Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 8- 59
2.1. Крахмал-запасное вещество растительной клетки 8
2.2. Особенности строения и свойства пуллуланана 16
2.2.1. Пуллулан и амилопектин: сходство и различие 18
2.3. Микробная деградация крахмалистого сырья 20
2.3.1. Расщепление крахмала амилолитическими ферментами. 22
2.3.2. Механизм действия амилолитического комплекса ферментов на крахмал 26
2.3.3. Пуллуланаза и механизм действия внеклеточной пуллуланазы 42
2.4. Получение высокомальтозных сиропов из крахмалосодержащего сырья 51
3. Экспериментальная часть 60-89
3.1. Материалы и методы исследования. 60
3.1.1. Материалы 60
3.1.2. Методы исследования 61
3.1.2.1 .Метод определения содержания сухих веществ в растворах с использованием рефрактометра 61
3.1.2.2. Опредедление восстанавливающих Сахаров по методу Бертрана 62
3.1.2.3.Опредедление количества сырой клетчатки методом Кюршнера и Ганака 65
3.1.2.4.Определение общего азота по Неслеру 66
3.1.2.5.Определение свободных минеральных кислот 72
3.1.2.6.Определение цветности раствора 73
3.1,2.7.Определение вязкости на капиллярном вискозиметре 73
3.1.2.8.Определение пуллуланазной активности методом Шомодьи-Нельсона 75
3.1.2.9.0пределение а-амилазной активности колориметрическим методом 78
3.1.2.10.Определение глюкоамилазной активности с применением метода Зихера-Блейера в модификации Смирновой В.А. для опреления глюкозы. 81
3 1.2.11 Определение (3-амилазной активности 84
3.1.2.12.Методы статистической обратки результатов 89
3.2. Результаты и их обсуждение 90-173
3.2.1. Скрининг микроорганизмов на их спсобность образовывать пуллуланазу 90
3.2.2. Идентификация видовой принадлежности перспективного штамма микроорганизмов. 96
3.2.3. Хранение культуры Micrococcus amylofaciens в лабораторных условиях 100
3.2.4. Оптимизация состава питательной среды для биосинтеза пуллуланазы бактериальной культурой Micrococcus amylofaciens 106 .
3.2.5. Подбор условий культивирования бактериальной культуры Micrococcus amylofaciens 114
3.2.6. Выделение, очистка и физико-химичекие свойства препарата пуллуланазы. 125
3.2.6.1. Выделение и физико-химические свойства препарата пуллуланазы 125
3.2.6.2. Очистка и физико-химические свойства препарата пуллуланазы 131
3.2.7. Гидролиз крахмалосодержащего сырья ферментными препаратами 138
3.2.7.1. Результаты исследования процесса разжижения крахмалов 138
3.2.7.2. Исследование процесса осахаривания крахмала 141
3.2.7.3. Влиянии различных факторов на процесс осахаривания крахмалистых субстратов (3-амилазы и оптимизация условий 143
3.2.7.4. Определение оптимальной дозы вносимого ферментного препарата (3-амилазы на стадии осахаривания 155
3.2.7.5. Применение композиции а и р-амилазы для получения высокомальтозных сиропов 158
3.2.7.6.. Использование мультиэнзимной композиции ферментов для гидролиза крахмалов 163
3.2.8. Варианты технологии ферментативного гидролиза крахмалов. 166
3.2.9. Некоторые свойства высокомальтозных сиропов, полученных из крахмалосодержащего сырья. 171
4. Обсуждение результатов 174-180
5. Выводы 181-182
6. Литература 183-193
7. Приложение 194-200
- Крахмал-запасное вещество растительной клетки
- Механизм действия амилолитического комплекса ферментов на крахмал
- Опредедление восстанавливающих Сахаров по методу Бертрана
- Скрининг микроорганизмов на их спсобность образовывать пуллуланазу
Введение к работе
В настоящее время тяжелая экологическая обстановка, вызванная загрязнением окружающей среды отходами химических и микробиологических производств, не совершенностью технологических процессов, воздействием производства на окружающую среду привели к неправильному использованию огромного количества сырья, изымаемого из природы. В конечный продукт превращается в среднем лишь 1,5-2,5%, остальная же его масса переходит в производственные и бытовые отходы, из которых только лишь 3,0% используется в качестве вторичного сырья. Ограниченность сырьевых ресурсов и экологически вредные для человека изменения в природе ставят вопрос о разработке комплексной и правильной технологии переработки отходов растительного сырья (Витол И.С. и др.,2000). Нарушение структуры питания приводит к дефициту отдельных видов пищевых продуктов, например, таких как углеводы. В свою очередь это, вызывает необходимость организации и развития производства сахаристых веществ из крахмалосодержащего сырья и их отходов для обеспечения населения пищевыми заменителями сахара, такими как патока с высоким содержанием мальтозы и глюкозы. Такие патоки являются ценными пищевыми продуктами, более сладкими и менее вязкими по сравнению с обычной карамельной патокой. Они не гигроскопичны, не кристаллизуются при хранении, в связи с чем, пригодны для замены сахара в кондитерской, хлебопекарной, консервной, молочной и других отраслях промышленности.
