Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 10
1.1. Катаболизм гистидина у млекопитающих 10
1.2. Первый фермент пути дезаминировация гисти-дина-гистидазы 12
1.2.1. Регуляция активности гистидазы 16
1.3. Уроканиназа - второй фермент пути дезаминирования -гистидина 25
1.3.1. Свойства уроканиназы различного происхождения 26
1.3.2. Регуляция активности уроканиназы... 30
1.4. Уроканиновая кислота - продукт гистидазной реакции, ее свойства и биологическое действие 37
Глава 2. Материалы и методы исследования 50
2.1. Используемые вещества 50
2.2. Лабораторные животные 50
2.3. Методы изучения ферментативной активности 50
2.3.1. Определение активности гистидазы в печени 51
2.3.2. Определение активности гистидазы в коже 51
2.3.3. Определение активности уроканиназы в печени 53
2.3.4. Определение активности ферментов в коже и печени мышей с перевивными опухолями 55
2.4. Метод изучения цитотоксического действия биологически активных веществ на культуру клеток 56
2.4.1. Характеристика культуры клеток 56
2.4.2. Приготовление культур для опыта 57
2.4.3. Метод подсчета клеток в культуре 58
2.4.4. Определение уровня включения меченых предшественников синтеза нуклеиновых кислот и белка 58
2.5. Метод изучения противоопухолевого действия биологически активных веществ на перевивные опухоли 60
2.5.1. Методика постановки опыта на перевивных опухолях мышей 61
2.5.2. Способы оценки противоопухолевого действия вещества 62
2.6. Метод изучения влияния биологически активных веществ на дыхание митохондрий 63
2.6.1. Выделение митохондрий 63
2.6.2. Исследование митохондрий 64
2.6.3. Регистрация дыхания митохондрий 65
2.7. Метод изучения влияния биологически активных веществ на перекисное окисление липидов в тканях животных 68
Глава 3. Результаты исследований 70
3.1. Исследование активности гистидазы и урокани назы в печени и коже животных-опухоленосителей 70
3.1.1. Исследование активности гистидазы в коже мышей-опухоленосителей 70
3.1.2. Определение активности гистидазы и уроканиназы в печени мышей с перевивными опухолями 74
3.2. Влияние уроканиновой кислоты на рост перевивных опухолей мышей 76
3.2.1. Исследование влияния уроканиновой кислоты на клетки АОЭ in vitro 77
3.2.2. Определение токсичности уроканиновой кислоты 79
3.2.3. Влияние способа введения уроканиновой кислоты на рост перевивных опухолей 81
3.2.4. Влияние уроканиновой кислоты на перевивные опухоли различной локализации 82
3.2.5. Определение влияния уроканиновой кислоты на развитие опухолей АКА.ТОД, гепатома 22. Влияние продолжительности курса введения на эффективность действия уроканата 86
3.3. Исследование влияния уроканиновой кислоты на культуру опухолевых клеток 91
3.3.1. Исследование влияния уроканиновой кислоты на синтез нуклеиновых кислот и белка в культуре клеток caOv 92
3.3.2. Исследование влияния уроканиновой кислоты на прирост клеточной массы 94
3.4. Изучение влияния уроканиновой кислоты на энергетический метаболизм митохондрий 98
3.5. Изучение влияния уроканиновой кислоты на пере-кисное окисление липидов в печени мышей в норме и при экспериментальном канцерогенезе 113
Заключение 122
Выводы 135
Список литературы 137
- Первый фермент пути дезаминировация гисти-дина-гистидазы
- Уроканиновая кислота - продукт гистидазной реакции, ее свойства и биологическое действие
- Определение уровня включения меченых предшественников синтеза нуклеиновых кислот и белка
- Исследование активности гистидазы в коже мышей-опухоленосителей
Введение к работе
В онкологической практике большую роль в настоящее время играют химические вещества, ингибирующие пролиферацию клеток. Выделяют такие основные группы препаратов, как антиметаболиты (антагонисты фолиевой кислоты, аналоги пуринов и пиримидинов, антагонисты аминокислот и т.д.), антимитотические соединения (растительные яды - колхицин и его производные, подофиллин, алкалоиды барвинка и т.п.), алкилирующие соединения (азотистые иприты, ме-тансульфонатн, этиленимины и эпоксидные соединения), антибиотики (актиномипин Д, митомицин С и т.п.). Но, как известно, возможность введения этих веществ в достаточно больших, эффективных дозах ограничена из-за их побочного действия. Большинство цитоста-тиков - токсичные вещества, вызывающие гибель клеток (например, алкилирующие соединения). Их введение, особенно повторное, обычно приводит к возникновению выраженной перекрестной устойчивости.
