

3.10. Определение каталитической активности ЛДГ 39

ГЛАВА ІV. Получение антител к НА 41

4.1. Конъюгация НА с различными носителями .. 42

4.2. Индукция антител к НА 45

4.3. Зависимость титров антител от вида носителя 51

ГЛАВА V. Характеристика индуцированных антител к НА 58

5.1. Оценка специфичности антител к НА 58

5.2. Сродство антител к НА в зависимости от длительности иммунизации и вида носителя 64

5.3. Установление валентности антител к НА при помощи спин-меченого НА 66

ГЛАВА VІ. Доказательство возможности предотвращения повревдающего действия на с помощью антител к этому катехоламину (опыты на модели изолированного сердца крысы) 76

Заключение 81

Выводы 87

Список литературы 89

Введение к работе

Одной из важных проблем профилактики и лечения сердечнососудистых заболеваний является разработка методов защиты миокарда от катехоламинового повреждения. К возможным путям снижения кардиотоксического действия этих биологически активных соединений относят в основном фармакологическое воздействие на метаболизм катехоламинов, их захват и освобождение миоцитами, ин-гибирование и активацию ферментов, непосредственно участвующих в процессе гормон-рецепторного взаимодействия, на процесс пере-кисного окисления липидов и транспорт кальция в миокардиальные клетки. На этих принципах частично основано применение ^-блока-торов, антиоксидантов и антагонистов кальция. Вместе с тем, использование последних не всегда приводит к достаточно высокому лечебному эффекту.

Более перспективным следует признать применение для нейтрализации кардиотоксического эффекта катехоламинов специфических антител. Их использование в качестве антагонистов биологически активных веществ ознаменовалось значительными успехами лишь в последние годы. Результаты работ, выполненных рядом зарубежных исследователей ( Dzau et al. ,1980; НаЪег ,I98; Butler , 1982), позволяют считать, что антитела способны нейтрализовать специфическое действие физиологически активных веществ. Однако, подобного рода антагонисты были применены в основном к таким соединениям, как лекарственные препараты.

Благодаря интенсивным исследованиям последних лет была доказана принципиальная возможность получения антител к катехо-ламинам ( Grota, Brown ,1976; Miwa et al. ,1976; Diener et al. ,1981; Полевая и соавт.,1981; Geffard et al.,I984a, 1984Ъ). Однако, до настоящего времени известно крайне мало о по- - б - лучении антител к основным катехоламинам - А и НА, а вопросы их влияния на физиологическую активность этих симпатомиметичес-ких аминов до сих пор не изучены.

Учитывая это, основная цель настоящей работы заключалась в исследовании возможности получения антител к НА и их использования в предотвращении повреждающего действия этого катехолами на на миокард. Выбор данного биогенного амина был обусловлен его исключительной ролью в регуляции функции миокарда и высокой степенью повреждающего действия на миоциты в условиях целостного организма (Меерсон, Гомазков,1971; Rona et ai. ,1975).

Для достижения поставленной цели решались следующие конкретные задачи:

Разработка условий получения конъюгированных антигенов путем введения НА в белковую матрицу.

Разработка условий получения антител к НА путем иммунизации животных.

Идентификация сывороточного компонента, связывающего НА.

Определение титров, сродства и специфичности антител к НА.

Определение валентности антител путем титрования связывающих участков гаммаглобулина спин-меченным НА.

Исследование возможности ингибирования повреждающего действия избыточных концентраций НА на миокард с помощью антител к этому катехоламину.

Результаты проведенной работы позволяют вынести на защиту следующие положения. Получены конъюгаты, содержащие разное количество НА в пересчете на макромолекулу носителя, который был связан путем сочетания этого катехоламина с такими белками, как ГУ, БТ и БСА. Предложена схема иммунизации животных, в результате применения которой у кроликов образуются антитела,взаимодействующие с НА. Получены данные, подтверждающие принадлежность связывающего сывороточного компонента к классу гаммагло-булинов. Установлено, что сродство антител и их титры зависят от вида применяемого при иммунизации конъюгированного антигена и длительности иммунизации. Показано, что антитела обладают высокой специфичностью по отношению к НА при взаимодействии с другими катехоламинами. Результаты, полученные путем титрования связывающих мест антител спин-меченым НА, указывают на бивалентный характер связывания антителами этого катехоламина. В опытах на модели изолированного сердца крысы показано, что мембрано-повреждающее действие НА, документированное по утечке внутриклеточной ЛДГ в перфузат, может быть специфическим образом предотвращено с помощью антител к НА.