Приоритетным направлением в области решения проблем, обеспеченности пищевыми ресурсами народонаселения нашей планеты является внедрение в народное хозяйство экологически безопасных и экономически выгодных новых технологий. В связи с этим, перспективным представляется способ получения заменителей сахара путем ферментативного гидролиза крахмала с помощью амилолитического комплекса ферментов (Кислухина О.В., 2002). Особая роль отводится ферменту пуллуланазе, которая гидролизует в пуллулане а-1,6 связи, в результате возникают молекулы триоз, состоящих из трех остатков глюкоз (Грачева И.М. и.др.,2000).
Важно отметить, что пуллуланазы расщепляют не только пуллулан, а также а-1,6 связи в крахмале, предельных декстринах и гликогене. Это свойство пуллуланазы ценное и имеет большое практическое значение при получении сахаристых веществ на основе крахмала особенно при совместном действии сс-амилазы, Р- амилазы и глюкрамилазы, при этом не образуется продуктов кислой деструкции Сахаров, а также продуктов их термического разложения, рН конечного продукта колеблется от 5,5 до 6,0.
Учитывая тот факт, что в нашей стране промышленного производства пуллуланазных препаратов нет, вопрос о поиске продуцентов внеклеточной пуллуланазы, разработке условий культивирования последнего, выделении фермента из культуральной жидкости, а также о возможности использования мультиэнзимных композиций ферментных препаратов пуллуланазы при биоконверсии крахмалистого сырья с целью получения высокомальтозно-глюкозной патоки является весьма актуальным. Цели и задачи исследования.
Целью настоящей работы являлся поиск активного продуцента внеклеточной пуллуланазы, разработка условий культивирования последнего, получение ферментного препарата, обладающего пуллуланазной активностью и последующее использования мультиэнзимных амилолитических композиций ферментных препаратов при деградации крахмалистого сырья для получения высокомальтозно-глюкозной патоки.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
- скрининг микроорганизмов на их способность образовывать пуллуланазу; подбор оптимальной среды и режимов культивирования штамма - продуцента пуллуланазы;
- разработка оптимального способа хранения посевного материала микроорганизма-продуцента пуллуланазы;
- выделение и очистка внеклеточной пуллуланазы;
- исследование физико-химических свойств очищенного ферментного препарата пуллуланазы;
- использование амилолитического комплекса ферментов при деградации крахмалистого сырья для получения высокомальтозно - глюкозной патоки;
- разработка технологии получения высокомальтозно-глюкознои патоки из крахмалосодержащего сырья.
Научная новизна.
В представленной диссертационной работе научно обосновано и экспериментально доказано:
- по результам скрининга бактериальных культур, выделенных из различных почвенных образцов, найден продуцент пуллуланазы, изучены его культурально- физиологические особенности и определена видовая принадлежность - Micrococcus amylofaciens;
- оптимизированы условия питания и культивирования продуцента пуллуланзы;
- изучены условия выделения препарата внеклеточной пуллуланазы, хранения и очистки;
- на основании выявленных зависимостей выхода высокомальтозно- глюкозной патоки от - степени биоконверсии крахмалистого сырья впервые обоснован оптимальный состав ферментативных систем амилолитического действия;
- разработана технология получения высокомальтозно-глюкознои патоки при использовании мультиэнзимных композиций амилолитических ферментов;
Практическая значимость работы.
