Введение к работе
Актуальность проблемы
Митохондрии имеют собственный геном и собственный трансляционный аппарат. Однако, большая часть митохондриальных белков закодированы в ядерном геноме, синтезируются в цитоплазме и транспортируются в митохондрии. Сравнительно недавно был открыт также импорт нуклеиновых кислот в митохондрии. Импорт тРНК был показан для дрожжей, простейших и растений. В митохондрии млекопитающих импортируются другие виды РНК, которые входят в состав РНКазыР и митохондриальной сайт-специфической эндорибонуклеазы (MRP), а также 5S рРНК. Количество транспортируемых видов тРНК колеблется у различных организмов. "У дрожжей импортируется только одна тРНК, а у грилаиосоштид все тРНК закодированы в ядре. Несмотря на растущее количество примеров импорта РНК, очень мало известно о том, каким образом нуклеиновые кислоты импортируются в митохондрии.
Недавние исследования показали, что в самой последовательности тРНК могут быть элементы, определяющие специфичность импорта молекул. Подобные элементы обнаружены в антикодоне тРНКс|" Tetrahymena pyriformis и в D-петле тРНК11" Leishmania tarentolae.
В нашей лаборатории изучаются механизмы импорта тРНК на примере лизиновой тРНК дрожжей. В клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae только одна лизиновая тРНК с антикодряом CUU (тРНКІ) импортируется в митохондрии. Другая лизиновая тРНК с антикодоном UUU (тРНК2) присутствует исключительно в цитоплазме. Хотя существуют некоторые структурные различия тРНКІ и тРНК2, обе они аминоацилируются одной и той же цитоплазматическои лизил-тРНК-синтетазой, KRS. В процессе импорта принимает участие предшественник митохондриальной лизил-тРНК-синтетазы, npe-MSK [Tarassov et al., 1995]. Ранее в нашей лаборатории было показано, что нуклеотид в 34 положении антикодона является одним из элементов, определяющих специфичность импорта [Entelis et al., 1998].
Данная работа продолжает тему изучения и поиска элементов в структуре РНК, обеспечивающих ее избирательный импорт в митохондрии. Изучение
2 механизмов импорта нуклеиновых кислот является одной из актуальных проблем
современной биологии. Известно, что некоторые болезни человека связаны с
мутациями в митохондриальных тРНК. Понимание процесса импорта тРНК
поможет решению проблемы транспортировки генного материала непосредственно
в митохондрии.
Цель и задачи исследования
Цель данной работы - идентификация элементов в структуре импортируемой лизиновой тРНК дрожжей, определяющих ее избирательный импорт в митохондрии. В ходе исследования решались следующие задачи:
-
Поиск нуклеотидов в аминоакцепторной части молекулы лизиновой тРНК, которые определяют избирательный импорт тРНК в условиях ш vitro.
-
Введение предположительных детерминант импорта в последовательность изоакцепторной ненмпортируемой цигопяазматической лизиновой тРНК2 и исследование импорта гибридных молекул in vivo.
-
Выявление нуклеотидов или нуклеотидных последовательностей в центральной части молекулы лизиновой РНК, определяющих высокое сродство к одному из факторов импорта, предшественнику мигохондриальной лизил-тРНК-синтетазы (npe-MSK), и способствующих импорту в изолированные митохондрии с использованием метода SELEX (The Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment).
-
Анализ отобранных в ходе SELEXa последовательностей РНК, способных эффективно импортироваться в митохондрии.
Научная новизна и практическая ценность работы:
В настоящей работе впервые были выявлены нуклеотиды в аминоакцепторной части лизиновой РНК, определяющие избирательный импорт в митохондрии дрожжей. Используя экспериментальные подходы импорта гибридных молекул in vitro и in vivo, было показано, что первая пара в аминоакцепторном стебле G1-C72 и нуклеотид-дискриминатор U73 являются элементами, важными для селективного импорта тРНКІ.
Был применен новый метод исследования SELEX для отбора молекул РНК, эффективно импортирующихся в изолированные митохондрии. Была проведена
з также селекция по связыванию с одним из основных факторов импорта,
предшественником митоховдриальной лизил-тРНК-синтетазы, npe-MSK.
После нескольких раундов селекции вырожденной библиотеки РНК по импорту в изолированные митохондрии, были отобраны варианты, обладающие способностью импортироваться в изолированные митохондрии более эффективно, чем лизюговая тРНКІ. Анализ последовательностей этих РНК показал наличие консервативного района с 10 по 23 нуклеотид. Селекция в районе антикодона, V-летли и Т-ветви отсутствовала. Для нескольких молекул, обладающих способностью к высокоэффективному импорту, предложены вторичные структуры.
Результаты работы позволяют приблизиться к пониманию механизмов импорта нуклеиновых кислот. Полученные в ходе селекции последовательности РНК, способные к высокоэффективному импорту, могут быть использованы для разработки искусственной системы импорта РНК в митохондрии.
Апробация работы
Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры молекулярной биологии и кафедры биохимии Московского Государственного Университета 24 мая 2000 года.
Материалы исследований, представленных в работе докладывались на международных конференциях "The First Annual Meeting of the RNA Society" (США, 1996), "The Third Annual Meeting of the RNA Society' (США,1998) " The Fifth Annual Meeting of the RNA Society" (США, 2000) и "Ломоносов-98" (Москва, 1998).
Публикации: По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.
Структура и объем работы:
![Особенности выявления, клиники и лечения заболеваний глаз у больных туберкулезом и саркоидозом органов дыхания [Электронный ресурс]](/i/i/4264/175992.png "Особенности выявления, клиники и лечения заболеваний глаз у больных туберкулезом и саркоидозом органов дыхания [Электронный ресурс] Попова Светлана Геннадьевна")