Таким образом, существует перспектива использования полученных в работе результатов для широкого применения в клинической практике, в частности для решения ряда практических задач кардиологии.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Проблема получения антител к катехоламинам

В настоящее время интерес к проблеме получения антител к биологически активным соединениям очень велик. Индуцированные специфические антитела можно использовать для решения целого ряда задач, как медицинского, так и биологического характера: 1. Для идентификации различных соединений в биологических жидкостях при помощи радиоиммунологического метода и некоторых других родственных способов ( Reuter et al. ,1978; Kleimola , 1978; Spector ,1978; Peskar, Peskar ,1977; Voller et al.,I978; Iwasa et al. ,1978; Montgomery et al. ,1975; Wei, Almirez ,1975; Ullman et al. ,1976). 2. Для выяснения определенных сторон метаболизма и фарма-кокинетики лекарственных препаратов ( Cais et al» ,1975; Col-bum ,1980). 3. Для определения локализации физиологически активных соединений в биологических структурах ( Kbaw et al. ,1976,1980). 4. Для устранения аллергических реакций на фармакологические препараты ( Davis, Meade ,1970). 5. Для изучения взаимодействия гормонов и других биологически активных веществ с соответствующими рецепторами, а также для обнаружения рецепторов ( /гепп, НаЪег ,1979; . НаЪег ,1982). Основная литература по этой проблеме касается получения антител к различным соединениям для использования в радиоиммунологическом методе. Представляются весьма интересными данные о применении антител для снижения уровня биологически активных веществ в крови и тканях при определенной патологии. Известно использование антител как терапевтических средств предотвращения вредного воздействия на организм целого ряда экзотоксинов ( Koch et ai. ,1977; Latifі,Tabatabai ,1979; ziegler et al.,I98I), Также установлено, что антитела к таким биологически активным компонентам организма, как ферменты и рецепторы клеточных мембран, могут подавлять активность ЭТИХ ферментов ( Caldwell, Wigger ,1976; McCans et al. 1974; Dzau et al. ,1980) или блокировать специфические центры связывания рецепторов ( Kahn et al. ,1976; Shiu, Friessen ,1976; Heineman et al 1977). В экспериментах, как in vitro , так и in vivo показано специфическое противодействие антител физиологическому эффекту пептидных гормонов ( Christlieb et al. ,1969; Frantz,Kleinberg ,1970; Goodfriend et al. ,1970; Lipshutz et al. ,1972; Terry et al. ,1976; Woodside, Heimberg ,1976; Hoist et al. ,1978).

Возможность получения антител к низкомолекулярным соедине-ниям-гаптенам сыграла значительную роль в развитии неинфекционной иммунологии и иммунофармакологии, а также молекулярной биологии. Такие антитела способны подавлять физиологическое и фармакологическое действие соответствующих гаптенов. Они специфически блокируют стероидные гормоны ( Neri et al. ,1964; Ferin et al. 1974), простагландины ( Fitzpatrick et al. ,1978), серотонин ( Ranadive, Sehon ,1967; O Brien et al. ,1975), мелатонин ( Wiles et al. ,1977), гистамин ( Davis, Meade ,1970) и различные лекарственные препараты ( Berkowitz, Spector ,1972; Wainer et al. ,1973; Gunne et al. ,1975; Ковалёв и соавт.,1976; Butler et al. ,1977; Flynn et al. ,1977; Cerreta et al. ,1979; Butler 1982).

Чтобы получить антитела к низкомолекулярным соединениям, необходимо связать их прочной ковалентной связью с антигенным белковым или полипептидным носителем, причем сила и стабильность этой связи являются критериями для антигенности образующегося комплекса. Простая ковалентная связь обеспечивает эту стабильность.

В качестве антигенного носителя чаще всего применяют различные белки, например, сывороточный альбумин ( Berg, Kuss ,1980), гаммаглобулин ( Marton et al. ,1977), гемоцианин( Tateishi et al, 1980), а также синтетические полипептиды (Kamel, Gardner ,1978). Эти соединения имеют достаточное количество различных функциональных групп, пригодных для образования ковалентной связи с молекулой гаптена. Получены результаты, свидетельствующие о влиянии молекулы носителя на иммунологическую специфичность и связывающую способность антител на предоминирующую роль носителя в иммунных ответах ( Talamo et al. ,1968).