Цитостатики - это лекарственные препараты, которые подавляют гликолиз, ингибируют синтез ДНК, уменьшают проницаемость клеточных мембран и слабо стимулируют тканевое дыхание; они алкили-руют молекулы клетки, образуют сшивки между ними, модифицируют аминокислоты и т.д. Действие питостатиков основано на том, что малодифференцированные опухолевые клетки более чувствительны к их действию в низких концентрациях, чем нормальные дифференцированные клетки, то есть избирательность питостатиков определяется степенью дифференциации клеток. Другой тип избирательности заключается в том, что данное соединение действует на определенную фазу клеточного цикла (метотрексат, цитозинарабинозид). Кроме то-
го, цитостатики могут проявлять довольно высокую избирательность по отношению к типу клеток (лимфотропные соединения-дегранол, эндоксан, ТЭФА; миелотропные - милеран, миелобром). Иной избирательности к типу клеток экзогенные ингибиторы не проявляют. Из-за неспецифических токсических свойств цитостатики неизбежно обладают побочным действием. Их применение приводит к нарушению эрит-ропоэза, пролиферации здоровых тканей, инфекциям, геморрагии и, на заключительной стадии - общей миелопатии. Таким образом, поиск новых веществ, обладающих высокоспещфическим цитотоксическим действием на злокачественные клетки наряду с низкой токсичностью и минимальными побочными эффектами, остается важной и актуальной проблемой. Устранить побочные эффекты при лечении экзогенными цитостатиками очень трудно. Эти факты стимулировали поиски принципиально новых подходов и методов. В этом плане большой интерес представляет использование естественных метаболитов, обладающих способностью влиять на пролиферацию клеток.
Среди лекарственных препаратов, используемых в настоящее время в химиотерапии опухолей, уже имеется группа веществ эндогенного происхождения - стероидные гормоны, подавляющие митоз, которые используются при лечении гормонзависимых опухолей. Как неспецифические ингибиторы пролиферации можно рассматривать циклический ЖФ и все физиологические факторы, повышающие внутриклеточную концентрацию цАМФ. Кислые полисахариды, подобные гепарину, задерживают рост тканей, так как влияют на метаболизм двухвалентных катионов. Моноамины, образующиеся из тирозина и фенилаланина, содержащие фенольную группу и взаимодействующие с р -рецепторами (адреналин), тоже являются ингибиторами клеточного цикла, не
обладающими видовой и тканевой специфичностью. В этой роли могут выступать и некоторые ферменты (аспарагиназа, фенилаланин-амми-ак-лиаза, аргиназа) /4/.
Уроканиновая кислота является метаболитом гистидина, образующимся при катаболизме последнего по пути внутримолекулярного дез-аминирования. Она вырабатывается в печени и коже млекопитающих и способна выполнять ряд важных и довольно своеобразных функций. Как известно, в коже процесс катаболизма гистидина останавливается на стадии образования уроканиновой кислоты вследствие отсутствия фермента уроканиназн, обеспечивающей дальнейшее ее превращение. Накапливаясь в коже, она защищает эпидермис от эритемоген-ного действия солнечных лучей, поглощая ультрафиолетовые лучи и подвергаясь цис-транс-изомернзации. Установлено, что уроканиновая кислота обладает противогистаминным действием, выполняя функцию антагониста гистамина в коже и оказывая противовоспалительное действие.
