Введение к работе
Актуальность проблемы. Одно из приоритетных направлений в
современной биохимии, биотехнологии и аналитической химии - поиск новых
детектирующих систем с использованием ферментов для улучшения
характеристик аналитических методов. В настоящее время широко
применяются методы иммуноферментного анализа (ИФА), в которых в
качестве маркера наиболее часто используется катионный изофермент с
пероксидазы хрена (ПХ). К сожалению, ПХ не всегда оптимальна для
аналитического применения, в частности, при создании
высокочувствительных систем со стабильным сигналом.
В последние годы описан ряд новых пероксидаз растений, некоторые из которых (например, пероксидазы сои, табака, картофеля, батата, масличной пальмы) относятся к группе анионных пероксидаз. Наиболее перспективна из них пероксидаза сои (ПС) - пока единственная коммерчески доступная анионная пероксидаза. Важным свойством ПС является ее более высокая стабильность по сравнению с ПХ. Применение в ИФА ПС в сочетании с хемилюминесцентнои детекцией ее ферментативной активности может привести к созданию высокочувствительных методов определения различных аналитов. Одна из задач, для которых использование новых ферментных маркеров имеет принципиальное значение, - мониторинг токсичных загрязняющих веществ в потребительской продукции и объектах окружающей среды. В частности, сульфаниламиды широко применяются в ветеринарии как антимикробные препараты и поэтому рассматриваются как значимые контаминанты продуктов питания животного происхождения. Предельно допустимые уровни содержания сульфаниламидов в пищевых продуктах, установленные в разных странах, варьируют от 20 до 100 мкг/кг. В связи с этим разработка высокочувствительных иммуноферментных тест-систем для определения сульфаниламидов с применением новых ферментных маркеров, таких как ПС, является практически важной задачей.
Цели и задачи исследования. Оценить возможности использования ПС в качестве маркера в ИФА по сравнению с ПХ на примере определения сульфаметоксипиридазина (СМП) - одного из широко применяемых сульфаниламидов.
Достижение этой цели предусматривало решение следующих задач: Разработать и оптимизировать твердофазный иммуноферментный анализ СМП с использованием в качестве ферментного маркера ПС,
Сокращения: ИФА - иммуноферментный анализ, ПС - пероксидаза сои, ПХ -пероксидаза хрена, САМ - Ы-(Ы-сульфанил)-4-аминомасляная кислота, СМП -сульфаметоксипиридазин, СТР - стрептавидин, ФБС-Т - 50 мМ фосфатный буфер, рН 7,4, с 0,1 М NaCI и 0,05% Тритона Х-100.
Изучить влияние условий проведения гетерогенной реакции окисления люминола пероксидом водорода, катализируемой ПС, на интенсивность хемилюминесценции,
Определить аналитические характеристики ИФА СМП с колориметрической и хемилюминесцентной детекцией, сравнив ПС и ПХ в качестве маркеров,
Провести апробацию ИФА СМП в реальных образцах.
Научная новизна работы. Изучено влияние условий проведения реакции окисления люминола пероксидом водорода, катализируемой пероксидазой сои, на интенсивность хемилюминесценции. Установлены оптимальные условия проведения этой реакции в гетерогенной системе твердофазного ИФА. Показано, что п-йодофенол в данном случае является не усилителем люминесценции, а тушителем неспецифического свечения. Продемонстрированы преимущества анионной ПС в качестве маркера по сравнению с катионной ПХ.
Практическая значимость работы. Показано, что пероксидаза сои может являться эффективной альтернативой пероксидазе хрена в иммуноферментном анализе. Использование коммерчески доступной ПС в ИФА СМП с хемилюминесцентной детекцией позволило существенно улучшить характеристики аналитического метода, что выразилось в формировании стабильного во времени сигнала и снижении предела обнаружения аналита. Перспективность использования ПС показана для контроля содержания практически значимого загрязняющего вещества, СМП, в образцах молока и озерной воды.
Связь работы с государственными программами. Работа была поддержана ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. (государственный контракт № 02.740.11.0868 от 28 июня 2010 г.).
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международных конгрессах «ICAS-2006» (Москва, 2006), «FESPB-2008» (Тампере, 2008) и «IUPAC-2009» (Глазго, 2009), международных конференциях «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006) и «Биотехнология: Экология больших городов» (Москва, 2010) и молодежной конференции «Биохимическая физика» (Москва, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи в журналах, входящих в перечень периодических изданий, публикация в которых рекомендуется ВАК, и 6 тезисов докладов на конгрессах и конференциях.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (5 глав), описания материалов и методов исследования,
результатов и их обсуждения (6 глав), выводов и списка цитируемой литературы (270 ссылок). Работа изложена на 140 страницах и включает 41 рисунок и 13 таблиц.