Реакции ковалентного связывания гаптенов с белками проводят в водных растворах при пониженной температуре и нейтральных значениях рН раствора, т.е. в условиях, которые позволяют избежать денатурации белков, К настоящему времени разработан синтез большого количества конъюгатов биологически активных соединений с белками (Erlanger ,1973; autler, Beiser ,1973). В получении антител, обладающих высокой специфичностью по отношению к данному гаптену, важную роль играют такие факторы, как структура конъюгированного антигена, применяемого при иммунизации, и характер иммунизации.

Гаптены чаще всего содержат одну или несколько функциональных групп, которые можно использовать для ковалентного связывания с реакционноспособными группами носителя. Один и тот же гап-тен можно связать с белковой молекулой различными способами. Установлено, что характер,"размер и положение ковалентной связи между гаптеном и носителем существенно влияют на специфичность индуцируемых антител ( Taiamo et al. ,1968). Кроме того, особое значение приобретает такая характеристика конъюгированного антигена, как количество присоединившихся молекул гаптена к молекуле носителя. Показано, что этот фактор сильно влияет на титры и специфичность полученных антител ( Hendel, Sarek ,1977).

Что же касается характера иммунизации, то здесь установлена определенная корреляция между количеством вводимого экспериментальным животным антигена, схемой иммунизации и специфичностью вырабатываемых антител. Так для получения антител, обладающих широким спектром действия по отношению к психотропным средствам, используют в основном внутримышечное введение больших количеств конъюгированного антигена (30-40 мг/кг веса) по кратковременной схеме иммунизации (Полевая и соавт.,1977). Вместе с тем, специфические антитела, практически не дающие перекрестной реакции с родственными гаптену соединениями, чаще всего получают с применением длительных схем иммунизации и с использованием малых доз антигена, вводимых совместно с адъювантом. Для этих целей большинство исследователей применяют способ иммунизации, предложенный Vaitukaitis et al. (1971).

Конъюгация НА с различными носителями

Осуществление возможности получения антител к катехоламинам открывает большие перспективы, как в плане изучения кругооборота в организме этих чрезвычайно важных соединений, так и в выяснении их роли в патогенезе целого ряда заболеваний и использование антител в качестве защитных соединений от гиперкатехола-минемии в организме.

Как явствует из проанализированной нами литературы, вопрос о получении таких антител основательно не исследовался. Те фрагментарные исследования, которые мы цитировали в литературном обзоре, посвящены лишь отдельным аспектам этой достаточно сложной проблемы.

В результате проведенных ранее исследований ( Miwa et ai. , 1978; Diener et al. ,1981) было установлено, что антитела к катехоламинам обладают различной специфичностью, которая зависит от вида применяемого конъюгированного антигена. При этом, основное внимание авторами уделялось на способ конъюгации катехолами-на с носителем. Однако из вышецитированных литературных данных известно, что специфичность антител к гаптенам зависит также и от ряда других факторов, к которым относятся: количество гапте-на, ковалентно связанного с антигенным носителем, вид этого носителя и способы введения животным антигена.

Наибольшее внимание заслуживает получение специфических антител к индивидуальным катехоламинам, которые в организме представлены в основном А,и НА. Miwa et al. (1978) получили высокоспецифичные антитела к A, a Spector (1972) попытался получить их к НА. Однако, применив предложенный им метод конъюгации, схема которого показана на рис.2, он не сумел добиться индукции специфических антител к этому катехоламину.

В этой работе мы предлагаем свой подход к получению специфических антител к НА - этому важнейшему компоненту симпато-адре-наловой системы. В основу его положены сведения о существовании определенной зависимости между специфичностью, титрами индуцируемых антител и способами конъюгации, видом входящего в состав конъюгата носителя, количества присутствующего в антигене гаптена и способами иммунизации.

В литературе имеются данные, свидетельствующие о том, что с удлинением "ножки", связывающей гаптен и носитель, возрастает специфичность антител к гаптену ( Vallejo et al,I982). На наш взгляд,применение сочетающего реагента, позволяющего создать такую "ножку", может определенным образом повлиять на эту характеристику антител к НА. Возможно этим объясняется неудачная попытка получения специфических антител к НА, предпринятая Spector (1972), который осуществил связывание катехоламина с белком путем непосредственного взаимодействия алифатической аминогруппы НА с карбоксильными группами носителя с образованием пептидной связи.

На наш взгляд, наиболее подходящим сочетающим агентом представляется глутаровый альдегид, который в мягких условиях способен взаимодействовать с аминогруппами соединений и в результате реакции образует алифатическую цепочку между гаптеном и носителем, состоящую из пяти метиленових звеньев.