Уроканиновая кислота появляется в больших количествах в эпидермисе вскоре после рождения, что совпадает с максимальной гиперплазией эпидермиса. Значительное снижение (вплоть до полного исчезновения) содержания уроканиновой кислоты отмечается при заболеваниях с нарушенной клеточной дифференциацией и пролиферацией (псориаз, склеродермия, злокачественные опухоли).
Представляло интерес проверить, не существует ли обратной связи между этими явлениями, то есть не способна ли уроканиновая кислота оказывать влияние на процессы дифференцировки и пролиферации, на процесс опухолевого роста. О том, что уроканиновая кислота может обладать подобным свойством говорит и обнаруженная
недавно питотоксическая активность 2-фторуроканата, одного из производных уроканиновой кислоты, способного подавлять синтез белков и тормозить развитие лейкоза у мышей.
Известно, что независимо от гистогенеза, степени анаплазии и скорости роста опухолей клеток животных и человека в процессе малигнизации наблюдается потеря активности ряда ключевых ферментов обмена аминокислот, в том числе гистидазы и уроканиназы -ферментов обмена гистидина. Однако полностью механизмы этих явлений не выяснены. Исследование изменений синтеза и активности ферментов катаболизма гистидина при опухолевых процессах также имеет несомненную актуальность.
Цель настоящего исследования заключалась в исследовании биологического действия уроканиновой кислоты, определении ее влияния на рост опухолевых клеток in vitro, а также на процессы канцерогенеза у экспериментальных животных. В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи исследования:
Исследовать активность гистидазы и уроканиназы в печени и гистидазы в коже мышей с перевивными опухолями.
Определить действие уроканиновой кислоты на опухолевые клетки in vitro, развитие экспериментальных опухолей и продолжительность жизни мышей-опухоленосителей.
Исследовать влияние уроканиновой кислоты на рост культуры опухолевых и нетрансформированных клеток, биосинтез белка и нуклеиновых кислот.
Изучить действие уроканиновой кислоты на энергетический метаболизм митохондрий.
Изучить влияние уроканиновой кислоты на интенсивность пе-рекисного окисления дипидов в печени мышей в норме и при экспе-
риментальном канцерогенезе.
Исследование биологической роли уроканиновой кислоты, а также изучение регуляции ферментов катаболизма гистидина в злокачественных опухолях и в органах и тканях опухоленосителеи представляет большой интерес в научно-теоретическом и практическом аспектах. Решение подобных задач необходимо для выяснения патогенеза пара-неопластических синдромов, разработки методов ранней диагностики злокачественных заболеваний, новых способов терапии и коррекции нарушений обмена веществ онкологических больных.
Первый фермент пути дезаминировация гисти-дина-гистидазы
У эмбрионов крыс активность фермента в печени не выявлена, она появляется за сутки до рождения или сразу же после него и повышается до полового созревания одинаково, независимо от пола животного. В процессе полового созревания активность гистидазы быстрее увеличивается у самок /249/. У взрослых животных это различие составляет 50$, а у людей достигает еще больших величин: так, у женщин активность гистидазы в 3 раза превышает активность ее в печени мужчин /85, 129, 89, 210, 249/. Низкая активность гистидазы в период интенсивного роста, вероятно, связана с быстрой утилизацией гистидина при синтезе белка в печени. По мере замедления синтетических процессов возникает необходимость в удалении неиспользованного избытка 1 -гистидина. В связи с этим половые различия в уровне активности можно объяснить более интенсивным ростом самцов /85/.
Активность гистидазы кожи у эмбрионов крыс также не выявлена, но после рождения появляется и резко возрастает, достигая максимума к 5 дню постнатального развития, затем наблюдается снижение активности до величин, отмечаемых у взрослых животных. Содержание уроканиновой кислоты в коже изменяется параллельно активности гистидазы /89/. У детей активность гистидазы кожи увеличивается до 6 лет, затем снижается и к 14-летнему возрасту достигает уровня взрослых людей. Причем в коже женщин она также выше, чем у мужчин /289/.