Проведенные исследования являлись основой для решения эколого-биологических задач по совершенствованию комплексной переработки различного крахмалосодержащего сырья и его отходов при использовании амилолитического комплекса ферментов микробного происхождения. Наряду с получением ценного продукта, а, именно, высокомальтозно-глюкознои патоки, нами одновременно решались вопросы снижения загрязнения окружающей среды отходами крахмалистого сырья и токсичными продуктами их деструкции:
- получен новый высокоактивный штамм - Micrococcus amylofaciens - продуцент пуллуланазы и разработана технология получения препарата пуллуланазы. -разработана технологическая схема переработки растительного сырья, содержащего крахмал с целью получения высокомальтозной- глюкозной патоки;
- разработана стадия осахаривания сырья с использованием энзиматических комплексов;
- увеличен выход глюкозы по сравнению с традиционной технологией на 18,0+1,5%;
- улучшены разнообразные свойства и качественные характеристики паток . Результаты проделанной работы подтверждены в полупроизводственных условиях на промышленной установке опытного участка апробаций научньіх разработок при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова.
Крахмал-запасное вещество растительной клетки
Запасным веществом растительной клетки является крахмал, который входит в состав клеточной стенки и соединительных тканей. Крахмал, состоящий из глюкозных остатков, представляет собой растительный полисахарид с очень сложным строением. Крахмал не является химически индивидуальным веществом. В растениях он находится в виде крахмальных зерен, различающихся по своим свойствам и химическому составу как в одном и том же растении, так, особенно, в различных растениях ( Кретович В.Л.,1986). Крахмальные зерна имеют овальную, сферическую и неправильную форму. Размеры крахмальных зерен колеблются в пределах от 0,002 до 0,15 мм. Наиболее крупные зерна - у картофеля, а самые мелкие - у риса и гречихи (Фараджева ЕДФедоров В.А.,2002). Плотность крахмала равна в среднем 1,5. Рентгеновские исследования показали, что крахмальные зерна обладают кристаллической структурой." Характерным свойством крахмала является его способность окрашиваться в синий цвет при добавлении раствора йода в водном растворе йодида калия (Плешков Б.П.,1976).Пользуясь этим реактивом, , можно обнаружить очень малые количества крахмала. Появление синего цвета обуславливается образованием комплексных и адсорбционных соединений между йодом и крахмалом. В холодной воде крахмальные зерна лишь набухают, но не растворяются. Если взвесь крахмальных зерен в воде постепенно нагревать, то они будут набухать все сильнее и, наконец, при определенной температуре крахмал образует вязкий раствор, называемый крахмальный клейстером. Температура, при которой происходит это изменение крахмала, называется температура клейстеризации. Крахмал на 96,1-97,6 % состоит из полисахаридов, образующих при кислотном гидролизе глюкозу. Содержание минеральных веществ в крахмале от 0,2 до 0,7%, они представлены в основном фосфорной кислотой, в нем найдены также некоторые высокомолекулярные жирные кислоты -пальмитиновая, стеариновая и др., содержание которых достигает 0,6%. (Гулюк Н.Г. и др., 1985.). Эти жирные кислоты адсорбированы на полисахаридной фракции крахмала, они могут быть удалены из него экстракцией нейтральными органическими растворителями, например метиловым спиртом. Фосфорная кислота в одних видах крахмала - кукурузном, пшеничном и рисовом -представляет собой примесь, удаляемую экстракцией теплой водой, спиртом или диоксаном, а в других, например, в картофельном, она всегда связана сложноэфирной связью с углеводной частью. Наличие такой прочной связи фосфорной кислоты в картофельном крахмале доказывается тем, что при его кислотном или ферментативном гидролизе получается глюкозо-6-фосфат (Уистлер Р.