Далее, мы также попытались оценить влияние различных антигенных носителей, входящих в состав конъгогированного антигена,на иммунохимические параметры индуцируемых антител к НА, Из многочисленных литературных источников известно, что применение в качестве носителя белков с разной молекулярной массой приводит к получению антител с неодинаковой специфичностью.

В работе нами были использованы ГУ, БТ и БСА, выбор которых обусловлен, наряду с существенными отличиями в молекулярной массе, их различной антигенной активностью. Кроме того, эти белки, имея определенную первичную структуру, содержат разное количество тех аминокислотных остатков, посредством которых происходит ковалентное присоединение молекул гаптена. На рис.4 приведена схема синтеза конъюгата, из которой видно, что связывание НА с белком осуществляется путем образования метиленового мостика между первичной аминогруппой катехоламина и первичными аминогруппами остатков аминокислот, входящих в состав носителя.

Полученные конъюгаты отличались друг от друга по содержанию НА, которое мы выражали в виде молярного соотношения НА/бе-лок. Как видно из табл.1, наибольшее количество НА связывается БСА (20-22 моля), и несколько меньшее БТ и ГУ (12-16 и 5-7, соответственно). Следует отметить, что близкие по значению результаты были получены при измерениях как спектрофотометрическим методом Doty (1948), так и с помощью меченого -НА. Исходя из этого, можно заключить, что наибольшие изменения в химической структуре претерпевает БСА.

Это подтверждается также данными, приведенными на рис.5, откуда видно, что УФ - спектр конъюгата сильно отличается от спектра нативного БСА, что говорит о существенной модификации БСА катехоламином.

Зависимость титров антител от вида носителя

Для определения специфичности мы применили метод подавления связывания антисыворотками %-НА возрастающими количествами таких, сходных по структуре, ближайших родственных соединений НА, как А, ДА» ДОФА и НМН. Этот метод ранее был апробирован ( Grota, Brown ,1976) и широко применяется для этих целей многими исследователями. Для проведения таких измерений необходимо, чтобы количество антител для всех пулов антисывороток было одинаковым. С этой целью были построены кривые разведения антисывороток, полученных ко всем коныогированным антигенам. Результаты по связыванию фиксированного количества %-НА различными количествами связывающего агента (в данном случае использовали серии двухкратных разведений антисывороток) представлены на рис.13. Видно, что с уменьшением содержания связывающего компонента сыворотки количество связанного -НА падает. Наибольшее связывание наблюдается в случае применения сыворотки, полученной к конъюгату БСА-НА. Эти результаты хорошо согласуются с данными, полученными методом РПГА, который также показал, что наибольшими титрами антител обладают антисыворотки к БСА-НА. Сыворотки, разбавленные до определенного титра, позволяющие связывать лишь 50% меченого НА, использовали в дальнейшем для оценки перекрестной реактивности.

Заключив, что наибольшее количество антител к НА индуцируется коныогированным антигеном БСА-НА, важно было установить, какое влияние оказывают различные виды носителей на специфичность получаемых антител. Для этого, нами был поставлен ряд опытов, характеризующих количественные параметри связывания соответствующими пулами антисывороток других катехоламинов. На рис.14,15,16 представлены данные по ингибированию связывания радиоактивного НА антителами, полученными к конъюгатам ГУ-НА, БТ-НА и БСА-НА, в присутствии родственных НА соединений. Из этих результатов видно, что связывание -НА зависит от концентрации добавляемых катехоламинов. При этом, введенный в систему в не-больших количествах (до 10 пг/мл) нативный НА во всех случаях вызывает существенное подавление связывания радиоактивного НА. В то же время для достижения такого эффекта требуется намного большие количества других соединений, из которых наиболее близкими по оказываемому действию к НА оказываются А и ДОФА, тогда как ДА и НМН не вызывают существенного ингибирования связывания %-НА даже в концентрациях 10" пг/мл.

Полученные данные по-ному подавлению связывания %-НА с антителами представлены в табл.2. Приведенные в ней результаты свидетельствуют о низкой перекрестной реакции полученных антител при взаимодействии с ДА, ДОЗД и НМН (от 0,1 до 2,7-3,4%).

Вместе с тем,наблюдается незначительная перекрестная реакция с А (около 15$). Это говорит о том, что антитела к НА способны "узнавать" структурные изменения в молекуле катехоламина, как в ароматической её части, так и в непосредственной близости от неё. Наряду с этим, антитела не имеют такой высокой специфичности для заместителей при аминогруппе и -углеродном атоме алифатической части, которые имеются в молекуле А и ДОФА. Наибольшая перекрестная реактивность антител по отношению к А вероятно вызвана большим структурным сходством А с НА.