Активность гистидазы печени зависит от уровня эстрогенных гормонов. Так, Feigelson показал, что при удалении яичников активность гистидазы у женщин равна уровню ее у мужчин /129, 131, 132, 133/. Введение 17-р-эстрадиода в 2-5 раз повышает активность гистидазы в печени овариоэктомированных крыс. Очевидно, увеличение активности гистидазы под влиянием эстрогенов объясняется стимуляцией синтеза фермента de novo /129/. У гипофизэктомиро-ванных крыс после овариоэктомии активность гистидазы сильно возрастает, введение таким крысам 17- -эстрадиола не вызывало дальнейшего увеличения активности фермента. Это позволяет заключить, что действие эстрадиола опосредовано через гипофиз /ІЗІД
Гидрокортизон через 7 дней после адреналэктомии увеличивал активность гистидазы печени у крыс обоего пола до двухмесячного возраста, а в дальнейшем подобного эффекта не оказывал /253/. И наоборот, согласно данным f eigeison /132/, после 7 недель жизни наблюдается снижение активности гистидазы при введении гидрокортизона на фоне адреналэктомии.
Эффективным стимулятором активности гистидазы печени крыс во все поетнаталыше периоды является глюкагон /132/. Теофиллин и циклический дибутирил З б -іШФ повышают активность гистидазы в 1,5 раза при введении трехдневным новорожденным крысятам в течение 8 дней. При совместном введении они вызывают аддитивную стимуляцию. Актиномицин Д, циклогексимид, этионин при введении их на фоне глюкагона, препятствуют индукции гистидазы глюкагоном /132/. Это позволило предположить, что глюкагон, вызывая увеличение циклического 3 5 -АМФ в печени, стимулирует приток в гепато-циты аминокислот, которые индуцируют синтез гистидазы le novo» Однако действие глюкагона и других стимуляторов аденилатциклаз-ной системы непродолжительно, что, возможно, компенсируется коротким периодом полураспада фермента. Lee, Harper /197/ показали, что активность гистидазы увеличивается в 3 раза в печени крыс, содержащихся на 12% казеиновой диете, которым подкожно в течение 10 дней вводили глюкагон. Глюкагон и кортизол вызывали аддитивную стимуляцию активности гистидазы. Но in vitro при совместном действии глюкагон, циклический дибутирил з б -АМФ и кортизол не увеличивали активность гистидазы. Этот факт позволил авторам заключить, что увеличение активности in vivo вызвано увеличением синтеза фермента de novo, а не его активацией.
Тироксин вызывает снижение активности гистидазы, так, у ти-реоидэктомированных крыс активность гистидазы выше, чем у контрольных животных /223, 226, 227/. Согласно мнению Eeigeison, слабым репрессором гистидазы является тестостерон /130/. В ранний лостнатальный период развития самцов (3-8 недель) обработка тестостероном не влияет на активность гистидазы; у взрослых животных орхиоэктомия слегка повышает ее активность, а последующая инъекция тестостерона вызывает небольшое снижение активности фермента. АКТГ и гормон роста также понижают активность гистидазы. При удалении гипофиза у 30-дневных самцов крыс активность фермента повышалась в 2 раза по сравнению с контрольными животными /130, 133/. Feigeison /133, 194/ обобщил имеющиеся сведения в единую схему гормональной регуляции гистидазы печени (схема 2).