Л. и др.,1975). Углеводная часть крахмала это - двухкомпонентное соединение, состоящее из 13-30 % амилозы и 70-85 % амилопектина, которые упакованы и взаимосвязаны в жёсткие мицеллы и образования, оба компонента неоднородны, их молекулярная масса (М.м.) колеблется в широких пределах и зависит от природы крахмала. Линейные молекулы амилозы и разветвлённые молекулы амилопектина связаны друг с другом и ориентированы строго в пространстве, образуя структуры или мицеллы из линейных сегментов этих молекул, которые множественно связаны водородными мостиками и другими видами, взаимодействия. Предполагают, " что отдельные амилозные . или амилопектиновые молекулы могут простираться внутри клетки на несколько слоев, пронизывая, несколько мицеллярных областей; и именно эти молекулы сообщают вероятную устойчивость растительной клетки. Амилоза - это неветвящийся полимер, в котором остатки глюкозы соединены а-1,4-гликозидной связью; степень полимеризации около 2000. в "аномальных" амилозах с одной-двумя а-1,б-связями полимеризация может возрасти до 6000 (рис. 1.) Амилоза практически не обладает восстанавливающей способностью, так как в каждой молекуле амилозы имеется только одна свободная альдегидная группа. Молекула амилозы представляет собой растянутую спираль, шаг которой составляет 10,6 А и в каждый виток входит 3 остатка глюкозы. Максимальная длина молекулы амилозы достигает 7000 А глюкозы. При 60-2000 глюкозных. остатков молекулярная масса амилозы составляет от 10000 до 500000. В растворе спираль сжимается за счёт увеличения витка, в котором уже участвует 6 остатков глюкозы, образуется крахмальный золь, который не клейстеризуется и при длительном отстаивании при 50-60 С выпадает в осадок. При вхождении молекул йода в . спираль амилозы возникает характерный синий цвет. Строго говорить о величине молекулы амилозы нельзя, т. е. даже из одного образца крахмала извлекается амилоза, с величиной молекулы от 500 до 2000 остатков глюкозы. Амилопектин имеет большую молекулярную массу, чем амилоза, и более, сложное строение. Это ветвящийся полисахарид (рис.2.) Амилопектин при нагревании в воде образует коллоидальную клейстерилизованную массу, так называемый крахмальный гель, который стабилизируется в растворе и имеет с йодом фиолетовое, до чисто красного окрашивание. Амилопектин состоит из глюкозных остатков, соединённых а-1,4- и а-1,6-связями; последние составляют 4-5 % от первых,
Амилопектин является ветвящимся полисахаридом. Ветвления имеют место при образовании а-1,6-связи, эти связи возникают через каждые 13-25 а-1,4-связи (т. к. а-1,6-связей 4-5 % от общей суммы амилопектин связей в молекуле амилопектина). Внутренние отрезки цепей, состоящие из остатков глюкозы, соединённые а-1,4-связями, более короткие, чем их наружные концы, состоящие, как правило, из 25-27 остатков глюкозы, соединённых а-1,4-связями, все эти наружные концы не имеют редуцирующих групп. Поэтому гигантская молекула амилопектина содержит только одну .концевую редуцирующую группу. Точно пока строение амилопектина не установлено.
Очень долго считалось, что молекула амилопектина построена по принципу дихотомического деления, т. е. удвоение цепи в каждом месте, где есть сс-1,6-связь, так называемое древовидное строение молекулы,.то теперь различают А-цепочки, которые присоединены только на редуцирующем конце, и В-цепочки, которые имеют одну или несколько цепочек.