Оценка специфичности антител к НА

Многочисленные литературные данные, проанализированные в обзоре литературы, обобщают возможность успешного угнетения биологической активности различных низкомолекулярных веществ, токсинов и фармакологических средств соответствующими антителами. Однако, лишь незначительное количество публикаций посвящено нейтрализации такого действия эндогенных веществ, что вероятно обусловлено некоторыми затруднениями, вызванными недостаточной изученностью механизмов этого подавления. Поэтому исследования,про-водимые на изолированных органах животных позволяют исключить вероятное воздействие многочисленных факторов, присутствующих в условиях целого организма, на процесс нейтрализации биологической активности этих соединений.

Как было показано в литературном обзоре катехоламины вызывают обширные некротические изменения в миокарде, что обуславливает важность поиска средств, предотвращающих эти изменения. В опытах на модели изолированного сердца мы попытались показать не только возможность снятия кардиотоксического действия НА, но и определить специфический характер этого действия. р. С этой целью, в перфузируемый раствор, содержащий ЮМ НА, были добавлены антитела, выделенные из пула иммунных сывороток кроликов, иммунизированных конъюгатом БСА-НА, из расчета связывания одной макромолекулой гаммаглобулина двух молекул НА. Выбор антител, полученных к БСА-НА, был обусловлен тем, что они обладали более высокими титрами и примерно одинаковой специфичностью по сравнению с антителами, полученными к другим конъюгатам. Поэтому для достижения поставленной цели имело смысл использовать именно эти антитела. Концентрация катехоламина в пер-фузируемом растворе (ЮМ) нами была взята не произвольно, а на основании данных, полученных Waldenstrom et al.(1978) и Opie et al. (1979), которые показали, что НА и А в концентрации ЮМ вызывают выраженный повреждающий эффект на миокард изолированного сердца крысы. Перед перфузией смесь антител и НА тер-мостатировали при 37С в течение двух часов.

После окончания инкубации препарат изолированного сердца перфузировали раствором, описанным выше. Скорость выхода ЛДГ в перфузат выражали в % относительно контроля. В качестве последнего использовали значения этого показателя в первые 20 минут перфузии этих же сердец, в течение которых перфузию осуществляли только раствором Кребса-Хензеляйта. При этом выход фермента принимали за 100%. Такая характеристика позволяет на наш взгляд более объективно судить о потере ЛДГ миокардиальными клетками в результате повреждающего воздействия при перфузии индивидуальных сердец.

На рис.22 представлены результаты этих опытов. Видно, что при воздействии на сердца НА (10 М) резко увеличивается прирост активности фермента во времени и за последние 20 минут опыта достигает максимального значения (10768 + 279,7%). В то же время, при перфузии сердец смесью НА (ЮМ) и антител (0,45 мкМ) выход ЛДГ из миоцитов практически не возрастает за все время опыта, причем наибольший прирост соответствует значению 172,2 + 47,3%. При сравнении этих данных с контрольными измерениями, которые были получены путем перфузии группы сердец раствором Кребса-Хензеляйта, можно видеть, что эти величины почти совпадают. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что антитела, добавленные в определенном стехио-метрическом соотношении в перфузируемый раствор, содержащий 10 М НА, связывая последний, полностью снимают кардиотоксичес-кое действие этого катехоламина, оцениваемое по этому биохимическому параметру.

Ранее нами была доказана специфичность антител к НА, индуцируемых в ответ на введение конъюгированных антигенов. Эти результаты были получены in vitro с привлечением радиометрических методов исследования. Однако, будут ли антитела столь же специфичны при постановке опытов на изолированных сердцах животных? Для выяснения этого, мы перфузировали сердца крыс смесью антител, полученных против НА, и кардиотоксической дозы А (10 М). Как видно из результатов опытов, представленных на рис.23, выброс ЛДГ был таким же значительным, как и в случае перфузии только раствором А с концентрацией ЮМ. Причем характер изменения выброса ЛДГ в перфузируемый раствор в зависимости от времени был одинаков для обоих случаев.

Полученный факт свидетельствует о том, что антитела к НА не связывают А и их присутствие в перфузируемом растворе в смеси с А не оказывает защитного действия на миокард от повреждающей дозы этого катехоламина. Таким образом, эти результаты подтверждают специфический характер связывающей способности антител и коррелируют с данными, полученными ранее в иммунохимичес-ких системах.

Похожие диссертации на Получение специфических антител к норадреналину и возможность их использования для предотвращения повреждающего действия этого катехоламина на миокард