Уроканиновая кислота - продукт гистидазной реакции, ее свойства и биологическое действие
Уроканиновая кислота - имидазолил-4/5/-акриловая кислота -образуется при дезаминировании і -гистидина гистидазой печени и кожи. Названа была уроканиновой в связи с тем, что впервые была выделена из мочи собак ( игоп - моча, canina - собачий) /151/. В последующем была обнаружена в моче, крови, поте, коже и печени млекопитающих /102/. Уроканиновая кислота вырабатывается в цитоплазме гепатопитов и клеток гранулярного слоя эпидермиса /82, 202, 256, 247, 270/. При образовании в печени она подвергается дальнейшему превращению через ряд промежуточных этапов в глутаминовую кислоту. При этом происходит образование одноуглерод-ных фрагментов, которые присоединяются к тетрагидрофолиевой кислоте и идут на образование пуринових нуклеотидов. В коже вследствие отсутствия фермента уроканиназы, расщепляющего уроканиновую кислоту, она накапливается в эпидермисе и на поверхности. Уроканиновая кислота эпидермиса была обнаружена исследованиями тиЪасЬг-nic J., Anglin J.H., Baden Н.Р. И других ученых /83, 88,147, 148, 149, 281/. Этими работами показано, что она входит в состав пота человека, очевидно, вымываясь из гранулярного слоя клеток эпидермиса /105, 150, 219, 257, 291/.
В дальнейшем Brusilow s.w. et.al,/I04/ установил, что пот, взятый непосредственно из потовой железы, содержит почти в 7 раз меньше уроканиновой кислоты, чем пот, собранный с поверхности кожи. Таким образом, уроканиновая кислота не является истинным компонентом пота человека как предполагалось ранее, а элюи-руется им из эпидермиса кожи.
Уроканиновая кислота представляет собой белый мелкокристаллический порошок с М = 138 и температурой плавления 225С. Уроканиновая кислота гигроскопична и легко образует кристаллогидраты, присоединяя 2 молекулы воды. Дигидраты уроканиновой кислоты растворяются в воде при І00С в количестве 6 г на 100 мл и при 0С _ 0,1 г на 100 мл. Гидрохлорид и натриевая соль уроканиновой кислоты хорошо растворимы. Водные растворы уроканиновой кислоты с рН = 7,4 имеют максимум поглощения при 277 нМ, молярный коэффициент экстинкции е. = 1,86x10 см""1 М"1 /208/.
В 1953 году ШаЪог Н. и Mehler А.Н. разработали спектро-фотометрический метод определения уроканиновои кислоты /216/. Наличие двойной связи и имидазольного ядра в молекуле уроканиновои кислоты делает ее полярографически активным соединением в отличие от гистидина, что позволило предложить полярографический метод определения уроканиновои кислоты в растворах /190/ и в поте /193/. Полярографическому определению уроканиновои кислоты в сыворотке крови, моче и других биологических жидкостях мешают белки и другие сопутствующие вещества. Соответствующие методы очистки ее пока не разработаны. Уроканиновая кислота является хорошим комплексообразователем и способна образовывать окрашенные комплексы со многими ионами. Цветные реакции комплексообразова-ния лежат в основе ее фотометрического определения.
Для получения уроканиновои кислоты используются методы химического, энзиматического и микробиологического синтеза. Первый метод химического синтеза уроканиновои кислоты был разработан в 1942 году шгЬаспег S. и Bidder Н. /122/. Энзиматический метод получения уроканиновои кислоты из гистидина, основанный на применении гистидазы печени, был описан в 1941 году OJakeuchi м. /279/. Уроканиновая кислота продуцируется из гистидина целым рядом штаммов микроорганизмов, дефектных по уроканиназе, но вырабатывающих гистидазу. Так, описывается микробиологический синтез уроканиновои кислоты мутантами Pseudomonas fluorescens /172,217/, /172, 217/, Achromobacter Liguidum /209/, 0erratia marcescens /181/ и других /263/.
Наличие в молекуле уроканиновои кислоты двойной связи обуславливает ее способность к транс-цис-изомеризации, которая имеет большое биологическое значение. Как известно, содержание уроканиновой кислоты в поверхностных слоях кожи регулируется гастида-зой, активно дезаминиругащей в эпидермисе 1 -гистидин в транс-уроканиновую кислоту. За счет сопряженных двойных связей она способна поглощать часть ультрафиолетовых лучей, попадающих на поверхность кожи при инсоляции, превращаясь при этом в метаболически неактивную цисуроканиновую кислоту.