Но такое строение затрудняет объяснение упаковки молекулы амилопектина в крахмальном зерне и участие его в образовании кристаллической структуры крахмального зерна. Существует также мнение, что цепи амилопектина не раздваиваются, а образуют симметричные тройные и более сложные . разветвления, тогда молекула амилопектина приобретает продолговато-кустистую форму, обладающую большей компактностью в пространстве. Исследования в этом направлении были проделаны Ч. Мерсье. Результаты применения частичного, осторожного кислотного гидролиза крахмала, дифракция рентгеновских лучей, действия пуллуланазы и р-амилазы с последующим разделением продуктов гидролиза на сефадексе G-50 позволили учёным выдвинуть новую модель строения амилопектина (Linse, S., 2001,Bryant, D.T. 2005). Молекула построена как бы в виде сочетания кистей винограда. В этой модели чередуются компактные области с упорядоченной структурой: обладающие кристалличностью, медленно гидролизующиеся и менее упорядоченные участки, богатые точками ветвления. Отсутствие кристалличности приводит к быстрой гидролизуемости. "Кристалличные" участки имеют размер примерно 60 А, что соответствует степени полимеризации (СП),
Механизм действия амилолитического комплекса ферментов на крахмал
Причина путаницы в номенклатуре связана больше с Использованием аномерной формы свободных редуцирующих групп.в продукте, чем с гидролизуемой связью; продукты реакции бактериальной и грибной а-амилазы находятся в а-конфигурации, а продукты реакции 0-амилазы находятся в (3-конфигурации, хотя все эти ферменты гидролизуют а-1,4- связанные остатки глюкозы.
Для гидролиза крахмала используются, в основном, ферменты растительного и микробного происхождения.
Действие амилазы на неизмененные или даже механически поврежденные крахмальные зерна является весьма слабым по сравнению с их действием на оклейстеризованный крахмал. Поэтому в целом ряде отраслей пищевой промышленности, например в спиртовой промышленности, осахаривание крахмала солодом (источник активной амилазы) производится лишь после заваривания муки или измельченного картофеля.
Ферменты могут присутствовать в клетке в связанном с белками состоянии, и тогда они не обладают гидролитической активностью. А.И.Опарин показал, что в результате связывания амилазы с белками и дубильными веществами происходит ее полное инактивирование. Подобного рода связывание амилаз с белками играет большую роль в качестве фактора, регулирующего их действие в прорастающем и созревающем зерне. Каприлянц Т.,1991,Кодитувакку П.,2002) Со времени открытия амилазы Кирхгофом в течение длительного времени считалось, что она представляет собой один фермент (Квеситадзе Г.М.,1990.
Ферменты, гидролизующие крахмал в растительном сырье относятся по рекомендациям Международного биохимического союза к третьему классу -гидролазам, второму подклассу - ферментам, гидролизующим глюкозидные соединения. По специфичности воздействия на крахмал различают четыре типа амилаз: а-амилаза, Р-амилаза,-тлюкоамилаза и амило-1,6-глюкозидаза. Ферменты, используемые в гидролизе крахмала, представлены в табл.3. а-Амилаза (а-1,4-глюкан-4-глюканогидролаза КФ.3.2.1.1) иначе называемая декстриногенамилазой или гликогеназой, содержится в слюне, пищеварительном соке, выделяемом поджелудочной железой, в микроскопических грибах, бактериях, проросшем зерне пшеницы, ржи, ячменя. а-Амилаза - водорастворимый белок, обладающий свойствами глобулина, с молекулярной массой 45000-50000 Да. С повышением температуры культивирования продуцент синтезирует а-амилазу с меньшей молекулярной массой -порядка 14000-15000 Да. Все а-амилазы содержат от 1 до 30 грамм-атомов Са на моль, при полном удалении кальция из молекулы фермент полностью теряет способность гидролизовать субстрат. Видимо, кальций сшивает ответственные участки третичной структуры белка и тем самым способствует поддержанию молекулы белка в активном состоянии. а-Амилаза катализирует разрыв а-1,4-глюкозидных связей в крахмале и его , аналогах, в гликогене и родственных поли- и олигосахаридах, с образованием низкомолекулярных олигосахаридов и небольшого количества глюкозы и мальтозы. Гидролиз а-1,4-глюкозидных связей осуществляется а-амилазой у первого углеродного атома Сі кислородного мостика. При действии а-амилазы на крахмал наблюдается две фазы: декстринизация и осахаривание. Во время первой фазы крахмал расщепляется на декстрины с высокой молекулярной мас сой, в результате чего снижается вязкость клейстеризованного крахмала, уменьшается йодное комплексообразование. В фазе осахаривания увеличивается восстанавливающая способность гидролизатов, образовавшиеся декстрины