Обе формы уроканиновой кислоты обнаружены в эпидермисе и постоянно выделяются с потом и отторгающимся эпидермисом. Транс-вдс-изо-меризапия уроканиновой кислоты является физиологическим механизмом защиты более глубоких слоев кожи от эритемогенного действия солнечных лучей /83, 104, 147, 148, 150, 219, 257, 291/.
После ультрафиолетового облучения содержание уроканиновой кислоты н активность гистидазы в эпидермисе возрастают. Активность гистидазы возрастает уже через 2 часа после облучения и достигает максимума к 24 часам. Через 72 часа активность энзима снижается до нормы /292/. Облучение солнечными лучами кожи руки человека приводило к увеличению содержания в эпидермисе уроканиновой кислоты, начиная с I дня после облучения /88, 291, 292/. Свойство уро-каната поглощать УФ-лучи позволило использовать его для защиты кожи от эритемогенного действия солючных лучей в составе различных мазей в дерматологической и косметической практике /291/.
Работы по изучению активности гистидазы при зудящих дерматозах позволяют предположить и другую роль уроканиновой кислоты -роль физиологического антагониста гистамина в коже. Мардашевым СР. с соавторами /42/ было показано, что у больных псориазом, нейродермитом и другими дерматозами на высоте заболевания в коже наблюдается значительное уменьшение активности гистидазы по сравнению с нормой. Уменьшение активности фермента наиболее выражено в коже больных нейродермитом и коррелирует со степенью зуда. Уроканиновая кислота при физиологических концентрациях (около 10"%) способна конкурентно ингибировать фермент гистидиндекарбоксилазу, синтезирующую гистамин /42, 211/.
Определение уровня включения меченых предшественников синтеза нуклеиновых кислот и белка
Для снятия со стекла слой клеток ополаскивали раствором Версена, отслоившиеся клетки смывали со стекла раствором питательной среды, суспендировали и подсчитывали их количество в I мл на счетчике «coulter Counter" ( Франция). Полученную суспензию клеток разводили питательной ере-дой, доводя содержание клеток в I мл до 75-100x10 . Для эксперимента клетки CaDv рассевали в стеклянные флаконы из-под антибиотиков с диаметром дна 2 см и выращивали в течение 24 часов при 37С в стандартных условиях. Объем каждой пробы составлял 2 мл. В суточных культурах исходную стандартную питательную среду заменяли на среду Игла (с 10$ содержанием сыворотки крупного рогатого скота), содержащую уроканиновую кислоту в определенной концентрации в первоначальном объеме. Время экспозиции с препаратом составляло 24 или 48 часов. В каждой серии экспериментов ставили контрольный опыт с препаратом-свидетелем. В качестве последнего использовали 6-меркаптопурин в концентрации 10 мкг/мл, тормозящий эффект которого на включение клетками предшественников составлял не менее 80$. В опытную группу брали 3-5 культур, число контрольных культур, росших в стандартных условиях без воздействия препаратов в одной серии опытов зависело от числа опытных и обычно составляло 6-9.