расщепляются на тетра- и тримальтозы, которые в свою очередь гидролизуются до ди- и моносахаридов. а-Амилазы (1,4-а-0-глюкан глюкангидролазы) являются эндогидролаза-ми, которые разрушают 1,4-а-0-глюкозидные связи и могут пропускать, но не могут гидролизовать 1,6-а-0-глюкозидные точки разветвления. Коммерческие ферменты, используемые в промышленном гидролизе крахмала, продуцируются бактериями Bacillus amyloliquefaciens (поставляется различными производителями) и B.licheniformis («Термамил», поставляется Ново Индастри А/С). Они, в основном, отличаются по их устойчивости к высоким температурам, «Термамил» сохраняет больше активности при 110С в присутствии крахмала, чем а-амилаза B.licheniformis. Максимальное значение ДЭ, которое можно получить, используя а -амилазу, около 40, но пролонгированное время обработки приводит к образованию мальтулозы (4-а-В-глюкопиранозил-0-фруктоза), которая устойчива к гидролизу глюкоамилазой и а-амилазами. В большинстве промышленных процессов, где должйо проходить дальнейшее осахаривание, используются значения ДЭ 8-12. Необходимое условие к разжижению до такой степени -уменьшить вязкость клейстеризованного крахмала для облегчения дальнейших процессов. Промышленное применение имеют а-амилазы зерна и солода, микроскопических грибов и бактерий. сс-Амилазы различного происхождения значительно отличаются друг от друга по скорости гидролиза крахмала и гликогена, составу конечных продуктов ферментативного гидролиза и скорости осахаривания декстринов, по стабильности оптимальной температуры и величине рН. Но всех их объединяет способность неупорядоченно гидролизовать связи крахмала, проявляя наименьшее сродство к концевым связям, в результате чего резко снижается вязкость клейстера и образуется большое количество низкомолекулярных декстринов и при более глубоком гидролизе некоторыми амилазами микробного происхождения -немного мальтозы и глюкозы. Поэтому часто амилазы этого типа называют разжижающими.
Опредедление восстанавливающих Сахаров по методу Бертрана
Методы определения активности осахаривающих ферментов основаны на определении скорости ферментативной реакции превращения крахмала в редуцирующие сахара. В процессе этой реакции образуется целый комплекс редуцирующих углеводов, поэтому осахаривающую активность определяют в пересчете на какой либо один сахар, содержащийся в гидролизате в преобладающем количестве: мальтозу - при анализе солодов, глюкозу - при анализе препаратов, полученных с грибными продуцентами. В связи с этим допускается некоторая погрешность, так как присутствуют различные углеводы. Активность данных материалов будет определятся не только количеством образовавшегося сахара, по которому ведется пересчет, но и составом редуцирующих углеводов, который может меняться в зависимости от природы продуцента, способов и условий культивирования микроорганизмов и т.д. Для более объективной характеристики ферментных препаратов предлагается несколько методов определения их осахаривающей активности (йодометрический метод, поляриметрический метод, колориметрический метод с применением антрона, фотоколориметрический метод с применением пуллулана в присутствии глюкоамилазы и мальтазы). Метод основан на измерении скорости ферментативной реакции гидролиза растворимого крахмала, определяемый по общему количеству найденных химическим титриметрическим методом редуцирующих углеводов, которые образуются в процессе реакции.
Химический титриметрический метод основан на способности Сахаров, содержащих альдегидную группу, количественно окислятся в соответствующую кислоту под действием йода в щелочном растворе. Например, глюкоза окисляется в глюкуроновую кислоту. Для определения сахара к его раствору добавляют избыток раствора йода, проводят реакцию и определяют количество йода, пошедшего на окисление сахара. Это количество определяют по разности введенного в реакцию йода и непрореагировавшего. На реакцию окисления берут строго определенное количество 0,1 н раствора йода и тем самым узнают, сколько его было введено в реакцию. Количество не вступившего в реакцию йода определяют титриметрическим методом с тиосульфатом натрия. Реакция взаимодействия йода с тиосульфатом натрия идет по следующему уравнению:
К раствору, содержащему избыток йода, приливают 0,1 н раствор тиосульфата натрия. В конце реакции, когда раствор приобретает светло желтую окраску, вносят раствор крахмала, и титруемая среда окрашивается в ярко-синий цвет. Титрование продолжают до тех пор, пока весь йод не восстановится в йодид и раствор не обесцветится. Эта реакция очень чувствительная, с ее помощью можно точно найти содержание сахара в растворе.
Согласно приведенному выше уравнению на окисление одной молекулы глюкозы требуется два атома йода, поэтому 1 см3 ОД н раствора иода (или пропорциональный ему 1 см3 0,1 н раствора тиосульфата натрия) соответствует 9,008 мг глюкозы.
За единицу осахаривающей активности принято такое количество фермента, которое в строго определенных условиях за 1 мин. при 30С катализирует расщепление до восстанавливающих Сахаров 1 микроэквивалент глюкозидных связей. Осахаривающую активность (ОСх) выражают числом указанных единиц в 1 г ферментного препарата. Для определения осахаривающей активности проводят гидролиз 1%-ного раствора крахмала и с помощью йодометрического метода находят содержание образовавшихся Сахаров, по которому и рассчитывают ОСх.
Для обеспечения точности анализа правильно было бы определять активность в начальных узких границах гиролиза гликозидных связей (до5%), но это не удобно, особенно в заводских условиях, поэтому рекомендуется работать в более широких границах осахаривания крахмала до 25%-ного гидролиза гликозидных связей. На основании изучения скорости гидролиза крахмала составлена таблица 9, в которой Все скорости ферментативной реакции пересчитаны на начальную скорость. По этой таблице можно с удовлетворительной точностью определять осахаривающую активность ферментных материалов. Для ферментных препаратов, кинетика реакции которых не изучена, определение активности следует проводить в узких границах степени гидролиза (до 5%). Химический нодометрический метод рекомендуется для определения оеахаривающей активности технических и очищенных ферментных препаратов и культур, полученных с продуцентами плесневых грибов. В качестве субстрата используют 1%-ный раствор крахмала.
В коническую колбу на 50 см3 вводят пипеткой 20 см31%-ного раствора крахмала и помещают в ультратермостат или водяную баню с. температурой 30і0,2 С. Через минут в колбу добавляют в зависимости от активности исследуемого материала 1-10 см3 ферментного раствора и тщательно перемешивают. Общий объем реакционной смеси должен быть 30 см3. Если на определение берут меньше 10 см3 ферментного раствора, недостающий объем дополняют дистиллированной водой, которую вводят непосредственно перед добавлением ферментного раствора.
Реакционную смесь в ультратермостате выдерживают в течение 10 мин, после чего действие фермента приостанавливают добавлением 2 см3 1 н раствора соляной кислоты. В полученном гидролизате определяют содержание редуцирующих Сахаров. Для этого гидролизат из колбы количественно переносят с помощью дистиллированной воды в коническую . колбу на 300-400 см3, туда же добавляют пипеткой 10 см3 ОД н раствора йода и сразу же 30 см3 0,1 н раствора гидроксида натрия или калия, приливая по каплям при перемешивании. Затем накрывают колбу часовым стеклом и оставляют на 15 мин. в защищенном от света месте. По истечении срока к раствору добавляют 1 см3 раствора серной кислоты и титруют оставшийся после реакции с сахарами свободный йод 0,1 н раствором тиосульфата натрия в присутствии индикатора крахмала.
Скрининг микроорганизмов на их спсобность образовывать пуллуланазу
Как видно из хроматограммы, субстрат содержит мало глюкозы и низкомолекулярных олигосахаридов. Известно (Crabb W., 1997), что короткие крахмальные молекулы гидролизуїотся р-амилазой медленно и не полностью по сравнению с длинными; тетрасахара еще более резистентны к ее действию, трисахариды не расщепляются совсем. Ферментативный способ разжижения позволяет регулировать получение промежуточных продуктов гидролиза крахмала, т.е. в зависимости от продолжительности разжижения получать образцы субстрата с нужным значением ГЭ.