Метод подсчета клеток в КУЛЬТУРЄ. ДЛЯ оценки характера и степени повреадающего действия исследуемого препарата важен вы бор критерия оценки цитотоксического эффекта. Наиболее простым способом оценки является подсчет общего количества клеток в куль туре после воздействия исследуемого препарата в сравнении с конт рольными культурами. Время экспозиции с препаратом в этом случае составляло 48-72 часа, учитывая продолжительность клеточного цик ла. Клетки ополаскивали раствором Версена, оставшиеся капли раствора промокали фильтровальной бумагой и заливали во флаконы по I мл раствора Версена. Пробы оставляли на 10-15 минут при 37С, затем резко встряхивали, снимая клетки со стекла, до образования клеточной суспензии. Количество клеток в I мл подсчитывали на счетчике "Coulter Counter" (Франция). Определение УРОВНЯ включения меченых прешпественников синтеза нуклеиновых кислот и белка. Большое распространение при оценке цитотоксического действия биологически активных веществ в культуре тканей получил метод радиометрической индикации питотоксического эффекта, основанный на изменении вклинения клетками несущих радиоактивную метку предшественников биосинтеза нуклеиновых кислот или белка под влиянием исследуемого препарата /23/. Меченые предшественники добавляли за час до окончания инкубации культур с препаратом в 0,1 мл в концентрации I мкКи/мл. В качестве предшественников синтеза нуклеиновых кислот использовали меченые тритием тимидин (3НТ) - предшественник синтеза ДНК, уридин (3НУ) - предшественник синтеза РНК и лизин (3НЛ) -предшественник синтеза белка. В работе использовались препараты отечественного производства с удельной активностью 15 Ки/мМ (тимидин), 19 Ки/иМ (уридин), 25 Ки/мМ (лизин). После окончания экспозиции с препаратом культуры охлаждали до 0С, питательную среду сливали и слой клеток двадцы промывали охлажденным раствором Хенкса, затем однократно ополаскивали охлажденным 2,5% раствором хлорной кислоты и просушивали пробы, перевернув флаконы на фильтровальную бумагу и оставив на непродолжительное время для отекания остатков раствора хлорной кислоты. Гидролиз и экстракцию нуклеотидов производили 5 мл Ъ% хлорной кислоты при 80С в течение 20 минут. Гидролиз белка производили 0,5 мл I н. раствора едкого натра при 37С в течение 18-20 часов. После экстрагирования пробы охлаждали и полученный экстракт использовали для определения уровня радиоактивности. Измерение активности производили на жидкостном сцинтилляпионном счетчике "Еуклеар Чикаго", модель Марк П в диоксановой спинтилляционной жидкости 2Ю-8. 0,5 мл клеточного экстракта переносили в 9 мл спинтилляционной жидкости, полученный раствор нейтрализовали водным раствором аммиака (около ОД мл). Уровень радиоактивности образцов измеряли в импульсах за одну минуту (имп/мин) по 3 каналам, регистрирующим излучение различного энергетического уровня. При обработке результатов учитывали фоновую радиоактивность стеклянных контейнеров для измерения активности в 9 мл сщ.нтилляционной жидкости. В каждом опыте вычисляли отношения в процентах среднего показателя для каждой опытной грушш к контролю. Затем на основании полученных величин путем пробит анализа кривых зависимости эффекта от дозы графически определяли величину СЕ50 (50$ клеточный эффект, т.е. концентрацию препарата, при которой исследуемые показатели снижаются наполовину) /2/). Вещество расценивается обычно как биологически активное, если по одному из расценочных критериев CEgQ не превышает 100 мкг/мл. Результаты проведенных серий экспериментов обрабатывали статистически общепринятым способом. Оценку достоверности различий сравниваемых величин производили на основании критерия Стью-дента. При р 0,05 разницу величин рассматривали как достоверную при р 0,05 - как несущественную.
Исследование активности гистидазы в коже мышей-опухоленосителей
Представляло интерес изучение механизма обнаруженного действия уроканиновой кислоты. В свете имеющихся данных можно было предположить наличие как первичного действия уроканиновой кислоты на опухолевые клетки, так и вторичного, опосредованного через определенные системы организма.
В связи с предполагаемым действием уроканиновой кислоты непосредственно на опухолевые клетки, представляло интерес исследовать ее биологическую активность вне организма в культуре клеток. С этой целью мы провели исследование биологического действия уроканиновой кислоты на клеточные тест-системы. Исследования проводили на стандартных монослойных культурах опухолевых клеток линии QsDvt полученной из карциномы яичника человека и клеточной линии СаРа, полученной из карциномы поджелудочной железы, а также на культуре нормальных клеток Vero, полученной из почки зеленой мартышки.