По истечении времени разжижения крахмальные суспензии осахаривали исследуемым препаратом Р-амилазы при температуре 45С в течение 3 и 24 ч, при рН среды 5,5 в количестве 1,5 ед/г крахмала. В настоящее время для осахаривания крахмала или крахмалсодержащего сырья при производстве сахаристых крахмалопродуктов с высоким содержанием мальтозы применяют ячменный солод, в комплекс ферментов которого входит р-амилаза. Поэтому в качестве контрольного был выбран вариант гидролиза крахмала ячменным солодом с амилолитической активностью 6,8 ед/г, который дозировали в виде солодовой вытяжки. Для ее приготовления сухой измельченный солод массой равной 20% от массы гидролизуемого крахмала смешивали с водой при температуре 30-40С в соотношении 1:3. Экстрагировали в течение 1 ч при постоянном перемешивании. Для выделения солодовой вытяжки суспензию центрифугировали. Осахаривание проводили добавлением в разжиженную массу солодовой вытяжки при рН 5,5 и температуре 55С. Пробы гидролизатов, отобранные в процессе осахаривания, нагревали в кипящей водяной бане в течение 10 мин для инактивации фермента и фильтровали, после чего определяли содержание мальтозы. Проведенные опыты по осахариванию разжиженного крахмала разными ферментными препаратами показали, что при использовании препарата 3-амилазы из B.subtilis степень осахаривания крахмала находится на уровне контрольного опыта, при этом содержание мальтозы в гидролизате менее 40%, глюкозы - более 10%. Применение Р-амилазы из B.polymyxa и ячменной Р-амилазы обеспечивает за 24 ч гидролиза получение наиболее высокомальтозного состава гидролизатов: ГЭ 47-48%, мальтоза 45-47%, глюкоза 5-7%. Следует отметить, что препарат ячменной р-амилазы импортный, что связано с определенными трудностями, т.к. в нашей стране этот препарат не производится. В качестве перспективного фермента при разработке технологии мальтозных продуктов выбран препарат бактериальной Р-амилазы из B.polymyxa. Содержание и состав гидролизатов различного крахмалсодержащего сы рья играет важную роль при осахаривании р-амилазой. Крахмалсодержащее сырье имеет сложный состав, а амилолитические препараты не свободны от примесей протеаз, липаз и трансглюкозидаз. Корме того, ферментативная сис тема самого зерна обладает амилолитической и протеолитической активностью. Под действием ферментов нерастворимые белки во время гидролиза превра щаются в растворимые и с трудом удаляются из гидролизатов, часть их с саха ром образует темно-окрашенные соединения, что осложняет очистку гидроли затов (Трегубов Н.Н. и др., 1981), а жир, который входит в состав сырья, под действием ферментов переходит в раствор и затрудняет фильтрацию гидроли- затов, а кроме того, оказывает ингибирующее действие на амилолитические / ферменты. С целью определения оптимальной концентрации субстрата при осахари-вании сырья р-амилазой (1,5 ер/г), суспензию крахмалсодержащего сырья разжижали термостабильной бактериальной а-амилазой (1,5 ед/г) в течение 2 ч при температуре 105С. Полученный продукт разделяли на образцы с одинаковым содержанием крахмала, в каждом, которые затем разбавляли водой до концентрации СВ 20-35% с интервалом приблизительно 5%. Осахаривание образцов проводили при рН 5,5, температуре 45С в течение 48 ч. На рис 44 показана кинетика накопления мальтозы в гидролизатах, в таблице 29 приведены основные показатели продукта после осахаривания при различных концентрациях субстрата. Как видно из представленных данных, лучшие результаты по углеводному составу патоки получены при концентрации всех видов крахмала 21-25%. Можно предположить, что субстрат оказывает защитное действие на фермент, предохраняя его от термической инактивации. Уменьшение содержания мальтозы в гидролизатах с повышенным содержанием субстрата до 35% может быть обусловлено субстратным ингибированием, механизм которого весьма разнообразен. Таким образом, оптимальной концентрацией субстрата следует считать 21-25%.
Следует заметить, что в осахаренных гидролизатах всех видов крахмала содержание мальтозы достигает 60-89%, тогда как литературные данные (Гу-люк Н.Г., 1980; Ладур Т.А., 1987) свидетельствуют о накоплении мальтозы в гидролизатах не выше 46,83%. По-видимому, использование нами препаратов при разжижении крахмала, который помимо а-амилазы, обладают и пуллула-назной активностью, способствовало повышению содержания мальтозы в гидролизатах.