Известно, что опухолевые ткани не содержат уроканиназу, ответственную за распад уроканиновой кислоты. Проведенная нами экспериментальная проверка показала, что в исследуемых культурах активность уроканиназы не определяется и, следовательно, нет условий для распада уроканата. В связи с этим диапазон концентраций уроканиновой кислоты, исследовавшийся в опытах на культуре ткани, был ниже доз, применявшихся в экспериментах in vivo . Согласно методике данной системы первичного скрининга противоопухолевых препаратов, уроканиновая кислота применялась в концентрациях 10-200 мкг/мл, что соизмеримо с концентрациями 1x10 - IxIO М.
Исследование влияния уроканиновой кислоты на синтез нуклеиновых кислот и белка в культуре клеток р.ппчг В представленной серии опытов было исследовано влияние уроканиновой кислоты на процессы синтеза белка, ДНР и РНК. Характеристикой синтетических процессов служила величина включения меченых Н-предшественников синтеза белка и нуклеиновых кислот.
Полученные данные, представленные в таблице II, свидетельствуют о том, что уроканиновая кислота не оказывает существенного влияния на включение в клетки CaOv %-тимидина. Так, величина включения в присутствии препарата во всех испытываемых концентрациях составила 83-106$ и не имела достоверного отличия от контроля. Увеличение времени экспозиции с препаратом до 48 часов также не вызвало достоверного изменения включения %-предшественника. Таким образом, на синтез ДНК клетками культуры CaOv уроканиновая кислота действия не оказала.
Эксперименты по изучению влияния препарата на суммарный синтез РЖ показали, что под действием уроканиновой кислоты в концентрации 100-200 мкг/мл наблюдается снижение включения предшественника до 63-65$. Увеличение срока экспозиции до 48 часов вызвало незначительное усиление действия препарата. Так, величины включения Н-уридина в пробах с содержанием уроканиновой кислоты 200-100 мкг/мл составили 54т-59$ (р 0,05). Эти данные позволили прийти к выводу, что уроканиновая кислота вызывает подавление синтеза РНК в культуре GaQv.
Эксперименты по определению влияния препарата на включение в белок клеток CaOv Н-лизина показали, что через 24 часа после введения уроканата отмечается снижение включения меченой аминокислоты. Так, при дозе уроканиновой кислоты 100 мкг/мл величина включения составила 72$, при дозе 200 мкг/мл - 62$. После 48 часов инкубации с препаратом величины включения %-лизина составили для доз 200 и 100 мкг/мл 28$ и 48$ соответственно (р 0,05), что свидетельствует о подавлении синтеза белка в клетках под влиянием уроканиновой кислоты. Величина CE Q, определенная графически по анализируемым данным путем пробит-анализа кривой зависимости эффекта от дозы, составила около 100 мкг/мл.
На рисунке 8 представлено графическое изображение зависимости торможения включения %-предшественников в культуру клеток от дозы уроканиновой кислоты. Величину торможения в процентах определяли как разность между величинами включения в контрольные (100$) и опытные пробы.
Исследование влияния уроканиновой кислоты на ПРИРОСТ клеточной массы. В работе было проведено изучение действия уроканиновой кислоты на динамику увеличения клеточной массы опухолевых культур caOv, СаРа и стабильной культуры Vero - клетки почек зеленых мартышек (культура получена из лаборатории химиотерапии Института вирусологии им. Д.И. Ивановского АМН СССР). В связи с тем, что количество клеток в пробе является не таким лабильным показателем, как включение меченых предшественников синтеза, определение прироста клеток производилось после 48-и 72-часовой инкубации с уроканатом в культурах CaOv и СаРа, имеющих одинаковую динамику роста. В культуре Vero, динамика роста и коэффициент прикреления к стеклу которой сильно отличаются от культур GeDv и СаРа /77,78/, число клеток определялось еще и через 120 часов после введения препарата (в конце лог-фазы). Подсчет клеток производили на счетчике Coulter Counter (Франция).
